Введение
HBsAg — главный серологический маркер инфекции вируса гепатита B (ВГВ). Различия в аминокислотной последовательности поверхностного белка ВГВ HBsAg позволяют разбить все изоляты вируса на 9 антигенных субтипов: ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq+, adrq- [1—3]. Описаны аминокислотные вариации, определяющие принадлежность к какому-либо из субтипов [4—6]. Таксономическая классификация ВГВ, основанная на различиях в последовательностях геномных ДНК вирусных изолятов, в настоящее время выделяет не менее 9 генотипов (обозначаемых A-I) [7—9]. При этом тому или иному генотипу ВГВ могут соответствовать несколько субтипов HBsAg [6, 7].
Встречаемость генотипов ВГВ и субтипов HBsAg в разных географических регионах варьирует [3, 7, 9]. В частности, среди городского населения России и стран ближнего зарубежья доминирует генотип D ВГВ (с субтипами HBsAg ayw2 и ayw3) — его доля в среднем составляет 80—85% от всех циркулирующих изолятов; также для этой территории характерна встречаемость генотипов A ВГВ (субтип adw2) на уровне 10—15% и C (adrq+) — до 5% (сводные данные по работам [10—16]). В разных областях России доминирование вариантов ВГВ имеет свои особенности: так, если в Самаре [17], Ямало-Ненецком Автономном округе [18], Новосибирской области и Алтайском крае [19, 20], Республике Алтай [21] и Иркутской области [22] генотип D является абсолютно доминирующим вариантом (98—100%), то, например, в Якутии [14, 16, 23] аномально высока встречаемость генотипа A (до 49,5%), а на Таймыре [21] и Чукотке [16, 24] — генотипа C ВГВ (18—33%). При этом указанные субтипы HBsAg и генотипы ВГВ, циркулирующие на территории Российской Федерации, коррелируют друг с другом в следующих сочетаниях: субтипы HBsAg ayw2 и ayw3 — генотип D, субтип adw2 — генотип A, субтип adrq+ — генотип C, что было показано в работе [16] на выборке из 85 изолятов ВГВ. Опубликованы данные о зависимости клинического течения и исхода ХГВ от генотипа ВГВ (цит. по [25]), что диктует необходимость типирования ВГВ в рутинной клинической практике.
В то же время в распоряжении современной российской клинической лаборатории имеется весьма ограниченный выбор средств для целей типирования ВГВ. Определение субтипа HBsAg и генотипа ВГВ выполняют путем определения первичной структуры ДНК ВГВ с последующим проведением филогенетического анализа [5, 7, 16] и выведением аминокислотной последовательности HBsAg, кодируемой S-геном ВГВ, определяющей субтип этого антигена [4, 5]. Использование такого метода предусматривает специальную пробоподготовку и наличие дорогостоящего оборудования. Коммерческий набор для определения генотипа ВГВ АмплиСенс® производства «Интерлабсервис» (Москва) HBV-генотип-FL [26], позволяющий проводить генотипирование ВГВ (выявление генотипов A, B, C и D), также предусматривает определение генотипа путем работы с вирусной ДНК.
Очевидно, если ДНК ВГВ недоступна, определить генотип ВГВ молекулярно-биологическими методами невозможно. В то же время наличие HBsAg в данных образцах дает возможность изучать их характеристики с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) с применением высокоспецифичных моноклональных антител (МАТ) [27, 28]. В частности, авторы данной работы в более ранних исследованиях [29—31] определяли субтип HBsAg с помощью панели МАТ, предложенной Dr. P. Swenson и соавт. [32]. Существуют также коммерческие наборы реагентов для определения субтипа HBsAg [33] и генотипа ВГВ [34] в HBsAg-положительных образцах методом ИФА производства Японии (Tokio, Institute of Immunology Ltd). При этом высокая стоимость данных наборов делает их практически недоступными для применения в российской лаборатории.
