Введение
Возбудитель гонококковой инфекции — Neisseria gonorrhoeae — признан Всемирной организацией здравоохранения одним из приоритетных бактериальных патогенов, представляющих наибольшую опасность для глобальной системы здравоохранения [1]. Причиной этого является сохраняющийся высокий уровень заболеваемости гонококковой инфекцией, а также быстрое развитие устойчивости ее возбудителя к антимикробным препаратам [2]. После исчерпания терапевтического потенциала пенициллинов, тетрациклинов и фторхинолонов единственной группой антибиотиков, еще сохраняющей свою эффективность против N. gonorrhoeae, остаются цефалоспорины III поколения, в частности, цефтриаксон.
Основными мишенями цефалоспоринов в бактериальной клетке являются два пенициллинсвязывающих белка (penicillin-binding protein; PBP): PBP1, кодируемый геном ponA, и PBP2, кодируемый геном penA [3], вместе вовлеченные в процесс биосинтеза пептидогликана клеточной стенки. В свою очередь, формирующаяся устойчивость N. gonorrhoeae к данным антибиотикам связывается с появлением и распространением особого аллеля гена penA, возникшего в результате гомологичной рекомбинации с комменсальными видами Neisseria и приобретшим так называемую «мозаичную» структуру с множественными нуклеотидными заменами, существенно снижающими аффинность PBP2 к цефалоспоринам III поколения [2]. В соответствии с современной номенклатурой аллелей penA [4] подобный «мозаичный» вариант принято обозначать как аллель XXXIV типа.
Для контроля за распространением антибиотикорезистентных клонов N. gonorrhoeae ВОЗ инициированы глобальная и региональные программы мониторинга [5], ключевыми элементами которых являются анализ чувствительности современных клинических изолятов к антимикробным препаратам, выявление генетических детерминант антибиотикорезистентности, а также проведение молекулярного типирования, направленного на идентификацию наиболее эпидемически опасных генотипов. При этом решение последней задачи осуществляется путем NG-MAST-типирования (от англ. — Neisseria gonorrhoeae multiantigen sequence typing), предполагающего секвенирование внутренних фрагментов двух гипервариабельных генов: porB и tbpB [6], а также MLST-типирования (от англ. — multilocus sequence typing), основанного на анализе последовательностей семи хромосомных генов «домашнего хозяйства» (abcZ, adk, aroE, fumC, gdh, pdhC и pgm), которые более консервативны и эволюционируют относительно медленно [7].
Проведение исследований в данном направлении привело к обнаружению глобально распространенного клона NG-MAST 1407/MLST 1901, несущего аллель penA XXXIV типа и ставшего причиной ряда случаев безуспешной терапии гонококковой инфекции с использованием цефалоспоринов III поколения [2, 8]. В то же время в Российской Федерации данный сиквенс-тип не получил широкого распространения, а после 2015 г. перестал регистрироваться [9].
Цель настоящего исследования — NG-MAST- и MLST-типирование современной (2018—2020 гг.) российской популяции N. gonorrhoeae, направленное на поиск эпидемиологически опасных сиквенс-типов, несущих «мозаичную» аллель гена penA.
Материал и методы
В исследование включены 326 клинических изолятов N. gonorrhoeae, поступивших в ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России в 2018—2020 гг. из специализированных медицинских учреждений дерматовенерологического профиля Архангельской (n=63), Астраханской (n=40), Калужской (n=43), Новосибирской (n=11) и Омской (n=44) областей, Ставропольского края (n=20), республик Татарстан (n=21) и Чувашия (n=78), а также Москвы (n=6).
NG-MAST-типирование. Амплификацию и секвенирование внутренних участков генов porB (490 п.н.) и tbpB (390 п.н.) проводили как описано ранее [6] с использованием идентичных праймеров (ДНК-синтез, Россия), последовательность которых приведена в таблице. Идентифицированные нуклеотидные последовательности сравнивали с известными аллелями генов porB и tbpB, после чего по их комбинации определяли NG-MAST-тип каждого клинического изолята. При несовпадении результатов секвенирования с известными последовательностями их направляли в международную базу https://pubmlst.org для присвоения новых индивидуальных номеров соответствующим аллелям и сиквенс-типам.
