Введение
Вирус Эпштейна—Барр (ВЭБ) (Herpesviridae: Lymphocryptovirus, HHV-4) является одним из наиболее распространенных патогенов: им инфицировано около 90% населения планеты [1]. Ежегодно в Российской Федерации регистрируется около 30 тысяч случаев инфекционного мононуклеоза (первичная острая ВЭБ-инфекция), при этом на протяжении последних тридцати лет имеется тенденция к росту заболеваемости [2]. Помимо данной нозологической формы выделяют группу ВЭБ-ассоциированных заболеваний, в которую входят лимфома Беркитта, назофарингеальная карцинома, рак желудка и др. Ущерб здоровью, высокие экономические потери, сопряженные с ВЭБ-инфекцией, определяют социальную значимость и обусловливают необходимость поиска методов профилактики этой инфекции, наиболее эффективным из которых является вакцинация.
На настоящий момент в мире нет зарегистрированных вакцин против ВЭБ-инфекции. Однако к 2020 г. было разработано несколько кандидатных препаратов, рекомендованных к проведению клинических испытаний. В их состав, наряду с прочими антигенами, входит белок gp350, играющий важную роль в проникновении ВЭБ в B-клетки хозяина.
Традиционно, при разработке иммунобиологических препаратов особое внимание уделяется гетерогенности популяции возбудителя, высокая изменчивость которого может повлиять на успех прививочной кампании и будет требовать динамического обновления антигенного состава вакцин [3].
Проведенные ранее исследования свидетельствуют об относительной стабильности генома ВЭБ. При этом полногеномное секвенирование и изучение отдельных генов вируса обнаружило наличие двух основных типов — A и B, существенно отличающихся между собой по гену EBNA2 (идентичность составляет 51%) и сопряженному с ним EBNA3 (идентичность 71%) [4, 5]. Тип A является превалирующим и распространен в Европе, Азии, Северной и Южной Америке. Тип B чаще встречается на Аляске, в Папуа-Новой Гвинее и Центральной Африке (преимущественно в Кении). Также имеется инфицирование одновременно двумя типами [6—8]. Особое внимание как в России, так и за рубежом, уделяется изучению гена LMP1, кодирующему одноименный белок, который, в свою очередь, играет важную роль в ассоциированном с ВЭБ канцерогенезе [9—11]. На настоящий момент описано семь вариантов данного гена: дикий B95-8; Аляска (Ala), Китай (Ch1) и (Ch2), Средиземноморье (Med+) и (Med−), Северная Каролина (NC) [12]. Среди прочих генов ВЭБ наиболее вариабельными являются BRRF2 и BBLF2-BBLF3 [13].
Ген, кодирующий белок gp350 (BLLF1), расположен в непосредственной близости с одним из наиболее вариабельных локусов EBNA3, что, в свою очередь, может определять его изменчивость [14]. Кроме того, было показано, что от момента острой фазы первичной инфекции и до реконвалесценции (период времени составляет 6 месяцев) gp350 способен претерпевать изменения, положительно коррелирующие с высокой вирусной нагрузкой и титрами вируснейтрализующих антител [15].
Несмотря на целенаправленную работу ученых по разработке вакцин против ВЭБ, содержащих белок gp350, результаты изучения вариабельности кодирующего его гена и связь с генотипом описаны в ограниченном числе зарубежных работ [5, 14, 16, 17]. В Российской Федерации подобные исследования не проводились. Недостаток информации в этой области может негативно сказаться на успехе последующих вакцинальных кампаний.
Цель исследования — оценка вариабельности генов gp350 и EBNA2 вируса Эпштейна—Барр, выделенного из слюны персонала стоматологических клиник московского региона.
Материал и методы
В период с марта по июнь 2020 г. проведен забор биологического материала (слюны) от 105 сотрудников четырех стоматологических клиник, предоставивших информированное добровольное согласие на проведение исследования. Данное исследование не противоречит положениям биоэтики, определенных Хельсинкской декларацией. Средний возраст обследованных составил 40,96±4,2 года. Среди участников было 80 женщин и 25 мужчин. Все обследованные лица постоянно проживали на территории Московского региона (г. Москва и Московская область). Забор слюны осуществлялся в стерильные одноразовые емкости в утренние часы до первого приема пищи.
