Введение

Возбудитель чумы, Yersinia pestis, стал причиной гибели миллионов людей по всему миру. Эта грамотрицательная бактерия вызывает зооноз, передающийся посредством укусов блох в популяциях диких грызунов, обитающих в природных очагах чумы [1—3]. Эффективность передачи возбудителя, острое течение и летальный исход инфекции обусловлены множеством факторов бактериальной трансмиссии и/или патогенности [4—6]. Изучение молекулярных механизмов патогенеза чумы и выявление новых факторов патогенности Y. pestis — потенциальных молекулярных мишеней для специфической профилактики и терапии инфекции, по-прежнему является актуальным.

Наружная мембрана грамотрицательных бактерий содержит множество белков, помогающих поддерживать структурную целостность клеточной оболочки. Одним из них является белок SurA (Survival protein A), впервые идентифицированный как фактор, играющий важную роль в выживании клеток Escherichia coli в стационарной фазе роста [7]. Показано, что парвулин-подобный домен белка обладает пептидил-пролил-изомеразной активностью [8], а N-концевой домен — шаперонной активностью [9]. Установлено, что именно шаперонная функция связана с ролью SurA в патогенезе инфекций, вызываемых некоторыми видами бактерий [10]. Например, делеция гена surA оказывает плейотропный эффект на бактериальную клетку Yersinia pseudotuberculosis, ведущий к аттенуации штамма при мышиной модели инфекции [11], что отчасти может быть связано с ролью белка в биогенезе наружной мембраны, а именно с утратой мутантным штаммом инвазина Inv, необходимого возбудителю псевдотуберкулеза для процесса инвазии [12]. Делеционный мутант вирулентного штамма Y. pestis оказался более чувствительным к мембрано-проникающим агентам и не вызывал гибели мышей при подкожном введении 2,1·10⁵ КОЕ [13]. J. Weirich и соавт. [14] показали, что утрата SurA приводит к аттенуации Yersinia enterocolitica у мышей при оральном и внутривенном пути заражения.

Настоящая работа посвящена определению роли белка SurA в патогенезе бубонной и легочной формы чумы. Для этого были получены нокаутные мутанты на моделях аттенуированного и вирулентного штаммов чумного микроба, фенотипически охарактеризованы и изучена их вирулентность при подкожном и интраназальном заражении мышей и крыс.

Материал и методы

Штаммы микроорганизмов и условия выращивания. Вирулентный штамм Y. pestis 231 (subsp. pestis bv. antiqua; Fra⁺Tox⁺Lcr⁺Pst⁺Pla⁺Pgm⁺) [15] и его авирулентный производный KM260(11) (Fra⁺Tox⁺Lcr^-Pst^-Pla^-Pgm^-), а также штаммы E. coli S17 (λpir) [16] и DH5α [17] получены из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ-Оболенск). Микроорганизмы выращивали на жидких и плотных питательных средах: LB (Luria Bertani broth medium: триптон — 1%, дрожжевой экстракт — 0,5%, натрий хлористый — 1%); Хоттингера (ФБУН ГНЦ ПМБ); BHI (Brain Heart Infusion, HiaMedia, Индия).

Животные. Для проведения работ в качестве подопытных животных использовали беспородных белых мышей (самцы/самки) (19±1) г и аутбредных крыс линии вистар (самцы/самки) (190±10) г. Условия содержания лабораторных животных, технология ухода и манипуляции с ними соответствовали требованиям СП 1045-73 «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию вивариев». Все эксперименты были одобрены комитетом по биоэтике.

Получение нокаутных мутантов. Мутанты с делетированным геном surA на модели аттенуированного штамма Y. pestis subsp. pestis KM260 (11) получали методом RedGam-мутагенеза [18], на модели вирулентного штамма Y. pestis subsp. pestis 231 — с помощью плазмид на основе суицидного вектора pCVD442 [19]. Последующее удаление кассеты устойчивости к антибиотику в инактивированном гене ΔsurA::kan выполняли с помощью вектора pCP20, как описано ранее [18]. Верификацию замены генов проводили с помощью полимеразной цепной реакции. Для комплементации мутации кодирующую последовательность гена surA штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ клонировали по сайтам рестриктаз NdeI и SalI в плазмиде pACYC-gfp [20].

