Опухоли являются одной из основных причин заболеваемости и смертности в мире [1]. Канцерогенез — многоступенчатый процесс, сопровождающийся формированием особого клеточного микроокружения, необходимого для роста опухоли. Взаимодействия опухолевых клеток с их микроокружением играют важную роль в миграции и инвазии опухолевых клеток, активации ангиогенеза и метастазировании [2]. Новые данные свидетельствуют о том, что опухолевые клетки создают или «притягиваются» к особенному микроокружению, которое сильно отличается от нормальных тканей [3], поэтому детальное понимание механизмов взаимодействия клеток опухоли и ее микроокружения открывает широкие перспективы для диагностики и лечения [2].

Цель исследования — определить связь между иммуногистохимическими особенностями опухолевых клеток и их клеточным микроокружением при разных степенях дифференцировки плоскоклеточного рака языка.

Изучали материал 59 наблюдений плоскоклеточного рака языка без предшествующей противоопухолевой терапии, полученный из радиологического отделения Медицинского радиологического научного центра им. А.Ф. Цыба в период с 1990 по 2017 г. Возраст пациентов составил от 33 до 88 лет (средний 57,5±10 года). Материал 40 (68%) наблюдений принадлежал лицам мужского пола и 19 (32%) женского. Средняя продолжительность заболевания составила 5 мес. В 41 (70%) наблюдении материал был биопсийный, а в 18 (30%) — операционный. В 7 (12%) наблюдениях опухоль располагалась в области корня языка, в 52 (88%) — в области тела языка. В соответствии с критериями классификации ВОЗ [4] наблюдения были разделены на высокодифференцированные (G1), умеренно-дифференцированные (G2) и низкодифференцированные (G3) плоскоклеточные раки. Согласно TNM-классификации [5], учитывая размер опухоли, наблюдения соответствовали T1, T2, T3, T4.

Операционно-биопсийный материал фиксировали и подвергли гистологической проводке согласно общепринятым методикам. С помощью иммуногистохимического метода в клетках опухоли провели оценку экспрессии белка-онкосупрессора p53, (клон DO-7, RTU, «Dako», разведение 1:50), маркеров пролиферативной активности Ki-67 (клон MIB-1, RTU, «Dako», разведение 1:100), Cyclin D1 (клон AM29, «Zymed Laboratories», разведение 1:50); маркера апоптоза BCL-2 (клон 124, разведение 1:100), а также MMP-9 («Diagnostic BioSystems», разведение 1:40), фактора супрессии белка метастазирования CD 82/KAI1 (клон EP 160, «Epitomics», разведение 1:200). В стромальном микроокружении опухоли проводили количественную оценку NK-клеток (CD57, клон NK-1, Novocastra, разведение 1:50), В-лимфоцитов (CD20, клон L26, «Dako», разведение 1:200); плазматических клеток (CD138, клон MI 15, «Dako», готовые к применению антитела), CD8 (1:50, клон С8/144 В, «Dako»), CD68 (1:50, клон KP1, «Dako»), стромальных клеток с экспрессией MMP-9 («Diagnostic BioSystems», разведение 1:40) и CD 82/KAI1 (клон EP 160, «Epitomics», разведение 1:200).

Для оценки опухолевых клеток и клеток стромы выбирали участки с самой высокой в количественном отношении экспрессией (горячие точки) [6]. Количественную оценку экспрессии белков опухолевыми клетками и оценку клеток стромы проводили с помощью программы Image J 1.4.3.67. После исследования трех полей зрения вычисляли медиану по исследуемому показателю, которую и использовали в расчете.

Статистическую обработку данных осуществляли с помощью пакета Microsoft Excel 2007 и программы SPSS 11.5 для Windows. Оценку согласия распределения морфометрических показателей с нормальным законом проводили, используя критерий Шапиро—Уилка. Поскольку анализируемые выборки были распределены ненормально, то для определения силы и направления корреляционной связи между иммуногистохимическими характеристиками опухолевых клеток и клетками опухолевого микроокружения использовали расчет корреляционной связи по методу Спирмена, отражающей факт изменчивости одного признака, который находится в некотором соответствии с изменчивостью другого. При значении коэффициента корреляции: 1) r=±0,7—1,0 — связь сильная; 2) r=±0,3—0,699 — умеренная; 3) r=0—0,299 — слабая связь.

Уровень значимости α для вычислений принимали равным 0,05.

Сопоставление по количеству наблюдений между размерами опухоли и степенью опухолевой дифференцировки показано в табл. 1.

Таким образом, у большинства пациентов во время обращения в клинику размер опухоли соответствовал Т2 и Т3, при этом в большинстве случаев гистологически выявлен высокодифференцированный и умеренно-дифференцированный рак.