Последовательности праймеров, использованных для амплификации и секвенирования генов, учитываемых в системах молекулярного типирования NG-MAST и MLST
Ген-мишень | Нуклеотидная последовательность праймеров | |
Прямой (f) | Обратный (r) | |
NG-MAST типирование: амплификация и секвенирование: | ||
porB | 5’- CAAGAAGACCTCGGCAA -3’ | 5’- CCGACAACCACTTGGT-3’ |
tbpB | 5’- CGTTGTCGGCAGCGCGAAAAC -3’ | 5’-TTCATCGGTGCGCTCGCCTTG-3’ |
MLST типирование: амплификация: | ||
abcZ | 5’-TGTTCCGCTTCGACTGCCAAC-3’ | 5’-TCCCCGTCGTAAAAAACAATC-3’ |
adk | 5’-TGCCCAATGCGCCCAATAC-3’ | 5’-CAAGCCGTGTAGAATCGTAAACC-3’ |
aroE | 5’-TTTGAAACAGGCGGTTGCGG-3’ | 5’-CAGCGGTAATCCAGTGCGAC-3’ |
fumC | 5’-GCCCGTCAGCAAGCCCAAC-3’ | 5’-TCCCCGCCGTAAAAGCCCTG-3’ |
gdh | 5’-GTTGCGCGTTATTTCAAAGAAGG-3’ | 5’-CTGCCCCCGGGGTTTTCATCT-3’ |
pdh | 5’-GATGTCGGAATGGGGCAAACA-3’ | 5’-CCGGCCGTACGACGCTGAAC-3’ |
pgm | 5’-CGGATTGCTTTCGATGACGGC-3’ | 5’-CTTCAAAGCCTACGACATCCG-3’ |
MLST типирование: секвенирование: | ||
abcZ | 5’-GAGAACGAGCCGGGATAGGA-3’ | 5’-AATCGTTTATGTACCGCAGR-3’ |
adk | 5’-CAATACTTCGGCTTTCACGG-3’ | 5-CGCCGCGTTCGGCATTCCGC-3 |
aroE | 5-GCGGTCAAYACGCTGRTK-3 | 5-ATGATGTTGCCGTACACATA-3 |
fumC | 5- AGTTTCGCGCAGCGATTTAT -3 | 5-TCCGGCTTGCCGTTTGTCAG-3 |
gdh | 5’-CCTTGGCAAAGAAAGCCTGC-3’ | 5-RCGCACGGATTCATRYGG-3 |
pdh | 5’-ATCGGCTTTGATGCCGTATTT-3’ | 5’-TCTACTACATCACCCTGATG-3’ |
pgm f | 5’-GGTGATGATTTCGGTYGCRCC-3’ | 5’-GCCGCGCTGAAAAACGGCGA-3’ |
MLST-типирование. Первый раунд амплификации генов abcZ, adk, aroE, fumC, gdh, pdhC и pgm проводили на основании известного протокола [10] с использованием набора праймеров (ООО «ДНК-синтез», Россия), последовательности которых указаны в таблице. Полученные продукты в присутствии меченых терминирующих нуклеотидов Big Dye Terminator v3.1 Sequencing RR-100 (Applied Biosystems, США) использовали для амплификации со вторым набором праймеров, после чего анализировали методом капиллярного электрофореза (ABI 3730XL Genetic Analyzer, Applied Biosystems, США). Номера аллелей и сиквенс-типов присваивали путем сравнения с базой данных GeneBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). При обнаружении уникальных последовательностей анализируемых генов информацию о них депонировали в международной базе https://pubmlst.org
Филогенетический анализ. Для каждого NG-MAST или MLST-сиквенс-типа создавали конкатенированные последовательности учитываемых аллелей, после чего с использованием программного обеспечения RAxML, версия 7.4.8 (https://galaxy-dev.cnsi.ucsb.edu/osiris) строили филогенетические деревья максимального правдоподобия. При анализе их структуры проводили выделение филогенетически родственных геногрупп (G), определяемых как совокупность сиквенс-типов (ST) с не менее чем 99,5% сходством конкатенированных последовательностей с основным вариантом в геногруппе.