Авторами настоящей работы была сформирована лабораторная версия набора для иммуноферментного определения субтипа HBsAg и генотипа ВГВ в образцах сыворотки/плазмы крови человека, основанного на использовании разработанной в нашей организации панели субтип-специфичных МАТ [35, 36]. Настоящая работа содержит результаты испытаний разработанных реагентов на образцах, полученных от представителей различных групп коренного населения Сибири и содержащих HBsAg [21], и сравнение с результатами, полученными альтернативными методами: секвенированием ДНК ВГВ и субтипированием с использованием панели МАТ от Dr. P. Swenson и соавт. [32].
Материалы и методы
Образцы плазм крови и последовательности ДНК ВГВ. Для исследования были отобраны 146 образцов плазм крови, полученных в 1992—2006 гг. от коренного населения пяти регионов Сибири, описанных в работе [21]. Для данных образцов ранее было установлено наличие HBsAg, из108 из них — выделена ДНК ВГВ, секвенированы последовательности ДНК S-гена ВГВ, на основе которых был определен субтип HBsAg и генотип ВГВ соответствующих изолятов; данная часть работы подробно описана ранее [18, 21, 22]. Последовательности ДНК ВГВ из исследованных образцов были депонированы в базе данных GenBank с шифрами JX090605-JX090647, JX090656-JX090724, JX125364-JX125386. Далее в тексте статьи приводятся как внутренние лабораторные шифры того или иного образца, так и присвоенный соответствующему изоляту шифр GenBank, например, Ал396 (JX090622).
Оригинальный метод определения субтипа HBsAg/генотипа ВГВ с использованием МАТ. Ранее из панели мышиных МАТ к HBsAg [37] авторами настоящей работы были отобраны специфические МАТ — E1, H2, D4, комбинация реакций пероксидазных конъюгатов которых позволяет в сыворотках/плазмах, содержащих HBsAg, дифференцировать основные циркулирующие на территории РФ субтипы данного антигена — ayw2, ayw3, adw2, adrq+ [35], а также генотипы ВГВ A, C, D [36]. Указанная панель была дополнена конъюгатом SM, определяющим одно из ключевых условий валидности результата исследуемого образца: для всех вариантов субтипов HBsAg/генотипов ВГВ наличие положительной реакции, а для образцов субтипа adrq+/генотипа C коэффициент позитивности (Кпоз.), вычисленный как ОПобр.SM/ОПкрит.SM, должен превышать 2. На основе стандартизованного протокола анализа HBsAg-положительных образцов сыворотки/плазмы крови с помощью полученной панели МАТ создана лабораторная версия набора для установления субтипа HBsAg и генотипа ВГВ. Определение субтипов HBsAg/генотипов ВГВ в образцах плазмы крови коренного населения Сибири с помощью разработанных реагентов проводили в отделении ИФА гепатита В АО «Вектор-Бест» в 2017 г. Методика определения субтипа HBsAg и/или генотипа ВГВ в образцах плазмы крови с использованием разработанной лабораторной версии набора включает следующие основные шаги.
1. Каждый из образцов (контрольных и исследуемых) вносят в объеме 100 мкл в 4 повторах в лунки 96-луночного планшета, сорбированного поликлональными антителами осла против HBsAg.
2. После инкубации в течение 3 ч при 37 °C лунки планшета пятикратно отмывают раствором фосфатно-солевого буфера с твином Tween-20 (ФСБ-Т).
3. В каждую первую лунку с образцом вносят конъюгат МАТ SM, в каждую вторую лунку — конъюгат Е1, третью — Н2, четвертую — D4, каждый в объеме 100 мкл.
4. После инкубации в течение 2 ч при 37 °C следует пятикратная отмывка раствором ФСБ-Т.
5. Ферментативную стадию ИФА с раствором тетраметилбензидина (ТМБ) и перекиси водорода проводят в течение 30 мин при комнатной температуре (20—25 °C) в защищенном от света месте.
