Зарубежными и отечественными исследователями хорошо освещены вопросы содержания различных микроэлементов как в кариозной, так и в здоровой эмали [1—9]. Доказано, что недостаток некоторых микроэлементов в тканях зуба сказывается на их устойчивости к кариесу. При этом остается невыясненным механизм накопления в эмали того или иного количества микроэлементов, определяющих в итоге ее резистентность.

Кристаллическая структура эмали определяется особенностями белковой матрицы, формирование которой всегда предшествует процессу минерализации. Калликреин-4 является эвакуатором остаточных фрагментов матричных белков при замене их на минералы, регулирует обработку органической матрицы эмали, что в конечном итоге определяет структуру и состав эмали [10].

Цель исследования — оценить содержание различных микроэлементов в интактной зубной эмали лиц, генотипированных по полиморфизмам G/G, G/A, A/A гена калликреина-4 в мутационных точках G2664153A и G2142A.

Материал и методы

Исследованы 160 образцов эмали интактных премоляров верхних челюстей, удаленных по ортодонтическим показателям у 149 пациентов в возрасте от 18 до 35 лет, предварительно генотипированных по полиморфизмам гена калликреина-4 в мутационных точках G2664153A и G2142A.

Для определения точечных мутаций использовались метод SNP-Экспрес и праймеры, входящие в стандартный набор Литех. Подбор праймеров осуществлялся при помощи программы Primer-express 3.0. Специфичность праймеров проверена в программе NCBI для Macintosh. Каждый образец выделенной ДНК подвергали амплификации дважды с двумя аллель-специфичными реакционными смесями, что, соответственно, позволяло после электрофореза давать три типа заключения: «нормальная» гомозигота, гетерозигота, «патологическая» гомозигота. Молекулярно-генетическое исследование выполнено на базе молекулярно-генетической лаборатории академического центра патологической анатомии ОмГМУ.

Исследование образцов эмали проводили с помощью рентгеноспектрального и флюоресцентного методов на анализаторе ARL-Advant’x с Rh-анодом рентгеновской трубки в аналитической лаборатории Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН (Новосибирск). Концентрацию кальция и фосфора дополнительно определяли методом ICP-OES на спектрометре Varian 710-ES.

Результаты и обсуждение

Встречаемость полиморфизмов гена калликреина-4 среди обследованных пациентов представлена в табл. 1.

Таблица 1. Распределение полиморфизмов гена калликреина-4 среди обследованных пациентов

Примечания: в таблице указаны только достоверные различия; коэффициент p рассчитан по отношению к генотипам G/G и G/A; коэффициент p₁ рассчитан по отношению к аллелю G.

Установлено, что у 65% (n=55) пациентов в мутационной точке G2664153A отмечаются достоверные различия частоты гомозигот G/G и A/A гена калликреина-4 (p<0,01), а также частоты гомозиготы A/A и гетерозиготы G/A (p₁<0,01).

В мутационной точке G2142A аллельного полиморфизма гена калликреина–4 у 86% (n=72) обследованных отмечается достоверное увеличение частоты патологических гомозигот A/A (p<0,001). И лишь у 14% (n=12) обследованных отмечается достоверное повышение частоты нормальной гомозиготы G/G по сравнению с патологической гомозиготой A/A (p₁<0,001) и гетерозиготой G/A (p₁<0,001).

Известно, что кальций и фосфор являются основными микроэлементами в составе зубной эмали, которые влияют на состав и структуру кристаллов гидроксиапатитов [11]. Изменение соотношения этих элементов может оказывать влияние на процессы де- и реминерализации. Поэтому в нашем исследовании мы изучили и сравнили количественное содержание кальция и фосфора, а также их соотношение.

Для подтверждения достоверности данных, полученных при определении микроэлементов в зубной эмали, результаты, полученные методом ICP-OES, сравнивали с результатами, полученными другими методами. В частности, концентрацию кальция определяли методом атомно-абсорбционной спектроскопии, а концентрацию фосфора — спектрофотометрическим методом [8, 12]. Полученные результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2. Концентрация кальция и фосфора в образцах интактной зубной эмали лиц с различной частотой генотипов гена калликреина-4 (по данным метода атомно-эмиссионной спектроскопии)

Результаты определения содержания кальция и фосфора в образцах разными методами сопоставимы между собой и представлены на рис. 1 и 2. Показатели, характеризующие процентное содержание кальция и фосфора в эмали интактных зубов обследуемого контингента, дополнительно были изучены рентгеноспектральным флюоресцентным методом. Это позволило установить, что по процентному содержанию фосфора лица с преобладанием различных полиморфизмов гена калликреина-4 достоверно не различались. При расчете кальций-фосфорного мольного коэффициента также не удалось установить достоверных различий этого показателя у лиц с генотипами G/G и A/A гена калликреина-4.

Рис. 1. Содержание кальция в образцах эмали зубов лиц с различной частотой генотипов гена калликреина-4.

Рис. 2. Содержание фосфора в образцах эмали зубов лиц с различной частотой генотипов гена калликреина-4.

При изучении микроэлементного состава интактной зубной эмали лиц с различными генотипами гена калликреина-4 было установлено их качественное однообразие, вместе с тем выявлено отличие количественного содержания тех или иных микроэлементов в эмали лиц с различной частотой генотипов гена калликреина-4 (табл. 3).

Таблица 3. Микроэлементный состав образцов эмали интактных премоляров обследуемых лиц с различными генотипами гена калликреина-4

Следует признать, что в зубной эмали лиц с генотипом G/G гена калликреина-4 отмечается наибольшее содержание таких микроэлементов, как фтор (p<0,001), железо (p<0,001), стронций (p<0,001), кремний (p<0,001). Вместе с тем в зубной эмали лиц с генотипом A/A отмечается достоверное увеличение частот таких микроэлементов, как магний (p<0,01), цинк (p<0,01), алюминий (p<0,001), сера (p<0,01), хлор (p<0,001). Выявлена тенденция к увеличению количества калия и кислорода (p<0,05).

Заключение

В эмали зубов лиц с различной частотой генотипов гена калликреина-4 имеется разное количество некоторых микроэлементов. Так, у лиц с генотипом G/G гена калликреина-4 отмечается наибольшее содержание таких микроэлементов, как фтор, железо, стронций, кремний. В то же время у лиц с генотипом A/A достоверно выше содержание магния, цинка, алюминия, серы и хлора. При этом процентное содержание кальция и фосфора, а следовательно, и кальций-фосфорный мольный коэффициент в образцах эмали интактных зубов лиц с полиморфизмами G/G и A/A гена калликреина-4 достоверно не различаются. Вышеизложенное позволяет сделать вывод о том, что влияние мутаций гена калликреина-4 не отразилось на количественном содержании кальция и фосфора. Следовательно, различия в резистентности зубной эмали лиц с генотипами G/G и A/A гена калликреина-4 не связаны с количеством кальция и фосфора — основных микроэлементов, участвующих в процессе реминерализации.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.