Классификация, распространение и опасность флавивирусов для человека

Представители рода Flavivirus семейства Flaviviridae (от лат. Flavus — желтый) являются классическими арбовирусами (arthropod-borne virus), передающимися путем биологической трансмиссии восприимчивым позвоночным кровососущими членистоногими переносчиками — комарами или клещами [1, 2]. По данным Международного комитета по таксономии вирусов (International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV) на июль 2018 г. в род Flavivirus включено 53 вида, разделенных на 10 антигенных комплексов [3, 4].

Наиболее изученными вследствие их патогенности для человека являются вирусы 4 антигенных комплексов: желтой лихорадки (Yellow fever virus, YFV), японского энцефалита (Japanese encephalitis virus, JEV), клещевого энцефалита (Tick-borne encephalitis virus, TBEV) и денге (dengue virus, DENV). Вирус Зика (Zika virus, ZIKV), представитель антигенного комплекса вируса Spodweni, экологически африканский зооноз, ранее считавшийся не опасным для человека, недавно вызвал эпидемию на Американском континенте, при этом регистрировались случаи передачи возбудителя половым путем, что является уникальным свойством для арбовируса [5]. Симптоматическая инфекция, вызванная DENV, в мире ежегодно проявляется у 390 млн человек [4]. Вирус Западного Нила (WNV) принадлежит антигенному комплексу японского энцефалита. С 2013 г. ежегодно в США лихорадкой Западного Нила (ЛЗН) заражаются в среднем 2 тыс. человек, при этом больше 50% случаев приходится на тяжелые нейроинвазивные формы инфекции [6—10]. По данным сайта CDC (centers for disease control and prevention), в 2019 г. было зарегистрировано 917 случаев [11].

В ряде европейских стран, России, Казахстане, Монголии и Китае клещевым энцефалитом, вызванным TBEV, по разным оценкам, ежегодно заболевают от 6 до 12 тыс. человек, причем более половины случаев приходится на территорию РФ [12]. JEV является причиной энцефалитов, абортов и мертворождений у свиней, а также серьезной проблемой здравоохранения в странах Азии, так как при пассировании через этих животных может происходить увеличение вирулентности возбудителя [13]. На территории РФ одновременно циркулирует несколько флавивирусов, и некоторые из них имеют перекрывающиеся географические ареалы: TBEV (европейский, сибирский, дальневосточный субтипы на одноименных территориях), появляются (филогенетически идентифицируются) новые субтипы TBEV; вирус Омской геморрагической лихорадки (Omsk hemorrhagic fever virus, OHFV, антигенный комплекс TBEV) в Омской, Тюменской, Оренбургской, Курганской областях; JEV и вирус Повассан (POWV) на Дальнем Востоке. ЛЗН была занесена перелетными птицами из Африки на побережье Каспийского моря, где сформировались стойкие природные очаги по типу: птицы — вирус — комар — дикие и домашние животные [1]. В 2016 г. циркуляция (обнаружение маркеров) WNV в носителях выявлена в 10 субъектах РФ, а наличие специфических IgG антител у здоровых групп населения в 30 территориальных субъектах. В 2017 г. в США случаи WNV стали единичными, а на территории стран членов Европейского Союза, в России и Канаде наоборот наметилась тенденция к росту заболеваемости населения [9]. ZIKV и DENV попадают в нашу страну с заболевшими туристами, возвращающимися из эндемичных территорий.

Флавивирусы вызывают у человека болезни от бессимптомных форм и легких лихорадок до геморрагических проявлений и неврологических расстройств в виде энцефалита, менингита, менингоэнцефалита и миелита. Геморрагическая форма лихорадки денге (ЛД) с высокой летальностью (до 50%) развивается у 20—25% заболевших [1, 4, 14]. Описано внутриутробное инфицирование для ZIKV, DENV и WNV. При трансфузии также есть вероятность заражения этими патогенами. При заражении ZIKV у взрослых людей может развиться острая иммуноопосредованная полирадикулоневропатия (синдром Гийена-Барре). При внутриутробном инфицировании ZIKV у плода развивается микроцефалия [15].