6. Регистрацию результатов осуществляют в двухволновом режиме измерения оптического поглощения: основная длина волны — 450 нм, референсная — 620 нм. Подсчет значения критической оптической плотности (ОПкрит) проводят для каждого конъюгата МАТ отдельно: ОПкрит равняется полученной оптической плотности отрицательного контрольного образца (ОПОКО)+0,1. Реакцию считают положительной, если отношение ОПобр./ОПкрит.≥1. Результаты оценивают согласно табл. 1.
Таблица 1. Результаты реакций конъюгатов МАТ-ПХ лабораторной версии набора с образцами сыворотки/плазмы крови, содержащими HBsAg различных субтипов
| Субтип HBsAg/генотип ВГВ | МАТ-ПХ | |||
| SM | E1 | H2 | D4 | |
| adw2/ A | + | — | * | + |
| adrq+/ C | + | — | * | — |
| ayw2/ D | + | + | + | * |
| ayw3/ D | + | + | — | * |
Примечание. Серым цветом показаны реакции, обязательные для интерпретации; * — результат не учитывается.
Согласно предлагаемой методике, минимальная концентрация HBsAg в образце, необходимая для исследования с помощью данных реагентов, составляет 100 МЕ/мл. Образцы сначала исследуют разведенными в 10 раз в отрицательном контрольном образце (ОКО), представляющем из себя пул отрицательных донорских сывороток, не содержащих HBsAg и антител к нему (анти-HBs). Если при исследовании разведенного в 10 раз образца получена отрицательная реакция с конъюгатом SM, то его исследуют повторно без разведения. Если образец без разведения также не демонстрирует реакций, результаты исследований данного образца признают невалидными.
Если результат образца интерпретируется как adrq+/C при Кпоз.SM от 1 до 2, такой образец следует переставить без разведения. В случае, если подобный результат получен при исследовании неразведенного образца, считать его невалидным.
Метод определения субтипа HBsAg и генотипа ВГВ в ИФА с МАТ Dr. P. Swenson и соавт. Для сравнительного определения субтипа HBsAg использовали панель МАТ 3C3, 2D11, 3D9, 3A5, 3E2 [32] в соответствии с методикой, описанной ранее [29]. Для определения генотипа ВГВ использовали два дополнительных МАТ, 1C10, 1C4, также любезно предоставленных Dr. P. Swenson, по аналогичной методике.
Результаты и обсуждения
ДНК ВГВ положительные образцы
Определение генотипа ВГВ. С использованием разработанных реагентов результаты были получены для 91 (84%) из 108 исследованных образцов плазм крови, из которых ранее была выделена ДНК. Результаты исследований 17 образцов (16%) признаны невалидными, что, вернее всего, было связано с низким содержанием HBsAg в них — менее 20 МЕ/мл, определено против международного стандарта WHO Third International Standard for HBsAg (HBV genotype B4, HBsAg subtypes ayw1/adw2) [38].
Для 91 ДНК ВГВ положительного образца, прореагировавшего в предлагаемом тесте, были установлены следующие генотипы ВГВ: D (субтипы HBsAg ayw2 и ayw3) — 82 образца (90%), C (субтип adrq+) — 6 (7%), A (adw2) — 3 (3%). Результаты встречаемости генотипов ВГВ в исследованной выборке из 91 образца полностью совпадают с опубликованными ранее расширенными данными по генетическому разнообразию ВГВ у коренного населения Сибири, полученными на материале 143 изолятов [21], что свидетельствует о пригодности разработанного теста, как минимум, для проведения скринингового генотипирования в эпидемиологических целях.
Не все результаты гено- и субтипирования указанного 91 образца в разработанном нами наборе совпали с результатами, полученными ранее при анализе последовательностей вирусных ДНК соответствующих изолятов ВГВ (табл. 2). Для того, чтобы верифицировать данные того или иного способа анализа, использовали третий независимый метод — ИФА с панелью МАТ, предложенной Dr. P. Swenson и соавт. [32]. Для 14 случаев с дискордантными результатами двух методов (см. табл. 2) представлены данные всех трех исследований.