Корреляционный анализ при высокодифференцированном плоскоклеточном раке (G1) показал наличие значимой умеренной корреляционной связи только между клетками стромы (CD57-лимфоциты и CD68-макрофаги; r=0,6, p=0,016). Все остальные корреляционные связи как между клетками стромы, так и между клетками стромы и опухолевыми клетками оказались незначимыми (р>0,05).

Результаты корреляционного анализа и значимые коэффициенты корреляции между клетками опухоли и клетками стромы при умеренно-дифференцированном плоскоклеточном раке языка (G2) показаны в табл. 2.

Результаты корреляционного анализа и значимые коэффициенты корреляции между клетками опухолевого микроокружения при умеренно-дифференцированном плоскоклеточном раке языка (G2) показаны в табл. 3.

Таким образом, при умеренно-дифференцированном плоскоклеточном раке языка по сравнению с высокодифференцированным можно отметить увеличение общего количества корреляционных связей, а также появление корреляционных связей между клетками опухоли и клетками опухолевого микроокружения, что может указывать на их более активное взаимодействие при изменении гистологического строения опухоли.

Результаты корреляционного анализа и значимые коэффициенты корреляции между клетками опухоли и клетками стромы при низкодифференцированном плоскоклеточном раке языка (G3) показаны в табл. 4.

Результаты корреляционного анализа и значимые коэффициенты корреляции между клетками опухолевого микроокружения при низкодифференцированном плоскоклеточном раке языка (G3) показаны в табл. 5.

Таким образом, при низкодифференцированном плоскоклеточном раке языка по сравнению с умеренно-дифференцированным можно отметить увеличение и усиление корреляционных связей между клетками опухоли и ее микроокружением, появление корреляционной связи между индексом пролиферативной активности опухолевых клеток и количеством капилляров в опухолевом микроокружении.

Известно, что сложные взаимодействия опухолевых клеток внутри микроокружения играют важную роль в прогрессии опухоли [2]. При опухолевой прогрессии параллельно с изменением свойств опухолевых клеток происходит изменение взаимодействия опухоль—микроокружение, которое не является статическим [7], и при рассмотрении морфогенеза опухоли без микроокружения не учитываются компоненты ее стромы [2]. Исследования по изучению взаимодействий компонентов паренхимы опухоли и ее стромального микроокружения ведутся разными авторами [8], однако в доступной литературе мы не встретили оценку связи опухоль—микроокружение при раке языка; показано, что низкодифференцированные опухоли приводят к менее благоприятному прогнозу, чем высокодифференцированные [9], но межклеточные связи клеток опухоли и клеток стромы не изучены.

Повышенная экспрессия регулятора клеточного цикла циклина D1 в опухоли приводит к активации клеточного цикла, ускоряет деление клеток и сопровождается метастазами в регионарных лимфатических узлах [10]. По нашим данным, экспрессия циклина D1 в опухолях разной степени дифференцировки не различалась между собой (рис. 1).

Ген-онкосупрессор р53 один из наиболее часто подвергающихся мутации при плоскоклеточном раке головы и шеи, а его продукт белок р53 блокирует клеточный цикл в G1-S-фазе и репликацию поврежденной ДНК. Мутация гена р53 встречается более чем в 50% случаев злокачественных опухолей головы и шеи [11]. Результаты нашего анализа показывают, что в 46 (78%) случаях определяли экспрессию белка р53 в опухолевых клетках (рис. 3).

В 97% наблюдений рака ротовой полости с метастазами выявлено снижение экспрессии CD82/KAI1 в опухолевых клетках [12]. В наших наблюдениях процент опухолевых клеток с экспрессией CD 82/KAI1 в преобладающем количестве случаев был низкий, а в 16 (27%) случаях экспрессия CD 82/KAI1 не определялась (рис. 4).

В низкодифференцированном и умеренно-дифференцированном плоскоклеточном раке полости рта пролиферативный индекс Ki-67 выше, чем в высокодифференцированном плоскоклеточном раке [14]. Несмотря на то что многие публикации отмечают связь между индексом Ki-67 и прогнозом заболевания, этот показатель еще не нашел широкого применения в практике, вероятно, потому, что связь эта остается неясной и противоречивой [15]. В доступной нам литературе изучалась связь между иммуногистохимическими характеристиками клеток паренхимы опухоли. Так, показана сильная положительная корреляционная связь между р53+ и CD82/KAI1+ опухолевыми клетками [16], при этом отсутствует информация о связи между Ki-67+ и CD82/KAI1+ опухолевыми клетками. В нашем исследовании показана положительная корреляционная связь между данными видами клеток паренхимы опухоли при умеренно-дифференцированном плоскоклеточном раке языка.