Проблемы разработки профилактических препаратов

В настоящее время основным подходом для профилактики вирусных инфекций является использование вакцин. Однако в случае с флавивирусами этот подход имеет ограниченную эффективность. Прямая аттенуация большинства флавивирусов невозможна из-за их высокой нейровирулентности для человека. Единственной лицензированной вакциной с живым флавивирусом является широко используемая вакцина на основе аттенуированного штамма 17D YFV, который был получен при серийном пассировании штамма Asibi дикого типа YFV в тканях куриного эмбриона [16]. Создано ограниченное число разрешенных к применению инактивированных вакцин против JEV и TBEV. При конструировании и исследовании кандидатных вакцин против флавивирусов было установлено, что их защитная эффективность в большинстве случаев опосредуется индуцированными антителами, специфичными к домену III структурного гликопротеина Е [17]. Одним из основных подходов для борьбы с вирусными инфекциями является использование сывороточной терапии. Однако для флавивирусов этот подход также имеет ряд ограничений. Сырьевая база для получения специфических иммуноглобулинов из препаратов донорской крови всегда ограничена [12]. Большой проблемой является феномен антитело-зависимого усиления инфекции (antybody-dependent enhancement (ADE)), характерный для некоторых флавивирусных инфекций [18—20].

Получение моноклональных антител

Одним из главных компонентов защитного иммунитета против любой инфекции являются поликлональные сывороточные антитела, нейтрализующие патоген. Они выполняют свои биологические функции через сложную смесь моноклональных антител (МКА) [20]. Получение мышиных МКА с необходимыми для исследователей характеристиками стало возможным после разработки гибридомной технологии в 1975 г. [21]. Использование гибридомных мышиных МКА для терапии ограничено вследствие их высокой иммуногенности и неспособности выполнять эффекторные функции в организме человека. Эти недостатки в значительной степени устраняются созданием рекомбинантных химерных (мышь/человек) или даже полностью «очеловеченных» гуманизированных МКА [22]. Для разработки потенциально терапевтических препаратов выбирают исходное «родительское» МКА, обладающее высокой нейтрализующей активностью in vitro на чувствительных культурах клеток и желательно in vivo на животных моделях [12, 23—26]. В последние годы активно развиваются новые технологии по созданию рекомбинантных МКА с использованием B-клеток периферической крови переболевших людей [27—30].

МКА, специфичные к YFV

Отличительной особенностью YFV является то, что против него создана эффективная живая аттенуированная вакцина. Это, с одной стороны, снижает актуальность получения специфичных МКА, а с другой стороны, дает удобный инструмент для индукции гуморального иммунитета. Использование вакцинного штамма снижает требования к уровню биобезопасности работ, значительно снижая стоимость работ и трудозатраты. В настоящее время описаны МКА против YFV, полученные на основе разнообразия иммуноглобулинов мышей [31] и людей, иммунизированных вакциной 17D-20, мышей, иммунизированных французской нейротропной вакциной (FNV), и мышей, иммунизированных штаммом дикого типа (WT) Asibi, что позволяет дифференцировать эпитопы на белке E, специфичные для вакцины и натуральной инфекции. FNV была получена из штамма вируса французского YF дикого типа, параллельно разработанного с 17D, но ее применение было прекращено из-за поствакцинальных серьезных побочных эффектов (SAE), в частности, энцефалита [32]. Мышиный гуморальный иммунитет к YFV обычно направлен на домен III белка E, тогда как исследования реакции человека на YFV подтверждают, что человеческие антитела чаще всего направлены на домен II белка E [31].