Таблица 2. Расходящиеся результаты, полученные в лабораторной версии набора и при анализе нуклеотидных последовательностей S-гена изолятов ВГВ, дополненные результатами по методике Dr. P. Swenson и соавт.
| Шифр образца (изолята) | Результаты анализа последовательностей ДНК изолятов ВГВ [21], субтип HBsAg/ генотип ВГВ | Результат в ИФА в лабораторной версии набора, субтип HBsAg/генотип ВГВ | Результат в ИФА по методике Dr. P. Swenson и соавт. [32], субтип HBsAg/генотип ВГВ |
| 1. Не совпали результаты генотипирования и субтипирования (2 образца) | |||
| Нук14 (JX125365) | adrq+/C | adw2/A (adrq+/С в повторе) | adrq+/C |
| Во163 (JX125371) | adrq+?/C (замена I126Т, характерная для субдетерминанты w) | adw2/A (adw2/А в повторе) | adw2/C |
| 2. Совпали результаты генотипирования, выявлены расхождения в результатах субтипирования (12 образцов), в том числе: | |||
| 2.1. Нетипичная структура S-гена изолятов ВГВ (3 образца) | |||
| Муж240 (JX090678) | adw2/ рекомбинант между A и D | ayw2/D | ayw2/D |
| Ал482 (JX125369) | adw2/ рекомбинант между A и С | adrq+/C | adrq+/C |
| Лис15 (JX090648) | ayw?/D (замены в HBsAgT126P127→ N126S127, что не позволяет однозначно дифференцировать субдетерминанты w2 и w3) | ayw3/D | ayw3/D |
| 2.2. Образцы с субтипом ayw4 HBsAg (4 образца) | |||
| Ал396 (JX090622) | ayw4/D | ay-/D (закончился образец) | ayw4?/D |
| Бек93 (JX090636) | ayw4/D | ayw3/D | ayw4?/D |
| Ду65 (JX090640) | ayw4/D | ayw2/D | ayw2/D |
| Щу115 (JX090697) | ayw4/D | ayw3/D | ayw4?/D |
| 2.3. Неустановленные причины расхождения результатов (5 образцов) | |||
| Ал161 (JX090610) | ayw2/D | ayw3/D | не определен |
| Ж103 (JX090719) | ayw2/D | ayw3/D | не определен |
| Мс428 (JX090667) | ayw2/D | ayw3/D | не определен |
| Муж146 (JX090676) | ayw2/D | ayw3/D | ayw2/D |
| Вос215 (JX090714) | ayw3/D | ayw2/D | не определен |
Для 2 из 91 образца (2%) были выявлены расхождения в результатах генотипирования, полученных с помощью разработанных реагентов и при анализе последовательностей ДНК ВГВ (см. табл. 2, п. 1). Один из этих образцов (Нук14, JX125365) при повторном исследовании с МАТ показал совпадающий с данными секвенирования результат, что позволяет квалифицировать первично полученную реакцию как возникшую в результате технической ошибки. Другой образец, Во163 (JX125371) демонстрировал в ИФА реакции, характерные для генотипа A (субтип adw2), при том, что, по данным секвенирования, данный изолят может быть отнесен к генотипу C (субтип adrq+) (см. табл. 2). В то же время в выведенной аминокислотной последовательности HBsAg данного изолята (JX125371) в положении 126 показано наличие остатка треонина, что не является типичным для последовательностей субтипа adrq+, на который указывают аминокислотные остатки в других субтип-значимых позициях этого изолята (у других описанных изолятов ВГВ субтипа adrq+ в положении 126 находится изолейцин, а треонин характерен для субдетерминант типа w [5]). Описанный уникальный феномен последовательности HBsAg изолята Во163 (JX125371) мог послужить причиной его нетипичной реакции с использованными МАТ. Это предположение подтверждается тем фактом, что в реакции с альтернативной панелью МАТ по методике [29] данный образец также продемонстрировал нетипичную реакцию, характерную для генотипа C субтипа adw2, но не adrq+, как было предсказано при анализе последовательности ДНК этого изолята [21]. Подводя промежуточный итог, можно заключить, что показатель правильности определения генотипа, предварительно определенный в рамках описываемых испытаний, составил 0,98 (верно генотипированы 89 из 91 прореагировавших с МАТ образцов), что является удовлетворительным значением для теста, основанного на методе ИФА. Полученные результаты хорошо согласуются с опубликованными ранее данными по совпадению результатов (95,6%) при определении генотипа методом ИФА и анализом первичной последовательности на выборке из 91 HBsAg+ образца [39]. При этом неправильное определение генотипа не было связано с систематической ошибкой используемого метода, а являлось следствием наличия в исследуемой выборке мутантных изолятов ВГВ или же технических ошибок, то есть воздействия случайных факторов.