Оценка скорости роста. Динамику роста штаммов оценивали при выращивании в трех повторах в 200 мкл жидкой питательной среды (бульон Хоттингера с добавлением 1% гемолизированной крови) в 96-луночных планшетах Costar (Corning Incorporated, США) при температурах 28 °C и 37 °C в термостатируемом планшетном фотометре MultisckanFC (Thermoscientific, США).

Определение чувствительности к антибиотикам, солям желчных кислот/додецилсульфату натрия. Чувствительность штаммов, выращенных в течение 24 ч при температуре 28 °C, к антибиотикам определяли методом диско-диффузионного анализа, как описано ранее [15]. Устойчивость к полимиксину B оценивали путем определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) по общепринятой методике [21]. Чувствительность к дезоксихолату натрия (0,05%) или додецилсульфату натрия (0,0125%) оценивали, как описано ранее [15].

Выделение белков внешней мембраны. Фракции белков внешней мембраны получали, как описано ранее [12], смешивали с равным объемом лизирующего буфера и после прогревания при 99 °C в течение 5 мин использовали для электрофоретического разделения в ДСН-ПААГ и иммуноблоте [22].

Заражение лабораторных животных. Вирулентность сконструированного мутанта Y. pestis 231ΔsurA определяли по величине LD₅₀ по сравнению с исходным высоковирулентным штаммом Y. pestis 231 на моделях бубонной и легочной форм инфекции у беспородных мышей и крыс линии вистар. Наблюдение за зараженными животными проводили в течение 21 сут. Вычисление величин LD₅₀ и доверительных интервалов (для вероятности 95%) проводили по методу Kärber в модификации И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева [23].

Определение чувствительности штаммов к бактерицидному действию комплемента проводили путем сравнительной оценки воздействия нормальной человеческой сыворотки и сыворотки с инактивированным путем нагревания комплементом (тНЧС) на бактериальную взвесь по методу M.G. Barnes и соавт. [24].

Статистический анализ. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Статистический анализ проведен, использовав GraphPadPrism 6 (GraphPadSoftware, LaJolla, CA), выполнив однофакторный дисперсионный анализ ANOVA. Различия считали достоверными, если p≤0,05.

Результаты и обсуждение

Конструирование нокаутных штаммов и важность нокаута для роста Y. pestis

Проведенный сайт-направленный мутагенез гена surA (YPO0494) в штаммах Y. pestis subsp. pestis КМ260(11) и 231 и последующее удаление маркера устойчивости к канамицину позволили получить мутанты КМ260(11)ΔsurA и 231ΔsurA без генов антибиотикоустойчивости.

Индивидуальный нокаут гена surA оказывал влияние на штамм КМ260(11)ΔsurA при температурах 28 °C и 37 °C (рис. 1), скорость роста которого уступала аналогичному показателю у штамма «дикого» типа. Отличие проявилось спустя 3—4 ч после инокуляции и сохранялось на протяжении всего времени наблюдения (см. рис. 1). Рост штамма ΔsurA восстанавливался при конститутивной экспрессии SurA, кодируемого плазмидой pACYC-surA (данные не представлены).

Рис. 1. Кривые роста штаммов Y. pestis КМ260(11) и КМ260(11)ΔsurA при температурах 28 °C (А) и 37 °C (В) in vitro.

Оценка целостности и проницаемости наружной мембраны

Наружная мембрана функционирует как эффективный барьер для проницания многих классов молекул, включая агенты с повреждающим действием: детергенты и антибиотики. Прежде всего оценили чувствительность нокаутного мутанта, исходного и комплементированного штаммов Y. pestis, выращенных при температуре 28 °C, к антибиотикам рифампицину (Rif), энрофлоксацину (Enr), ванкомицину (Van), доксициклину (Do), азитромицину (Azm) диско-диффузионным методом (табл. 1).