Количественное определение ДНК ВЭБ в слюне осуществляли методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в соответствии с инструкцией к набору реагентов «АмплиСенс» EBV-скрин/монитор-FL» (ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия).
Для образцов слюны, содержащих ДНК ВЭБ, проводили повторное выделение ДНК с помощью набора MagMAX DNA Multi-Sample Ultra 2.0 Kit на автоматической выделительной станции KingFisher Flex (Thermo Scientific, США) в соответствии с инструкцией к набору. Элюцию ДНК осуществляли в объеме 50 мкл с применением Elution Buffer (Roche, США). Количество тотальной ДНК в образце оценивали на приборе Qubit fluorometer с использованием набора Quanti-iT dsDNA BR Assay Kit (Invitrogen, США). Полученную ДНК использовали для амплификации фрагментов генома ВЭБ.
Генотипирование образцов по гену EBNA2 проводили с использованием ранее описанных праймеров [17]. Гнездовую ПЦР осуществляли в программируемом термостате DNA Engine Tetrad 2 (MJ Research, США). Амплифицированные продукты подвергали электрофорезу в 2% агарозном геле и определяли как тип A или B в зависимости от размера ампликона.
Для амплификации гена gp350 (2721 п.о.) использовали специфические праймеры, указанные в табл. 1. Подбор праймеров проводили с помощью программы Oligo_6.31 software (Molecular Biology Insights Inc., США), используя штамм B95-8 (GenBank номер NC_007605) в качестве референса.
Таблица 1. Праймеры для амплификации гена gp350 Human herpesvirus 4
| Праймеры | 5’-3’ последовательность | Позиция в геноме B95-8 |
| gp350-F | TAGCAAAATCTGACCCTCCGC | 89246-89266 |
| gp350-FS1 | TTTGGTGACATTAACCTCCCC | 89907-899027 |
| gp350-RS1 | ATAACACAGGTGACACCAGCC | 90030-90050 |
| gp350-FS2 | GTGAGTAGAGCTGGGTAGACC | 90795-90815 |
| gp350-RS2 | CCAAGACACTCATTATCACACG | 90934-90955 |
| gp350-FS3 | TGTCAGACGCAGGCTGTATGC | 91353-91373 |
| gp350-RS3 | AACAGAAATGCTCGGTAATGAG | 91536-91557 |
| gp350-R | ACCTATTAAAGAGGATGCTGCC | 92174-92195 |
Гнездовую ПЦР гена gp350 проводили в два раунда (табл. 2). Для реакции амплификации использовали набор IProofM High-Fidelity PCR Kit (BIO-RAD, США). В качестве матрицы для второго раунда ПЦР использовали 1 мкл продукта, полученного в первом раунде. Продукты амплификации анализировали в 1,5% агарозном геле.
Таблица 2. Схема амплификации гена gp350
| Праймер | Размер ампликона, п.о. | Матрица | Условия |
| Раунд 1: | |||
| gp350-F & gp350-RS2 | 1710 | Геномная ДНК | 98 °C — 30 с; 98 °C — 10 с, 62 °C — 30 с, 72 °C— 1 мин 30с 35 циклов |
| gp350-FS1 & gp350-R | 1401 | ||
| Раунд 2: | |||
| gp350-F & gp350-RS1 | 805 | Ампликон (gp350-F & gp350-RS2) | 98 °C — 30 с; 98 °C — 10 с, 63 °C — 20 с, 72 °C— 40 с 35 циклов |
| gp350-FS1 & gp350-RS2 | 1049 | ||
| gp350-FS2 & gp350-RS3 | 763 | Ампликон (gp350-FS2 & gp350-R) | |
| gp350-FS3 & gp350-R | 843 | ||
Определение нуклеотидной последовательности фрагментов гена gp350 выполняли модифицированным методом Сенгера [5] с использованием ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit и прибора ABI Prism 3500XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США; Hitachi, Япония) в соответствии с прилагаемыми инструкциями. Полноразмерную последовательность гена gp350 и соответствующую ему аминокислотную последовательность собирали из полученных фрагментов с использованием программного продукта Vector NTI Suite v.9 (InforMax Inc, США).