Анализ полиморфизма гена penA. Первичную нуклеотидную последовательность гена penA анализировали секвенированием по Сенгеру, как описано ранее [11]. Полученные сиквенсы выравнивали на эталонной последовательности гена penA дикого типа (номер в GenBank M32091), после чего определяли тип аллеля в соответствии с номенклатурой [5].
Результаты и обсуждение
Секвенирование вариабельных участков генов porB и tbpB позволило выявить 88 и 43 различных аллелей соответственно. В свою очередь, анализ их комбинаций приводил к заключению о существенной гетерогенности современной российской популяции N. gonorrhoeae, представленной 110 NG-MAST-типами, из которых 57 сиквенс-типов, несущие новые сочетания или неизвестные аллели генов porB и tbpB, в рамках настоящего исследования были описаны впервые. Наиболее многочисленными NG-MAST-типами (рис. 1, а) являлись STNG-MAST228 и STNG-MAST807, представленные 31 и 28 клиническими изолятами (9,5 и 8,6% от общей численности анализируемой выборки), что согласуется с представлениями о широте их распространения на постсоветском пространстве [12], включая Белоруссию и Казахстан. Третьим по численности (15 клинических изолятов; 4,6%) являлся STNG-MAST1993, ранее описываемый как один из доминирующих в Белоруссии, Украине и Дании [13—15]. В десятку наиболее распространенных NG-MAST-типов входили также 9486, 5742, 6226, 14020, 14942, 18947 и 9570, каждый из которых был представлен не менее чем 6 клиническими изолятами (см. рис. 1, а). Остальные сиквенс-типы имели существенно меньшую численность, встречались на протяжении только одного или двух лет проводимого исследования, а более половины из них (57 из 110) были представлены одиночными клиническими изолятами.
Рис. 1. Наиболее многочисленные NG-MAST (а) и MLST (б) сиквенс-типы N. gonorrhoeae, циркулирующие на территории Российской Федерации в 2018—2020 гг.
По оси абсцисс: NG-MAST (а) и MLST (б) сиквенс-типы N. gonorrhoeae, по оси ординат — количество изолятов каждого сиквенс-типа.
Проведение филогенетического анализа позволило объединить идентифицированные NG-MAST-типы в 5 основных геногрупп (рис. 2, фрагмент слева). Наиболее многочисленной из них являлась GNG-MAST228 (113 клинических изолятов — 34,7% от общего состава анализируемой выборки), включающая 23 различных сиквенс-типов. Анализ ее состава свидетельствовал о существенной филогенетической близости двух наиболее часто регистрируемых ST: 228 и 807 (см. выше), а также кластеризуемого вместе с ними STNG-MAST9570. Вторая по численности геногруппа GNG-MAST9486 (81 клинический изолят, 24,8% анализируемой выборки) включала 27 сиквенс-типов, среди которых наиболее многочисленными являлись STNG-MAST9486, STNG-MAST5742 и STNG-MAST14020. Промежуточное положение между ними занимала GNG-MAST14942 (38 изолятов; 11,7%). В свою очередь, в составе геногруппы GNG-MAST1993, включающей 30 ST (в том числе многочисленные STNG-MAST1993, STNG-MAST6226 и STNG-MAST18947), было возможным выделение филогенетически отстоящей субгруппы, объединяющей сиквенс-типы 10025 (n=4), 5622, 3149 и 2212 (по 1 изоляту каждый). На этом фоне геногруппа GNG-MAST19649 имела наименьшую численность, будучи представленной только пятью отдельными сиквенс-типами.