Таблица 1. Чувствительность нокаутных мутантов к антибиотикам, солям желчных кислот и ДСН

Согласно полученным результатам ΔsurA-мутантный штамм обладал повышенной чувствительностью к рифампицину, энрофлоксацину, доксициклину, ванкомицину. Устойчивость к азитромицину была сравнима с устойчивостью исходного штамма.

Была проведена оценка устойчивости сконструированных мутантов к полимиксину B, так как экспериментально полученные данные подтверждают, что устойчивость к данному пептиду положительно коррелирует с устойчивостью к антимикробным пептидам млекопитающих. Выращенный при температуре 25 °C штамм Y. pestis KM260(11)ΔsurA был в 100—200 раз чувствительнее к бактерицидному действию полимиксина B (МИК=0,25 мкг/мл), чем исходный штамм Y. pestis KM260(11) (МИК=50 мкг/мл) p=0,05).

Таким образом, утрата белка SurA значительно повышает эффективность выбранных антибиотиков в отношении возбудителя чумы.

Еще одна возможность определить целостность и функции наружной мембраны состоит в оценке устойчивости бактерии к детергентам, а именно ДСН и дезоксихолату натрия как представителю желчных кислот. Штамм Y. pestis KM260(11)ΔsurA в отличие от родительского Y. pestis KM260(11) был не способен расти на среде, содержащей додецилсульфат натрия (см. табл. 1). Кроме того, ΔsurA-мутант был более чувствителен к 0,05% дезоксихолату натрия, обладая способностью лишь к минимальному росту при высокой посевной дозе по сравнению с исходным или комплементированным штаммом.

В целом эти результаты подтверждают вывод, полученный при анализе чувствительности к антибиотикам, и демонстрируют, что белок SurA необходим для поддержания целостности клеточной оболочки чумного микроба.

Внутриклеточная локализация SurA чумного микроба

Алгоритмы предсказания структуры указывают на наличие сигнального пептида у белка SurA чумного микроба, что свидетельствует о возможной его локализации в клеточной оболочке. Сконструированный рекомбинантный SurA использовали для получения поликлональных мышиных антител, с помощью которых определили внутриклеточную локализацию белка у чумного микроба. Белок SurA обнаруживался в клеточном лизате штамма Y. pestis КМ260(11) (рис. 2) и присутствовал в периплазматической фракции. Наружная и внутренняя мембраны, как и цитоплазматическая фракция, белка не содержали. Полученные результаты согласуются с обнаруженной ранее локализацией SurA в клетках E. coli и Y. pseudotuberculosis [12, 25].

Рис. 2. Внутриклеточная локализация SurA (A) и изменения в композиции белков наружной мембраны при утрате SurA Y. pestis (B).

а: М — Page Ruler Plus Prestained Protein Ladder (Fermentas, Литва), 1 — клеточный лизат КМ260(11); 2 — периплазматическая фракция, 3 — цитоплазматическая фракция, 4 — внутренняя мембрана, 5 — наружная мембрана, 6 — белок SurA-His_6; б: М — Page Ruler Plus Prestained Protein Ladder (Fermentas, Литва), 1 — клеточный лизат КМ260(11); 2 — клеточный лизат КМ260(11)ΔsurA, 3 — наружная мембрана КМ260(11), 4 — наружная мембрана КМ260(11)ΔsurA, 5 — белок SurA-His₆.

Целостность наружной мембраны определяет спектр присутствующих в ней белков. Для оценки суммарной композиции белков наружной мембраны с помощью ДСН-ПААГ и окраски Кумасси G-250 приготовили фракции наружной мембраны эквивалентного количества бактерий штамма «дикого» типа и ΔsurA мутанта (см. рис. 2, б). Действительно, обнаружили значительное (около 80%) снижение уровня продукции большинства белков наружной мембраны в штамме КМ260(11)ΔsurA.

Важность нокаута для вирулентности штаммов при заражении мышей и крыс

Вирулентность сконструированного мутанта Y. pestis 231ΔsurA определяли по величине LD₅₀ по сравнению с исходным высоковирулентным штаммом Y. pestis 231 (табл. 2) для мышей и крыс, зараженных подкожно и интраназально.