В плоскоклеточном раке полости рта при разных степенях дифференцировки опухоли Т-лимфоциты являлись наибольшей клеточной популяцией, среди которых преобладали CD8+ Т-клетки. В-лимфоциты были второй по частоте встречаемости клеточной популяцией [14]. В наших наблюдениях преобладающими популяциями являлись CD20+ В-лимфоциты, второй популяцией клеток по частоте встречаемости стали CD8+ Т-лимфоциты, а между данными клетками показана положительная корреляционная связь при умеренно-дифференцированном раке языка. Данных о роли В-лимфоцитов в патогенезе и лечении злокачественных опухолей мало и они противоречивы. Одни авторы считают, что В-лимфоциты, инфильтрирующие опухоль, выполняют защитную функцию [14], другие полагают, что В-регуляторные клетки повышают агрессивность опухоли, приводя к ухудшению прогноза заболевания [17].

CD57+ NK-клеточная инфильтрация может рассматриваться как мощный индикатор общей выживаемости пациентов [18]. Важно и то, что CD57+ NK-клетки через взаимодействие с дендритными клетками могут усиливать ответ Т-лимфоцитов [19]. В нашем исследовании количество CD8+ Т-клеток в опухолевом микроокружении было больше, чем количество CD57+ NK-клеток, а между клетками установлена положительная корреляционная связь при умеренно-дифференцированном и низкодифференцированном плоскоклеточном раке.

В некоторых работах [20, 21] показана связь количества опухольассоциированных макрофагов со степенью дифференцировки опухоли, в частности, количество макрофагов при плоскоклеточном раке головы и шеи в низкодифференцированных опухолях было меньше, чем в умеренно-дифференцированных. Проведенный анализ показал положительную корреляционную связь между CD68+ макрофагами и CD8+ Т-лимфоцитами, между CD68+ макрофагами и CD57+ NK-клетками в умеренно-дифференцированном раке, а также CD68+ макрофагами и CD57+ NK-клетками и CD68+ макрофагами и CD20+ В-лимфоцитами при низкодифференцированном плоскоклеточном раке языка.

Критически важный компонент опухолевого микроокружения — вновь образованные кровеносные сосуды, являющиеся ключевым фактором в росте опухоли [22]. При низкодифференцированном плоскоклеточном раке мы показали положительную корреляционную связь между индексом пролиферативной активности клеток опухоли Ki-67 и количеством капилляров в опухолевом микроокружении. Наши результаты совпадают с данными исследователей [23], которые установили положительную корреляционную связь между фактором роста эндотелия сосудов и индексом пролиферативной активности опухолевых клеток Ki-67 при раке полости рта.

Повышенный уровень экспрессии MMP-9 клетками опухоли достоверно чаще сопровождался метастазами в лимфатических узлах [24], а совместная оценка экспрессии MMP-9 и Cyclin D1 в опухолевых клетках может быть использована как мера чувствительности и мера ответа опухоли на противоопухолевую терапию [25]. В нашем исследовании экспрессия MMP-9 клетками опухоли была низкая и очаговая, в 41 (70%) случае экспрессия не выявлена (при положительном контроле экспрессии MMP-9 в клетках стромы), а также установлена сильная корреляционная связь между MMP-9+ и Cyclin D1+ клетками паренхимы опухоли в низкодифференцированном плоскоклеточном раке языка.

Таким образом, при плоскоклеточном раке языка между клетками опухоли и их микроокружением существуют корреляционные связи, меняющиеся при изменении степени дифференцировки опухоли. Сила и количество этих связей увеличиваются при переходе от высокодифференцированного к низкодифференцированному раку. В связи с тем что TNM-система классификации не учитывает гистологические и иммуногистохимические особенности клеток опухолей, их гетерогенность, опухолевое микроокружение, а также механизмы взаимодействия опухолевых клеток с микроокружением, данная система в полной мере не способна предсказать биологическое поведение опухоли. Детальное понимание этих особенностей может служить дополнением классификации TNM и стать основой для разработки таргетных методов терапии. Разработка общих методологических подходов к оценке результатов иммуногистохимического исследования, использование специальных программ анализа и обработки изображений позволят получить более объективные результаты научной и практической работы.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Р.Ф.З.

Сбор и обработка материала — Р.Ф.З.

Статистическая обработка — Р.Ф.З.

Написание текста — Р.Ф.З.

Редактирование — Р.Ф.З., С.А.М., В.В.П., Ф.Е.С.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Зибиров Р.Ф. — https://orcid.org/0000-0001-5252-0436; e-mail: patologr@mail.ru

Мозеров С.А. — https://orcid.org/0000-0002-2168-2616

Полькин В.В. — https://orcid.org/0000-0003-0857-321X

Севрюков Ф.Е. — https://orcid.org/0000-0002-9756-6275

Автор, ответственный за переписку: Зибиров Руслан Фяритович — e-mail: patologr@mail.ru

Зибиров Р.Ф., Мозеров С.А., Полькин В.В., Севрюков Ф.Е. Иммуногистохимические особенности опухоли и ее микроокружения при плоскоклеточном раке языка. Онкология. Журнал им. П.А. Герцена. 2019;8(6):413-418. https://doi.org/10.17116/onkolog20198061413