Рис. 2. Соответствие NG-MAST (слева) и MLST (справа) сиквенс-типов у клинических изолятов N. gonorrhoeae, циркулирующих на территории РФ в 2018—2020 гг.
Филогенетические дендрограммы редуцированы до основных (наиболее многочисленных) сиквенс-типов. Жирными линиями обозначены соответствия для клинических изолятов N. gonorrhoeae, несущих «мозачную» аллель гена penA XXXIV типа.
Секвенирование генов «домашнего хозяйства», учитываемых системой молекулярного типирования MLST, позволило идентифицировать по 4 аллели генов abcZ, adk и aroE, 10 аллелей гена fumC, 7 — gdh, 2 — pdhC и 3 — pgm. Анализ комбинаций названных аллелей характеризовал генетическое разнообразие современной российской популяции N. gonorrhoeae присутствием 41 MLST сиквенс-типа (см. рис. 1, б), из которых 12 ST в рамках настоящего исследования были описаны впервые. Полученные результаты показали существенное доминирование STMLST1594, впервые идентифицированного в исследовании 2004—2005 гг. в качестве одного из наиболее многочисленных российских сиквенс-типов [16], а в настоящее время объединяющего более четверти (n=91; 27,9%) от общей численности анализируемой выборки. Существенной численностью характеризовались также STMLST1892 и STMLST1901, представленные 48 (14,7%) и 45 (13,8%) клиническими изолятами соответственно. При этом если первый из них преимущественно обнаруживается в России и Украине [14, 16], то сиквенс-тип 1901 отличается глобальным распространением, в интегральных выборках представляя до четверти клинических изолятов [17]. В десятку наиболее многочисленных MLST-типов входили также 11177, 14009, 13759, 14008, 6726, 13757 и 1902 (см. рис. 1, б), в то время как 16 сиквенс-типов в анализируемой выборке были представлены только одиночными клиническими изолятами.
Филогенетический анализ объединял идентифицированные MLST-типы в 5 геногрупп (см. рис. 2, фрагмент справа). Наиболее многочисленная из них GMLST1594 включала 143 клинических изолята (43,9% от общей численности анализируемой выборки), относящихся к 12 сиквенс-типам, среди которых на фоне доминирующего генетического варианта выделялись также STMLST11177 (n=21) и STMLST14009 (n=15). Примыкающая к ней геногруппа GMLST1901 (70 клинических изолятов; 21,5% анализируемой выборки) включала 6 сиквенс-типов, среди которых заметное место занимали STMLST13759 (n=9) и STMLST1902 (n=7), в то время как STMLST14011 был представлен только одним клиническим изолятом. В свою очередь, расположенный рядом кластер GMLST14006 оказывался менее многочисленным (25 изолятов; 7,7%), объединяющим 11 сиквенс-типов. На этом фоне геногруппа GMLST1892 показала себя как вторая по численности (81 изолят; 24,8%), в составе которой значительное количество клинических изолятов относилось к STMLST14008 (n=9), STMLST6726 и STMLST13757 (по 8 изолятов каждый). Наконец, наиболее филогенетически удаленный кластер GMLST6721 имел наименьшую численность: 3 сиквенс-типа, 5 клинических изолятов.