На модели инбредных мышей линии AG129, дефицитных по рецепторам интерферона α и β, было показано, что гуманизированные МКА, полученные на основе IgG, обладают большей эффективностью профилактики и терапии при лихорадке YFV по сравнению с МКА на основе IgM (таблица). В частности, на основе YFV-реактивного мышиного антитела класса IgG — 2C9 были разработаны химерные МКА человека/мыши, способные защищать мышей от летальной инфекции YFV [33].

Таблица. Моноклональные антитела против флавивирусов, обладающие терапевтическим потенциалом

Примечание. Таблица дополнена и составлена на основе данных [37]: *1 — белок E; 2 — домен III белка E; 3 — боковой гребень домена III белка E; 4 — шарнир между доменами I и II белка E; 5 — четвертичный эпитоп на внутренней стороне поверхностей соседних двух димеров белка E; 6 — домен II белка E; 7 — петля слияния домена II белка E; 8 — белок NS1. **1 — преклинические испытания на мышах; 2 — на обезьянах; 3 — на хомяках.

Согласно информации ClinicalTrials.gov, один препарат на основе моноклонального антитела TY014, разработанного компанией Tychan (Сингапур), находится в фазе I клинических испытаний [34]. TY014 способно нейтрализовать широкий спектр штаммов YFV за счет связывания с эпитопом в составе белка E вируса [35] (см. таблицу).

МКА, специфичные к DENV

С использованием панели из 15 мышиных МКА, специфичных к DENV2, было показано, что эпитопы протективных антител в основном входят в состав домена III белка E. Эти результаты дали первые прямые доказательства того, что домен III белка E флавивирусов содержит первичный рецептор-связывающий мотив. На основе выявленной биологической активности МКА была составлена карта эпитопов этого домена. Оказалось, что в районах 1-120, 1-400 и 300-400 аминокислотных остатков (а.о.) локализованы пространственно-независимые эпитопы, вызывающие синтез антител, обладающих наиболее высокой нейтрализующей активностью в отношении вируса и блокирующих гемагглютинацию. С помощью синтетических пептидов для одного из МКА (10A4D-2) была проведена точная локализация эпитопа, в районе 333-351 а.о. [36]. Результаты эпитопного картирования иммунодоминантного антигена — белка E с помощью рекомбинантных белков или пептидов, моделирующих разные участки его а.о., а также препаратов двух сотен мышиных МКА, специфичных к DENV, подтвердили, что большинство нейтрализующих видоспецифичных антител направлены к домену III белка E, а группореактивные МКА (т.е. специфичные к нескольким вирусам одной антигенной группы) в первую очередь распознают высококонсервативные участки а.о. в петле слияния домена II этого белка [4]. Рентгеноструктурный анализ эпитопов белка E также показал, что антигенные детерминанты, вызывающие синтез нейтрализующих антител, локализованы в разных областях домена III белка E. Пять мышиных МКА проявляли нейтрализующую активность in vitro на культурах клеток Vero (клетки почки африканской зеленой мартышки) и BHK21 (клетки почки новорожденного сирийского хомячка) в концентрации 5 нг/мл против всех 5 генотипов серотипа DENV1. Два МКА (DENV1-Е105 и DENV1-Е106) при введении профилактической разовой дозы антител 500 мкг/мышь за сутки до внутриутробного заражения препаратом DENV1 с инфекционным титром 10⁶ БОЕ/мл защищали от гибели инбредных мышей линии С57BL/6, иммунодефицитных по нескольким иммунологическим параметрам (например, с недостаточностью антителообразования) [37], что позволяет отнести их к группе потенциально терапевтических [38] (см. таблицу).

При иммунизации мышей термически инактивированным DENV2 при помощи гибридомной технологии был получен ряд МКА. Одно из полученных МКА, 2А10G6, распознающее высококонсервативный мотив 98DRXW101 а.о. в составе домена II белка E, оказалось способно нейтрализовать не только DENV 4 серотипов, но и другие патогенные для человека флавивирусы, такие как ZIKV, YFV, WNV, JEV и TBEV [39]. Результаты исследований МКА 2А10G6 in vitro на культуре клеток BHK21 и in vivo при внутрибрюшинном заражении мышей линии AG129 показали их потенциально терапевтические свойства [36, 37] (см. таблицу).