Определение субтипа HBsAg. В части установления субтипа HBsAg разрабатываемый ИФА-набор оказался менее специфичным по сравнению с результатами, полученными при генотипировании. Среди 91 прореагировавшего в тесте образца, помимо двух, описанных выше (для которых не были правильно определены одновременно генотип ВГВ и субтип HBsAg), выявлены еще 12, для которых не совпали только результаты субтипирования с данными анализа нуклеотидных последовательностей ДНК изолятов ВГВ (см. табл. 2). Из них три изолята (см. табл. 2, п. 2.1) имеют различные генетические аберрации в S-гене, кодирующем, как известно, HBsAg: два из них являются межгенотипными рекомбинантами с точками рекомбинации внутри S-гена [21], а один несет смысловую замену аминокислот HBsAg T126P127→N126S127, не позволяющую различить субтип-значимые субдетерминанты w2 и w3 [5]. Интересно, что во всех трех случаях результаты субтипирования в ИФА с МАТ из двух разных использованных панелей полностью совпали (см. табл. 2, п. 2.1). Поскольку субтип HBsAg является серологической характеристикой ВГВ, в данном случае, по-видимому, верным будет установить субтип именно по результатам ИФА. Очевидно, описанные генетические особенности в перечисленных трех изолятах затрудняют установление субтипа при анализе выведенной аминокислотной последовательности [5], но при этом не затрагивают эпитопы распознавания использованных субтип-специфичных МАТ.
Еще 4 образца с расходящимися результатами (см. табл. 2, п. 2.2) содержали, согласно данным секвенирования, HBsAg субтип ayw4 (генотип D), не являющийся распространенным в РФ и встречающийся, в частности, в Сибири, у 1—5% инфицированных пациентов [11, 16, 21]. Многоступенчатый алгоритм установления данного субтипа по выведенной аминокислотной последовательности описан в статье [7]. В разработанной авторами лабораторной версии набора не предусмотрена возможность распознавания субтипа ayw4, что отражено в табл. 1, при этом генотип D в данных образцах был определен верно (см. табл. 2, п. 2.2).
Наконец, для 5 оставшихся образцов (см. табл. 2, п. 2.3) авторы не могут выдвинуть обоснованных предположений о причинах расхождения результатов в разных тестах. Тот факт, что субтип HBsAg в данных образцах не мог быть в большинстве случаев установлен и с использованием альтернативной панели МАТ Dr. P. Swenson и соавт., заставляет предположить наличие в образцах белковых примесей, неспецифически взаимодействующих с антителами из обоих панелей. Так, в работе [40] показано, что неспецифический фон при исследовании образцов плазмы крови в иммуноанализе «сэндвич»-типа может быть обусловлен интерференцией, как минимум, с фибриногеном, иммуноглобулинами класса G и альфа-2-макроглобулином, и аффинное удаление этих белковых фракций способствует уменьшению неспецифического сигнала. Отметим, что в работе [18] валидные результаты с использованием МАТ Dr. P. Swenson и соавт., были получены всего для 62% (13/21) образцов; при одновременном определении субтипов HBsAg с применением панели МАТ Dr. P. Swenson и соавт. и по первичным последовательностям ДНК изолятов ВГВ было показано 90% (10/11) совпадение результатов. В нашем исследовании с помощью разработанных реагентов валидные результаты были получены для 84% (91/108) образцов плазм, и, с учетом всех изложенных причин, субтип HBsAg был правильно установлен для 85% (77/91) из них.