Сравнение результатов использования двух схем молекулярного типирования для каждого из анализируемых клинических изолятов позволило определить ряд соответствий между доминирующими NG-MAST- и MLST-типами (см. рис. 2). В частности, филогенетически близким STNG-MAST1993 и STNG-MAST18947 соответствовали STMLST11177 и STMLST14009, а представители STNG-MAST14020 относились исключительно к STMLST14008. Вариантом подобного соответствия являлась принадлежность двух и более филогенетически близких NG-MAST-типов к одному MLST- типу: STMLST1594 = STNG-MAST228 и 807; STMLST1892 = STNG-MAST5742 и 9486. В то же время детальное сопоставление филогенетических дендрограмм свидетельствовало об отсутствии однозначной корреляции между результатами NG-MAST- и MLST-типирования. Так, клинические изоляты, идентифицированные как STMLST1901 при проведении NG-MAST-типирования, были отнесены к 19 отдельным сиквенс-типам (в том числе 2212, 3149, 6226 и др.), распределенным среди всех 5 выделенных геногрупп. Для 25 MLST-сиквенс-типов определено соответствие только одному NG-MAST-типу.
Секвенирование гена penA идентифицировало 11 типов данного аллеля (I, II, V, IX, XIII, XIV, XV, XVIII, XXII, XXXIV и 44), среди которых наиболее частыми являлись аллели I и XV типов [11]. Аллель XXXIV «мозаичного» типа выявлена у 7 клинических изолятов (2,1% от общей численности анализируемой выборки), в том числе 4 изолятов из Астраханской области (2 — в 2018 г. и 2 — в 2019 г.) и единичных изолятов, поступивших из Архангельской (2018 г.), Омской (2018 г.) и Калужской (2020 г.) областей.
Молекулярное типирование клинических изолятов, несущих «мозаичную» аллель гена penA, относило их к 4 NG-MAST- и 3 MLST-сиквенс-типам, сочетание которых определяло варианты STNG-MAST2212/STMLST1901 (n=1); STNG-MAST3149/STMLST1901 (n=1); STNG-MAST5622/STMLST14011 (n=1) и STNG-MAST10025/STMLST1902 (n=4). При этом NG-MAST-типы 2212, 3149 и 5622 ранее упоминались как участники глобально распространенной геногруппы GNG-MAST1407 [15], обнаруживаемые в некоторых странах ЕС [18], Австралии и Канаде [19, 20]. В свою очередь, при проведении MLST-типирования изоляты, несущие «мозаичную» аллель гена penA, традиционно описываются как представители сиквенс-типа 1901 [21], тогда как в рамках настоящего исследования это было подтверждено только для STNG-MAST2212 и STNG-MAST3149 с одновременным отнесением STNG-MAST10025 к STMLST1902, а STNG-MAST5622 — к новому сиквенс-типу STMLST14011. В то же время филогенетический анализ подтверждал сохранение тесной ассоциированности клинических изолятов, несущих «мозаичную» аллель гена penA, по результатам NG-MAST-типирования формирующих обособленную подгруппу, занимающую пограничное положение в составе геногруппы GNG-MAST1993, а по результатам MLST-типирования объединяемых в рамках геногруппы GMLST1901 (см. рис. 2).
Полученные результаты сформировали основу для частичной реконструкции молекулярной эволюции глобально распространенного клона N. gonorrhoeae NG-MAST 1407/MLST 1901, результатом которой стало его замещение множеством филогенетически связанных сиквенс-типов, в результате вертикального переноса унаследовавших от исходного варианта «мозаичную» аллель гена penA (рис. 3). При этом наиболее элементарными событиями стали одиночные нуклеотидные замены G332A и G331A в гене porB, в результате которых исходная аллель 908 стала распознаваться как 1388 и 1903, а итоговый NG-MAST-тип начал оцениваться как 2212 и 3149 с сохранением у данных изолятов исходного 1901 MLST типа. Более сложные события, включающие не только замену C338A в гене porB (аллель 3411), но и G174A в гене adk (с превращением аллели 39 в 684), явились причиной возникновения молекулярного варианта STNG-MAST5622/STMLST14011. Еще более многочисленная серия точечных мутаций (двойная нуклеотидная замена G332A и G337A в гене porB, превращающая аллель 908 в 5904; двойная нуклеотидная замена C138G и T297C в гене fumC, превращающая аллель 111 в 158) привела к появлению STNG-MAST10025/STMLST1902, отличающегося от родительского клона как по NG-MAST-, так и по MLST-типу. В настоящем исследовании мы впервые сообщаем об этом молекулярном варианте N. gonorrhoeae как причине эпидемически связанных случаев гонококковой инфекции в Астраханской области (2018—2019 гг.).