На основе нуклеотидных последовательностей, кодирующих вариабельные домены тяжелой и легкой цепей мышиных МКА 4F11, нейтрализующих все 4 серотипа DENV, были получены рекомбинантные химерные Fab-фрагменты антител. Кристаллографический анализ комплексов МКА с доменом III белка E позволил выявить эпитоп в районе 296-400 а.о., который является детерминантой перекрестной активности для всех серотипов DENV. Препарат химерных МКА 4F11 не вызывал эффекта ADE на линии клеток гепатокарциномы человека (Huh7) при их инфицировании DENV2 [26]. На основе МКА 4F11 в 2 этапа было создано гуманизированное МКА 513, которое в настоящее время проходит I фазу клинических испытаний [40] (см. таблицу).

Для поиска антител 1A5 и 5H2 использовали аффинную селекцию из фаговой библиотеки Fab-фрагментов, полученной на основе костного мозга шимпанзе, подкожно инфицированного одновременно четырьмя серотипами DENV (с инфекционным титром каждого вируса — 10⁶ БОЕ/мл). Гуманизированные МКА 1A5 класса IgG, специфичные к последовательности а.о. петли слияния домена II белка E, способны нейтрализовать 500 БОЕ/мл всех 4 серотипов DENV и WNV в концентрации: 0,48 и 0,95 мкг/мл на культуре клеток Vero для DENV1 и DENV2, от 3,2 до 4,2 мкг/мл для DENV3, DENV4 и WNV, соответственно [41]. Гуманизированные МКА 5H2 при внутрибрюшинном введении в концентрации 20 мкг/мышь на 50% защищали 4-суточных сосунков линии Balb/c (с нормальной иммунной системой) от инфекции при заражении их 25-кратной 50% летальной дозой (LD50) нейровирулентного штамма H241 DENV4. Взрослые обезьяны вида Macaca mulatta, которые получили препарат МКА 5H2 (вариант deltaD с делециями а.о. в Fc-регионе) внутривенно в концентрации 2 мг/кг массы тела за сутки до подкожного инфицирования, оказались полностью защищены от летальной инфекции, вызванной DENV4, с отсутствием виремии [28].

Изучение специфичности рекомбинантных человеческих МКА, полученных на основе мРНК периферических мононуклеаров (плазматических клеток) 8 пациентов, показало что их предпочтительной мишенью является петля слияния домена II либо эпитопы на стыке второго и третьего доменов [42].

МКА 1C19, найденное на основе иммунного разнообразия антител пациента после вторичной инфекции DENV, взаимодействует с уникальным эпитопом (петля ВС), имеющимся у всех серотипов DENV. Для получения этого МКА была использована иммортализация B-лимфоцитов с использованием вируса Эпштейна-Барр, включающая инфицирование вирусом EB популяции B-лимфоцитов и культивирование в течение 4 недель линий лимфобластоидных клеток, являющихся потомством единичных B-лимфоцитов [43]. Эпитоп МКА 1C19 расположен в домене II белка E и состоит из 3 а.о. — G78, E79, R73 [27]. МКА 1C19 можно отнести к потенциально терапевтическим (см. таблицу), так как они способны уменьшать репликацию DENV2 при относительно низкой дозе — 20 мкг на одно животное (приблизительно 0,8 мг/кг массы тела) при исследовании на мышах линии AG129 [27, 36].