В анализ также было включено 222 сборки генома Human herpesvirus 4 из базы данных NCBI. Подготовка геномов перед аннотацией была проведена с использованием SeqKit (v2.0.0). Геномы были аннотированы с помощью prokka (v1.14.6) [18]. Затем аннотированные аминокислотные последовательности гена gp350 были получены с помощью gbseqextractor (v20201128) [19] и seqtk (v1.3-r106) (https://github.com/lh3/seqtk). MAFFT (v7.490) [20] был использован для выравнивания аминокислотных последовательностей. Наиболее подходящая модель эволюции белков (JTT+I+G4m) была выбрана с помощью ProtTest (v3.4.20) [21].
Построение филогенетического дерева максимального правдоподобия осуществлялось по наиболее консервативному N-концевому фрагменту белка gp350 с помощью RAxML-NG (v.1.0.2) [22]. Дерево было визуализировано с помощью пакетов ggtree (v3.2.0) [23] и ggtreeExtra (1.4.0) [24] для языка R (v4.1.2) — R Core Team (2021).
Результаты и обсуждение
По результатам скрининга ДНК ВЭБ в слюне выявлена у 56 из 105 обследованных лиц — 53,3% (95% доверительный интервал — ДИ 43,73—62,93). Средняя концентрация генетического материала составила 9440 копий ДНК/мл (минимальное значение — 135 копий ДНК/мл; максимальное — 13 726 417 копий ДНК/мл).
Низкая концентрация генетического материала позволила установить генотип по гену EBNA2 и полную последовательность гена gp350 для 31 образца, в том числе для 15, отобранных у медицинского персонала стоматологической клиники №1 (7 врачей и 8 специалистов со средним медицинским образованием), 8 образцов — клиники №2 (5 врачей и 3 ассистента стоматолога); 6 — клиники №3 — (2 врача и 4 ассистента стоматолога) и 2 — клиники №4 — (1 врач и 1 ассистент стоматолога).
Согласно типированию по гену EBNA2, 30 образцов отнесены к генотипу A, один образец — к генотипу B. Длина аминокислотной последовательности белка gp350 варьировала в диапазоне от 753 до 907 остатков, что связано с наличием протяженных дупликаций.
Для построения филогенетического дерева использовали первые 483 аминокислоты, соответствующие наиболее консервативному N-концевому фрагменту gp350 (рис. 1, см. https://mediasphera</strong>.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_03_038_add.zip). В филогенетический анализ были включены 31 вышеописанный российский образец и 222 образца из базы данных NCBI с установленной последовательностью белка gp350.
Филогенетический анализ выявил 3 клады. Самая крупная клада, представленная 215 образцами из наибольшего количества стран, в том числе 30 образцами из настоящего исследования, соответствовала генотипу Aa по [17] (a — схожесть последовательности gp350 с референсным штаммом B95-8 (NC_007605.1); A — генотип A по гену EBNA2). Вторая была представлена 20 образцами из Индонезии, Африки и Аргентины, а также одним образцом из России, и относилась к генотипу Bb [17] (b — схожесть gp350 с таковым у Jijoye (LN827800.1); B — генотип B по гену EBNA2). Третья клада, названная нами Ab, включала 18 образцов, преимущественно из Индонезии, а также из Папуа Новая Гвинея и США. Эти образцы имели только часть замен, отличающих последовательности gp350 в геномах Jijoye и B95-8, и тип A по гену EBNA2 (табл. 3).
Таблица 3. Различия в аминокислотной последовательности N-концевого участка gp350 (1-483 аминокислоты) в разных кладах
| Клада | Образец | Позиция | |||||||||||||
| 17 | 20 | 21 | 31 | 38 | 43 | 48 | 60 | 62 | 67 | 115 | 117 | 215 | 441 | ||
| Aa | B95-8 (NC_007605.1) | H | G | E | P | T | T | V | Q | D | Q | V | T | D | D |
| Bb | Jijoye (LN827800.1) | Q | R | D | L | A | A | K | N | L | I | — | — | A | |
| Ab | MG298890.1* | Q | R | D | — | A | I | — | — | — | — | — | A | E | — |
Примечание. * геном образца MG298890.1 был выбран в качестве типичного представителя клады.