Рис. 3. Реконструкция филогении NG-MAST и MLST-типов N. gonorrhoeae, несущих «мозаичную» аллель гена penA XXXIV типа.
В рамках указаны мутационные или рекомбинационные события (снизу) и возникающие в их результате сиквенс-типы (сверху).
Таким образом, современная ситуация заключается в возникновении существенного разнообразия молекулярных типов N. gonorrhoeae, несущих «мозаичную» аллель гена penA, при формальном исчезновении из популяции сиквенс-типа STNG-MAST1407/STMLST1901, еще относительно недавно считавшегося важным маркером распространения клинических изолятов со сниженной чувствительностью к цефалоспоринам III типа.
Указанные обстоятельства затрудняют интерпретацию результатов молекулярно-генетического мониторинга, делая необходимым проведение дополнительного филогенетического анализа выявляемых сиквенс-типов. При этом более высокой предсказательной ценностью характеризуются результаты NG-MAST-типирования, отражающие «быструю» эволюцию N. gonorrhoeae и однозначно ассоциирующие известные и вновь образующиеся сиквенс-типы со сниженной чувствительностью к цефалоспоринам III типа: в исследуемой популяции все представители филогенетически связанных STNG-MAST2212, STNG-MAST3149, STNG-MAST5622 и STNG-MAST10025 несли «мозаичную» аллель гена penA. В противоположность этому результаты MLST-типирования, характеризующие «медленную» эволюцию N. gonorrhoeae (в том числе до рекомбинационного события в гене penA), не позволяют однозначно связывать определенный сиквенс-тип с наличием XXXIV аллели данного гена: среди 70 представителей STMLST1901 соответствующая генетическая особенность была обнаружена только у 2 клинических изолятов.
Альтернативным решением данной проблемы может стать использование новых систем молекулярного типирования, прямо учитывающих детерминанты резистентности к антимикробным препаратам (NG-STAR; от англ. — Neisseria gonorrhoeae sequence typing for antimicrobial resistance) [5], комплексный анализ филогении и антибиотикорезистентности на основе результатов полногеномного секвенирования [22], а также направленный анализ значимых мутаций в гене penA с использованием технологии ДНК-чипов [23].
Заключение
Результаты проведенного исследования свидетельствуют о высокой генетической изменчивости N. gonorrhoeae, лежащей в основе непрекращающейся эволюции данного бактериального вида. В частности, исследование раскрывает ряд моментов современной молекулярной эволюции возбудителя гонококковой инфекции, приведшей к появлению разнообразия NG-MAST- и MLST-сиквенс-типов N. gonorrhoeae, производных от глобально распространенного сиквенс-типа NG-MAST 1407/MLST 1901 и унаследовавших от него «мозаичную» аллель гена penA, определяющую сниженную чувствительность к цефалоспоринам III поколения. В современной выборке 2018—2020 гг. подобные варианты составили более 2% от общего количества исследованных клинических изолятов, что определяет повышенные требования к методологии проведения и интерпретации данных молекулярно-генетического мониторинга возбудителя гонококковой инфекции в Российской Федерации.
Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.
Финансирование. Молекулярное типирование N. gonorrhoeae проведено в рамках выполнения государственного задания ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России на 2021—2023 гг. №056-03-2021-124 от 14.01.21 «Мониторинг устойчивости возбудителей инфекций, передаваемых половым путем, к антимикробным препаратам в Российской Федерации»; анализ полиморфизма гена penA N. gonorrhoeae выполнен при финансовой поддержке гранта РНФ №17-75-20039 и Соглашения с Министерством науки и высшего образования РФ №075-15-2019-1660
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.