Таблица 2. Вирулентность штаммов Y. pestis на модели бубонной и легочной чумы для мышей и крыс

Штамм с делетированным геном surA был авирулентен для крыс при подкожном и интраназальном способах введения в максимально использованных дозах (10⁷ КОЕ и 10⁶ КОЕ соответственно) (рис. 3). После заражения исходным штаммом Y. pestis 231 в дозе 10⁴ КОЕ крысы пали к 5-му дню наблюдения.

Рис. 3. Выживаемость крыс после заражения Y. pestis 231 и Y. pestis 231ΔsurA.

Выживаемость мышей, инфицированных подкожно и интраназально штаммом Y. pestis 231ΔsurA носила дозозависимый характер и достигала 100% в дозах 10⁴ и 10⁵ КОЕ соответственно. В то же время все мыши после заражения подкожно и интраназально исходным штаммом Y. pestis 231 в дозе 10 КОЕ и 10⁴ пали к 4-му и 7-му дням наблюдения (рис. 4).

Рис. 4. Выживаемость мышей после заражения Y. pestis 231 и Y. pestis 231ΔsurA.

Устойчивость к сыворотке

Известно, что поверхностные компоненты бактериальной клетки — капсула, ЛПС и белки внешней мембраны — влияют на взаимодействие комплемента с грамотрицательными бактериями. Исходный штамм Y. pestis subsp. pestis 231, выращенный при температуре 25 °C, переживал действие комплемента 80% НЧС. Число жизнеспособных микробных клеток недостоверно снижалось после одного часа инкубации по сравнению с инкубацией в тНЧС. Инкубация в течение 1 ч в 80% НЧС штамма с делетированным геном surA приводила к достоверному снижению (p=0,014) числа жизнеспособных микробных клеток (lg 3,26±0,14 КОЕ) по сравнению с инкубацией в тНЧС (lg 6,73±0,28 КОЕ).

Белок SurA является одним из ключевых факторов, экспрессия которых определяет вирулентность штаммов чумного микроба. Потеря данного белка ведет к аттенуации штаммов Y. pestis для крыс и мышей при подкожном и интраназальном пути введения и значительно увеличивает киллинг бактерий комплементом нормальной сыворотки человека. Известно, что белок SurA является одним из факторов, влияющих на вирулентность Salmonella enterica [26, 27], Shigella flexneri [28], уропатогенных штаммов E. coli, [29], Pseudomonas aeruginosa [30], Yersinia pseudotuberculosis [12, 13] и Yersinia enterocolitica [14]. Таким образом, спектр патогенов, которые могут быть элиминированы с помощью новых препаратов, направленных на снижение вирулентности путем нарушения барьерной функции внешней мембраны, достаточно широк. Гомология аминокислотной последовательности SurA чумного микроба с белками разных представителей семейства Enterobacteriaceae довольно высока, особенно для энтеропатогенных представителей рода Yersinia: Y. pseudotuberculosis (WP_024063106.1) идентичность составляет 100%, а для Y. enterocolitica (WP_083160586.1) — 92%. Немного ниже идентичность для белков SurA E. coli (VWQ00825.1) — 75,4%, Salmonella enterica (WP_052896747.1) — 75,1% и Klebsiella pneumoniae (CDO16039.1) — 73,9%. Таким образом, нельзя исключить вероятность того, что ингибитор, подобранный для белка SurA чумного микроба, окажется эффективным и в отношении других патогенов Enterobacterales, повышая их чувствительность к действию доступных, но малоэффективных антибактериальных препаратов, тем самым снижая необходимую для киллинга минимальную ингибирующую концентрацию.

Заключение

Таким образом, SurA чумного микроба можно рассматривать в качестве потенциальной молекулярной мишени для антимикробных агентов, а широкое распространение белка среди грамотрицательных патогенов делает перспективным его использование для разработки ингибиторов с широким спектром действия.

Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант 23-15-00132).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.