Детальный анализ 30 российских образцов генотипа Aa выявил их равномерное распределение по филогенетическому дереву, при этом часть образцов были идентичны по N-концевому фрагменту gp350 (табл. 4):
Таблица 4. Выравнивание полной аминокислотной последовательности белка gp350
| Профиль | Образец | позиция в аминокислотной последовательности белка gp350 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||
| N-конец | Гипервариабельная область | С-конец | |||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 72 | 118 | 201 | 228 | 341 | 352-353 | 354 | 384 | 397 | 422 | 441 | 482 | 490-641 | 642 | 649 | 657 | 666 | 671 | 672 | 676-684 | 710 | 712 | 733 | 754 | 766 | 768 | 794 | 799 | 805 | 812 | 813 | 821 | 851 | 853 | 885 | 887 | ||
| B95-8 NC_007605 | T | G | E | F | A | W | A | G | S | D | T | Q | A | I | S | S | N | I | T | P | Q | K | A | R | P | G | P | R | P | T | Q | F | R | ||||
| 1 | dcs1-B3 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | del 512-560, del 593-613 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – |
| 2 | dcs1-B5 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | del 507-520, del 593-613 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – |
| 3 | dcs2-D5 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | del 512-560, del 593-613 | – | – | – | – | – | – | – | – | P | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – |
| 4 | dcs1-D8 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | del 490-643 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – |
| 5 | dcs1-C7 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | del 593-613 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – |
| 5 | dcs1-C8 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | del 593-613 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – |
| 6 | dcs1-C4 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | del 540-560, del 593-613 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | K | – | – |
| 6 | dcs1-C5 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | del 540-560, del 593-613 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | K | – | – |
| 7 | dcs1-B6 | – | – | Q | – | – | – | – | V | A | – | A | – | del 593-613 | P | – | – | – | – | I | – | T | – | L | – | – | E | – | – | D | – | I | – | – | – | – | – |
| 8 | dcs1-B7 | – | – | Q | – | – | – | – | V | A | – | A | – | del 593-613 | P | – | – | – | – | I | – | T | – | L | – | – | – | W | – | — 8 образцов имели профиль, идентичный референсному американскому штамму B95-8 (дополнительно такой же профиль имели 33 образца из 12 стран); — 13 образцов содержали замены E201Q, A384V, G397A и D441A относительно B95-8 (20 образцов из 4 стран имели идентичный профиль); — 2 образца в дополнение к описанным заменам содержали T72M, S422L и T482P (7 образцов из 3 стран имели идентичный профиль). В свою очередь, оставшиеся 7 российских образцов имели уникальные мутационные профили, причем для 3 образцов были обнаружены замены, не выявленные в других образцах из NCBI (см. табл. 4). Для поиска возможных дополнительных особенностей российских образцов генотипа Aa, было проведено выравнивание всей аминокислотной последовательности белка gp350, включающей описанный выше N-концевой фрагмент, гипервариабельный регион и С-концевой фрагмент (см. табл. 4). В гипервариабельной области, соответствующей региону сплайсинга гена, были обнаружены делеции и инсерции размером от 20 до 153 аминокислот, которые обусловили вариативность размера белка. В области С-концевого фрагмента были выявлены замены как встречающиеся в коллекции образцов из NCBI, так и присутствующие только в российских изолятах. Таким образом, суммарно для 30 российских образцов генотипа Aa было обнаружено 22 индивидуальных профиля, 15 уникальных мутаций и одна делеция, не имеющие аналогов в NCBI. Сравнение идентичных мутационных профилей gp350 в образцах медицинского персонала с профессиональными контактами показало, что наиболее часто встречающийся профиль «13» имели 2 сотрудника клиники №1, 3 сотрудника клиники №2 и по одному сотруднику в клиниках №3 и №4. Два сотрудника клиники №1 (врач и ассистент стоматолога, работающие в паре) имели профиль «5», отличающийся от B95-8 только делецией del593-613 в гипервариабельном регионе. Профиль «6» с уникальной мутацией Q853K обнаружен у работающих в паре врача и ассистента стоматолога этой же клиники. Лица с уникальными мутационными профилями gp350 были выявлены во всех 4 клиниках. Выбор контингента для настоящего исследования обоснован наличием профессиональных контактов медицинского персонала стоматологических