Кристаллографический анализ Fab-фрагментов рекомбинантного человеческого МКА 1A1D-2, нейтрализующего 3 серотипа DENV in vitro на культуре клеток Vero при 37 °C, позволил обнаружить, что вирус находится в динамическом состоянии, кратковременно открывая скрытые эпитопы на домене III в 2 из 3 молекул белка E в каждом из 60 икосаэдрических единиц [44]. Нейтрализующие рекомбинантные МКА 2D22, полученные после иммортализации вирусом Эпштейна-Барр B-клеток человека с первичной инфекцией DENV2 по данным криоэлектронной микроскопии, блокируют ²/₃ молекул белка E. Введение препарата МКА 2D22 иммунодефицитным мышам линии AG129 за 24 ч до или после инфицирования в концентрации 20—50 мкг/мышь позволяло предотвратить развитие летального заболевания этих животных и не вызывало эффекта ADE [45]. Показано, что препарат рекомбинантного человеческого МКА HM14c10, специфичного в отношении конформационного эпитопа, образованного внутренней стороной поверхности двух соседних димеров белка E DENV1, обладает противовирусной активностью при пикомолярных концентрациях и может рассматриваться в качестве потенциально терапевтического [46] (см. таблицу). Использование VLPs, несущих на своей поверхности аналоги вирусных белков DENV2, а также фаговой пептидной библиотеки, позволило картировать эпитоп нейтрализующего МКА DB32-6, узнающего домен III белка E и не обладающего эффектом ADE. Препараты МКА обеспечивали защиту аутбредных мышей линии ICR от летальной дозы DENV2 (10⁵ БОЕ/мл) при их внутрибрюшинном инфицировании (см. таблицу) [47].

При исследовании более 300 человеческих МКА, специфичных к DENV, было обнаружено, что в отличие от репертуара мышиных МКА, в основном специфичных к домену III, среди человеческих преобладают антитела, специфичные в отношении домена II белка E [4]. Для конструирования биспецифического МКА, способного одновременно нейтрализовать рецепторно-связывающий эпитоп на домене III (305-312 а.о.) и петлю слияния на эпитопе II белка E (98, 99 и 101 а.о.) всех 4 серотипов DENV без эффекта ADE [48], были использованы 2 человеческих рекомбинантных МКА, каждое из которых моноспецифично к одному из этих эпитопов — 1А1D [44] и 2А10G6 [39]. В результате полученное биспецифическое МКА сохранило антигенсвязывающую активность обоих родительских антител. Было продемонстрировано, что МКА оказалось значительно более эффективно при нейтрализации DENV, чем его родительские антитела, как in vitro, так и in vivo, и даже лучше, чем их комбинация [48].

По данным Clinical Trials.gov, одно человеческое моноклональное антитело AV-1 проходит клинические испытания в качестве средства противодействия лихорадки денге [49] (см. таблицу).

МКА, специфичные к JEV

Показано, что культивирование in vitro двух индийских штаммов JEV (733913 и 755468, изолированных от людей) в присутствии мышиных нейтрализующих МКА, приводило к изменениям эпитопного профиля вирусных белков [50].

Fab-фрагменты JEV-специфических антител были отобраны из фаговой библиотеки антител, полученной на основе репертуара B-клеток шимпанзе, предварительно иммунизированных инактивированным вирусом, а затем препаратом аттенуированного штамма. Из 11 МКА три, названные как Fabs A3, B2 и E3, обладали особенно высокой нейтрализующей активностью in vitro на культуре клеток Vero и реагировали с конформационными эпитопами, состоящими из а.о. трех доменов (I, II и III) гликопротеина E. Основной детерминантой для Fab A3 были а.о. — Lys (179) (домен I), для Fab B2 — Ile (126) (домен II), а для Fab E3 — Gly (302) (домен III), соответственно, что может указывать на различные механизмы нейтрализации вируса антителами. Гуманизированные версии нейтрализующих обезьяньих МКА, полученные при помощи транзиентной экспрессии в клетках 293T (культура клеток почки эмбриона человека), также были высоко активны на модели энцефалита у 4-недельных инбредных мышей линии ddy при их инфицировании JEV. Наиболее эффективным среди них был Fab B2, который обеспечивал 50%-ную защиту при концентрации 0,84 мкг, затем Fab A3 (5,8 мкг) и Fabs E3 (24,7 мкг). Введение 200 мкг/мышь Fab B2 через сутки после введения смертельной дозы JEV обеспечило 50% защиту (от общего количества животных) и значительно продлевало среднее время выживания по сравнению с мышами в контрольной группе, что указывает на терапевтический потенциал этих антител [51].

