Золотистый стафилококк — один из наиболее значимых возбудителей заболеваний человека, способный вызывать как госпитальные, так и внебольничные формы инфекции различной степени тяжести. Появление и последующее распространение метициллин-устойчивого варианта возбудителя (MRSA), способного формировать устойчивость ко всем вновь вводимым в лечебную практику антимикробным препаратам, представляет серьезную проблему даже для стран с хорошо развитой системой здравоохранения [1, 2]. Анализ популяционной структуры MRSA на основе определения нуклеотидной последовательности фрагментов 7 генов домашнего хозяйства (метод MLST) позволил выявить принадлежность циркулирующих штаммов к 5 наиболее эпидемически успешным клональным комплексам (СС): CC5, CC8, CC22, CC30, CC45.

СС8 помимо сиквенс-типа (ST) 8 включает и гибридный ST239, сформировавшийся в результате замены у штамма ST8 фрагмента ДНК на нуклеотидную последовательность, полученную от представителя ST30 протяженностью около 635 000 нуклеотидных пар (н.п.) [3, 4].

Другой важной генетической характеристикой MRSA являются структурные особенности мобильного генетического элемента — стафилококковой хромосомной кассеты mec (SCCmec), которая несет гены, обеспечивающие устойчивость к бета-лактамным антибиотикам. В настоящее время у S. aureus охарактеризованы 11 типов SCCmec, различия между кассетами основаны на различиях в структуре комплекса генов, окружающих mecA (класс mec), типа генов рекомбиназ (ccr), и некоторых генов, расположенных в промежуточных регионах. Представителей одного клонального комплекса можно дифференцировать на основании типа SCCmec [3, 5]. ST239 является одним из наиболее старых и эпидемически успешных клонов MRSA. Наиболее ранние сообщения о вспышках госпитальных инфекций, вызванных, как теперь стало известно, именно ST239, были зарегистрированы в Великобритании и Австралии в конце 70-х — начале 80-х годов прошлого века [6]. На протяжении десятилетий представителей этого клона выделяли во многих странах мира на различных континентах. Распространяясь на различных географических территориях, клон получил десятки имен [7—11]. К настоящему времени он является превалирующим эпидемическим клоном в стационарах многих стран Азии, обусловливая почти 90% MRSA инфекций, на географической территории, где проживает около 60% населения планеты [10, 12]. В отличие от большинства других представителей СС8 ST239 содержит SCCmec тип III. Работами по генотипированию, выполненными за последнее десятилетие зарубежными исследователями, выявлено несколько генетических вариантов среди изолятов ST239, распространившихся на разных континентах как результат микроэволюции этого эпидемического клона [10—12].

Согласно результатам исследований, выполненных в Российской Федерации, данный клон появился в отечественных больницах по крайней мере в середине 80-х годов прошлого века и по-прежнему остается одним из превалирующих эпидемических клонов MRSA, циркулирующих в отечественных стационарах [13—15]. Несмотря на интенсивное изучение молекулярно-генетических особенностей ST239-SCCmecIII за рубежом, данные по полногеномному секвенированию представителей клона, циркулирующих в РФ, ограничиваются 2 штаммами S. aureus 16K и OC3, выделенными в Сибирском и Дальневосточном регионах, которые до настоящего времени аннотированы лишь частично. По результатам изучения вариабельных повторов в структуре гена, кодирующего протеин А (метод сингл-локусного типирования), S. aureus 16K принадлежит к spa типу t-030, а S. aureus OC3 к t-037 [16, 17]. Ранее было показано, что вариант клона ST239 spa t-030 появился в стационарах РФ значительно позднее, чем вариант t-037, однако к 2010 г. стал доминировать среди представителей ST239 в стационарах Москвы и Санкт-Петербурга [14, 15]. При проведении скрининга клинических изолятов S. aureus на чувствительность к цефтаролину, цефалоспорину V поколения, созданному в том числе и для лечения инфекций, вызванных MRSA, был выявлен SA943 (MRSA) ST239, содержащий кассету SCCmec тип III, устойчивый к цефтаролину.

Цель исследования — проведение геномного анализа метициллин-резистентного устойчивого к цефтаролину Staphylococcus aureus и выявление особенностей генетического разнообразия представителей эпидемического клона ST239, циркулирующих в стационарах РФ.