клиник с большим числом потенциальных источников инфекции. Расположение рабочего места в непосредственной близости от органов дыхания пациента, контакт с биологическими жидкостями (слюна, кровь) и их аэрозолями, высокая частота присутствия ВЭБ в слюне лиц с патологией зубов и пародонта [25, 26] являются идеальными условиями для реализации основного механизма передачи вируса [27]. Поскольку первая встреча с ВЭБ происходит преимущественно в детском и подростковом возрасте, серопревалентность лиц старше 18 лет достигает 90% и выше [28]. Данные о том, что у одного индивидуума могут одновременно присутствовать несколько генетических вариантов ВЭБ [14], свидетельствуют о возможности суперинфицирования, риск которого у медицинского персонала стоматологических клиник наиболее высок. Высокая частота обнаружения у данной группы лиц генетического материала ВЭБ в слюне (53,3%) может быть следствием как реактивации хронической латентной, так и течения первичной острой ВЭБ-инфекции при инфицировании новым вариантом вируса. Проведенное исследование показало, что последовательность гена gp350 ВЭБ в обследованной популяции в лице персонала стоматологических клиник схожа с таковой для других регионов мира, о чем свидетельствует сопоставление собственных результатов секвенирования с данными полногеномного секвенирования для 222 образцов из международной базы данных NCBI. Анализ положения российских образцов на филогенетическом дереве обнаружил, что они не образуют отдельной клады, а равномерно распределены по всему дереву. При этом подавляющее количество образцов относится к генотипу Aa (30 шт.), а единственный образец генотипа Bb содержал аминокислотную замену T117A относительно африканского штамма Jijoye, являющегося типичным представителем генотипа Bb. Полученные данные подтверждают как значительно более редкую встречаемость генотипа Bb, так и взаимосвязь изменений гена EBNA2 и N-концевого фрагмента гена gp350 [14, 17]. В свою очередь, проведенный филогенетический анализ позволил выявить третью кладу, названную нами Ab (см. рис. 1, см. https://mediasphera</strong>.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_03_038_add.zip). Образцы, относящиеся к выделенной кладе, были впервые обнаружены S. Correa и соавт. [5, 14], но не обособлены в отдельную группу. Их отличительной особенностью является генотип A гена EBNA2 и частичный профиль b гена gp350 (см. табл. 3). При этом совпадение четырех мутаций со штаммом Jijoye в N-конце гена gp350 позволяет нам предположить, что вариант Ab является эволюционным предшественником варианта Bb. Анализ выравнивания последовательностей gp350 для российских образцов генотипа Aa обнаружил высокий удельный вес персонала стоматологических клиник, имеющих индивидуальные мутационные профили и уникальные мутации, что может быть обусловлено как изменчивостью исходного возбудителя, реализующейся в периоды активной репродукции ВЭБ [15], так и постоянным суперинфицированием новыми вариантами вируса [14]. В пользу последнего свидетельствует обнаружение идентичных уникальных мутаций у сотрудников, состоящих в тесном профессиональном контакте. При этом следует отметить, что исследуемые образцы с генотипом Aa не несли замен в сайтах связывания поверхностного гликопротеина gp350 с CD-21 рецепторами B-клеток, расположенными на N-конце белка (пептид 1 (аминокислоты 16—29), пептид 2 (аминокислоты 142—161) и пептид 3 (аминокислоты 282—301)), тогда как единственный образец с генотипом Bb имел 3 замены в пептиде 1. ЗаключениеТаким образом, ДНК ВЭБ, выделенная от жителей столичного региона Российской Федерации, имеет существенное сходство по генам EBNA2 и gp350 со штаммами из других регионов мира. При этом наличие уникальных мутаций и делеций, отсутствующих в базе данных NCBI, а также эпидемиологической взаимосвязи обследованных лиц требует индивидуального подхода к организации и проведению профилактических и противоэпидемических мероприятий, включая разработку вакцин. Соблюдение этических стандартов Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием животных в качестве объектов. Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическими стандартам локального совета по этике ФГБНУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» (выписка из протокола №1 от 23.03.21) и Хельсинкской декларации и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики. От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Подтверждение e-mail На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте. Подтверждение e-mail Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь. | |||||||