МКА, специфичные к WNV

МКА 9Е2, способное с высокой эффективностью нейтрализовать WNV, было получено при помощи гибридомной технологии [52]. Мишенью этого антитела является эпитоп в составе домена III поверхностного белка E. На основе вариабельных цепей мышиного МКА 9Е2 удалось сконструировать одноцепочечное антитело scFv9E2 и химерное МКА Fc9E2 мышь/человек, которые сохранили специфичность и нейтрализующую активность «родительского» МКА in vitro [24].

С использованием гибридомной технологии удалось получить еще одно антитело, Е16, эффективно нейтрализующее WNV. Химерное (мышь/человек) МКА E16 при однократном введении в дозе 100 мкг мышам линии C57BL/6J обладало терапевтическим эффектом [53, 54]. Показано, что Fab-фрагмент МКА E16 связывается с эпитопом, состоящим из 16 а.о., расположенных в 4 петлях домена III гликопротеина E. Этот эпитоп представлен на поверхности зрелого вириона и МКА E16 при взаимодействии блокирует конформационные перестройки белка E, необходимые для прикрепления к клетке [55]. С использованием МКА E16 [53] и мышиных МКА E53, специфичных к труднодоступному эпитопу в петле слияния домена II белка E зрелого вириона [56], а также сывороток крови людей, вакцинированных рекомбинантной вакциной против WNV, было показано, что активность нейтрализующих антител зависит от количества иммуноглобулиновых молекул на один вирион (антител должно быть не менее 30), а также от времени и температуры, влияющих на сродство антител к эпитопу [57]. На основе МКА E16 было создано рекомбинантное гуманизированное МКА MGAWN1, которое прошло 1 фазу клинических исследований на людях [58—60].

Более 120 человеческих МКА, специфичных в отношении белка E, были получены при помощи технологии фагового дисплея на основе разнообразия антител лимфоцитов сыворотки крови 3 пациентов, переболевших ЛЗН [29]. Методом конкурентного ИФА было определено, что из E-специфичных МКА 47% и 8% узнают домен II и домен III этого белка соответственно. Анализ репертуара человеческих МКА, синтезированных в течение естественной инфекции, показал, что преобладают не нейтрализующие или слабо нейтрализующие антитела, узнающие домен II, в то время как МКА, связывающие домен III и способные с высокой эффективностью нейтрализовать вирус in vitro и in vivo (на мышах), встречаются очень редко [61]. Три человеческих МКА (CR4374, CR4354 и CR4348) нейтрализовали WNV (штамм NY-99), блокируя эпитопы на интактных вирионах in vitro на клетках Vero и BHK-21. Введение МКА в концентрации 50 мкг/мышь 4-недельным аутбредным мышам линии Swiss за сутки до инфицирования способствовало полной защите животных от гибели [29, 57].

Недавно группа исследователей из США [63] выделила 10 МКА от людей, инфицированных WNV. Антитело WNV-86 нейтрализовало WNV с 50%-ной ингибирующей концентрацией (IC50) 2 нг/мл. WNV-86 распознает эпитоп в составе домена II поверхностного белка E и предпочтительно взаимодействует со зрелыми вирионами, лишенными нерасщепленной формы мембранного белка (prM), в отличие от большинства специфических для флавивируса антител.

Анализ результатов нескольких исследований по антигенной структуре WNV [53, 55, 64] показал, что эпитопы на петле домена III гликопротеина E (а.о. в позициях 302-309 и 330-333) играют доминирующую роль в нейтрализации вируса.