HBsAg положительные образцы, из которых ДНК ВГВ не была выделена
Нами были изучены также 38 HBsAg положительных образцов плазмы крови, из которых ДНК ВГВ выделить не удалось. Образцы были исследованы в ИФА с помощью двух методик: с панелью МАТ д-ра P.Swenson и с собственной панелью МАТ. С помощью разработанных реагентов были получены следующие результаты: 2 образца adrq+ (генотип C), 1 образец adw2 (генотип A), 23 образца ayw2 (генотип D) и 12 образцов ayw3 (генотип D). Совпадение результатов при определении генотипа ВГВ с помощью двух сравниваемых методик составило 38 из 38 (100%). При определении субтипа HBsAg результаты двух методик совпали для 36 (95%) из 38 образцов. В двух случаях внутри генотипа D были получены отличающиеся результаты: для одного образца с помощью собственных реагентов был получен субтип HBsAg ayw2, с МАТ Dr. P. Swenson и соавт. — ayw3, в другом — наоборот. Отметим, что эти 2 сероварианта белка отличаются лишь одной заменой в 127-м положении (пролин для варианта w2 и треонин для варианта w3)[5]. Таким образом, для данной группы образцов, ДНК ВГВ из которых не удалось выделить, субтип HBsAg и генотип ВГВ были определены методом ИФА.
Заключение
Нами разработан и протестирован прототип набора реагентов, предназначенного для суб- и генотипирования ВГВ в образцах сыворотки/плазмы крови, содержащих HBsAg, методом ИФА с разработанной нами собственной оригинальной панелью МАТ. С помощью данных реагентов можно выявлять наиболее распространенные на территории России субтипы HBsAg (ayw2, ayw3, adw2, adrq+) и генотипы ВГВ (A, C, D). Показано совпадение результатов исследования в разработанном тесте с данными анализа нуклеотидных последовательностей ДНК изолятов ВГВ при определении субтипа HBsAg — 85% (77 из 91) и при определении генотипа ВГВ — 98% (89 из 91). Для образцов, характеристики ВГВ которых были изучены только иммуноферментным методом с помощью МАТ (собственных и МАТ Dr. P. Swenson и соавт. в сравнении), также продемонстрированы очень хорошие результаты: совпадение 95% (36 из 38) при определении субтипа HBsAg и 100% (38 из 38) при определении генотипа ВГВ.
С учетом полученных данных, а также с учетом того, что стоимость разработанного нами ИФА-теста намного ниже стоимости выделения и секвенирования ДНК ВГВ и требует значительно меньше времени, использование разработанной лабораторной версии теста можно рекомендовать в качестве альтернативы молекулярно-генетическим методам при определении субтипа HBsAg/генотипа ВГВ. Кроме того, данный метод исследования может быть в некоторых случаях единственно доступным методом изучения субтипов изолятов ВГВ.
Благодарность
Моноклональные антитела 3C3, 2D11, 3D9, 3A5, 3E2, 1C10, 1C4 предоставлены Dr. P.Swenson (Окружной отдел Лаборатории общественного здравоохранения Сиэтла, США).
Финансирование работы.
Работа проведена в основном без специальной финансовой поддержки.
Участие в работе Л.П. Осиповой поддержано бюджетным проектом ИЦиГ СО РАН №0324-2019-0041-С-01.
Участие в работе С.В. Нетесова поддержано в рамках государственного задания по финансированию НИР в Новосибирском государственном университете №FSUS-2020-0035 и Программы повышения конкурентоспособности российских университетов ТОП-100 НГУ.
Соблюдение этических стандартов
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.