Также в литературе описаны мышиные антитела 3C7 и 4D1, которые нейтрализуют WNV, связываясь при этом с белком NS1. Используя фаговые пептидные библиотеки, определили эпитопную специфичность этих антител. Анализ позволил выявить 2 линейных эпитопа, узнаваемых этими МКА 3C7 и 4D1, — 896TATTEK901 и 925VVDGPETKEC934 соответственно. Найденные пептиды взаимодействовали в иммуноблоттинге с антителами сывороток крови лошадей, переболевших WNV, что может говорить об их иммуногенности во время естественной инфекции [65]. Из 22 мышиных МКА, полученных к рекомбинантному белку NS1 WNV, 4 защищали 6-недельных мышей линии С57BL/6 при введении антител до заражения. Выживаемость составила от 75 до 95% в зависимости от концентрации МКА. Вирусологический анализ показал, что одно МКА 17NS1 защищало животных на ранней стадии инфекции через C1q-комплементнезависимый и Fcγ рецепторзависимый пути, а другое МКА 14NS1 — только через C1q-комплементнезависимый путь. Эти данные свидетельствуют о том, что различные области неструктурного белка NS1 могут вызывать протективный гуморальный иммунитет против WNV при помощи различных механизмов [66].

МКА, специфичные к TBEV

Полноразмерные химерные (мышь/человек) МКА 14D5, специфичные к домену III белка E TBEV, в концентрации 10 мг/мышь на 100% защищали мышей-подростков линии Balb/c (масса тела 10 г) от 240 LD50 при введении через 24 ч после заражения их TBEV. Кроме того, протективная активность химерных МКА была выше по сравнению с активностью лицензированного препарата человеческих IgG, используемых для профилактики и лечения клещевого энцефалита [12]. Результаты по нейтрализации TBEV in vitro на культуре клеток Vero показали, что характеристики химерных одноцепочечных МКА13D6 аналогичны «родительским» мышиным гибридомным МКА, специфичным к нативному белку E TBEV. Это позволяет предположить, что одноцепочечное МКА13D6 можно использовать для профилактики и терапии клещевого энцефалита [25].

МКА, специфичные к ZIKV

Рекомбинантные химерные (мышь/человек) МКА ZV54 и ZV67, специфичные к 3 пространственно удаленным эпитопам домена III, in vitro не вызывали эффекта ADE на культуре опухолевых клеток человека (K562), а также нейтрализовали африканские, азиатские и американские штаммы ZIKV на культуре клеток Vero. Химерные антитела при внутрибрюшинном введении в концентрации 250 мкг/мышь за сутки до заражения мышей линии C57BL/6 (возраст 4—5 недель) оказались способны защитить животных от подкожного инфицирования ZIKV. Для заражения использовали дозу 10⁵ БОЕ/мл штамма Dakar, адаптированного к мышам [67] (см. таблицу).

Внутрибрюшинное введение беременным мышам линии C57BL/6 сыворотки крови человека, переболевшего лихорадкой Зика, способствовало подавлению репликации ZIKV [68]. Ряд антител, нейтрализующих ZIKV, был получен после сортировки B-клеток переболевшего человека с их последующей трансформацией вирусом Эпштейна-Барр. На основе последовательностей, кодирующих вариабельные домены антител, показавших нейтрализацию, были получены рекомбинантные человеческие МКА. Одно из МКА, ZIKV-117, обладающее наибольшей широтой нейтрализации штаммов ZIKV, оказалось специфичным к уникальному эпитопу на внутренней стороне поверхностей двух соседних димеров белка E [30]. Внутрибрюшинное введение МКА ZIKV-117 (100 мкг/мышь до заражения или 250 мкг/мышь после заражения) способствовало защите беременных и небеременных мышей линии C57BL/6 от инфицирования при подкожном введении 10³ БОЕ/мл адаптированного к мышам ZIKV, штамм Dakar. Было отмечено уменьшение патологии тканей, отсутствие плацентарной и фетальной инфекции и смертности мышей [69], что позволяет считать МКА ZIKV-117 потенциально терапевтическим (см. таблицу). Рекомбинантное человеческое МКА EDE1-B10, специфичное к эпитопу на внутренней стороне поверхностей двух соседних димеров белка E, нейтрализовало in vitro на культуре клеток Vero 2 вируса (DENV и ZIKV) и не вызывало эффекта ADE на культуре клеток миеломоноцитарного лейкоза (U937). На 4-5-недельных мышах линии C57BL/6 показана его способность защищать от ZIKV (штамм Dakar в титре 10³ БОЕ/мл при подкожном инфицировании в подушечки лап) [68]. Полученные результаты позволяют отнести это МКА к ряду потенциально терапевтических (см. таблицу).

Резкий подъем заболеваемости ZIKV в 2015 г. в Южной и Центральной Америке стал стимулом разработки большого числа моноклональных антител против этого инфекционного агента. По данным авторов [38], целый ряд таких антител обладают терапевтическим потенциалом: МКА Z23 и Z3L1, специфичные в отношении конформационных эпитопов, образуемых а.о. доменов I, II и III гликопротеина E ZIKV [69]; МКА Z004, специфичные в отношении участка бокового гребня домена III белка E [70]; МКА ZK2B10, взаимодействующие с доменом III белка E [20]; МКА m301 и m302, специфичные в отношении криптического эпитопа в составе домена III в С-С’ петле белка E [71] (см. таблицу). Биспецифическое рекомбинантное МКА FIT-1 сохраняло высокие потенции двух «родительских» нейтрализующих человеческих МКА ZKA190 и ZKA185, специфичных к домену III и II, соответственно, in vitro на культуре клеток Vero и in vivo на мышах линии A129 (с фенотипом IFN- α/β рецептор^–/–), предотвращали образование вирусных мутантов, ускользающих от нейтрализующего действия антител, и не являлись причиной ADE при исследовании на культуре клеток К562 [72]. За исключением одного МКА, Tyzivumab, которое в настоящее время проходит тестирование на безопасность в клинических испытаниях фазы I [73], большинство вышеперечисленных МКА находятся на стадии доклинических исследований [74].

Недавно описано получение рекомбинантных человеческих МКА AA12, специфичных к белку NS1. Препарат МКА не вызывал эффекта ADE in vitro на культуре клеток К562. В концентрации 10—20 мг/кг массы тела это антитело защищало мышей линии B6. 129 генотипа Stat2-/-, иммунодефицитных по рецептору γ интерферона, от летальных доз африканских и азиатских штаммов ZIKV при введении за 2 ч до заражения. При этом в контрольной группе инфицированных животных наблюдались симптомы от паралича передних или задних лап до летального исхода. Это исследование также подчеркивает важность секреторного белка NS1 в качестве потенциального антигена для разработки вакцины против флавивирусов [75].

Заключение

На основании анализа данных литературы можно сделать вывод, что основной мишенью протективных антител против флавивирусов является поверхностный белок E. Иммунный ответ на этот вирусный белок неоднородный, можно выделить ряд иммуннодоминантных областей. Одним из главных регионов, вызывающих синтез нейтрализующих антител, является домен III. Тем не менее описаны моноклональные антитела, способные нейтрализовать флавивирусы за счет взаимодействия с эпитопами, входящими в состав доменов II и I. Мишенью протективных антител в некоторых случаях может выступать белок NS1. Несмотря на существование феномена ADE для флавивирусов, разработан ряд терапевтических препаратов на основе моноклональных антител, которые в настоящий момент проходят доклинические и клинические испытания. Описанный для флавивирусов феномен широко нейтрализующих антител дает надежду на создание в будущем универсальных высокоэффективных терапевтических препаратов для борьбы с этими патогенами.

Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Авторы подтверждают отсутствие конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.