Материал и методы

Staphylococcus aureus SA943 был выделен при бактериологическом исследовании отделяемого свища пациента в области поясничного отдела позвоночника. Видовую идентификацию проводили стандартными методами с использованием Vitek 2 (bioMérieux). Определение чувствительности к антибиотикам проводили с помощью полуавтоматического бактериального анализатора BD Phoenix (США) и вручную методом микроразведений в бульоне при определении чувствительности к цефтаролину. Значения минимальных ингибирующих концентрации интерпретировали согласно критериям EUCAST [18]. Генотипирование выполнили методом мультилокусного секвенирования (MLST) в соответствии с рекомендациями ресурса https://saureus.mlst.net и сингл-локусного типирования на основании определения структуры и численности вариабельных фрагментов гена spa методом секвенирования по Сэнгеру с использованием капиллярного секвенатора ABI 3730 (США) согласно протоколу (https://www.spaserver.ridom.de). Для проведения полногеномного секвенирования ДНК выделяли с использованием модифицированного протокола BioSilica (Россия). Библиотеки ДНК готовили с помощью NEBNext Ultra DNA Library PrepKit for Illimina согласно протоколу производителя. Полногеномное секвенирование было выполнено на платформе Illumina HiSeq 2500. Удаление последовательностей адаптера, неоднозначных чтений и последовательностей низкого качества (базовые показатели качества Q20, соответствующая вероятность ошибки 1%) выполнили с помощью программы Trimmomatic [19]. Полученные риды были собраны в скаффолды с использованием программного обеспечения CLC Genomics Workbench v.7.0. и SPAdes v.3.11.1. Аннотацию скаффолдов осуществили с использованием RAST (https://rast.nmpdr.org) и NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (PGAP; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/statistic/Pipeline.htlm).

Генотипирование выполнили методом мультилокусного секвенирования (MLST) in silico с использованием интернет-ресурса https://cge.cbs.dtu.dk/services/MLST/. Поиск плазмид осуществили с применением PlasmidFinder (https://cge.cbs.dtu.dk/services/PlasmidFinder/). Профаговые области выявляли с помощью ресурсов RAST и Phaster. Дополнительный анализ генов резистентности и факторов патогенности, а также их продуктов был проведен мануально на базе платформы BLASTp NCBI. Группы ортологичных белок-кодирующих генов были реконструированы с использованием программного обеспечения OrthoMCL 2.09 [20] с настройками по умолчанию. Выборка включала 161 геном штаммов ST239, выделенных в 30 странах мира на протяжении 1981—2017 гг., а также штамм NCTC 8325 (ST8) в качестве внешней группы. Затем с использованием полученных групп вычислялись попарные сходства между штаммами двумя способами: а) подсчет количества совпадающих аллелей среди консервативных белок-кодирующих генов, присутствующих только в одной копии в каждом геноме; б) подсчет количества групп ортологичных генов, общих для двух штаммов.

Результаты

Характеристика сборки. Согласно результатам секвенирования общая протяженность ридов составила 1919469985 нуклеотидов, что свидетельствовало о более чем 250-кратном покрытии генома. По результатам сборки было сформировано 118 контигов общей протяженностью 2895449 н.п. с содержанием G+C 32,7%, что соответствует исследуемому виду. Были идентифицированы 3124 гена, в том числе: 2936 белок-кодирующих генов; 80 — рибосомальные РНК; 60 — транспортные РНК; 4 — некодирующие РНК. Согласно данным RAST было определено 2803 генов, из которых 51% — входят в состав различных субсистем, большинство из которых обеспечивают общий метаболизм микробной клетки. Наибольшее число генов представлено в субсистемах, отвечающих за метаболизм аминокислот и их дериватов (323), углеводов (253), протеинов (209), кофакторов, пигментов и витаминов (183), нуклеотидов и нуклеозидов (101), липидов, жирных кислот и изопреноидов (100), а также метаболизм РНК (118). С клеточной стенкой и капсулой ассоциированы 105 генов, более 60 могут рассматриваться как гены факторов патогенности.

Генотипирование. Результаты мультилокусного секвенирования, проведенные in silico, подтвердили принадлежность штамма к эпидемическому клону MRSA ST239. При анализе результатов spa типирования обнаружили уникальную последовательность коротких нуклеотидных повторов (SSR): 15-12-16-02-153-24, которая была занесена в базу данных spa сервера как новый spa тип t-18470, отличающийся от t-030 (15-12-16-02-24-24) наличием одной нуклеотидной замены (С-T) в структуре пятого SSR, что привело к замене 5-го повтора r24 на r153.

Чувствительность к антибиотикам. SA943 содержал гены, кодирующие устойчивость к аминогликозидам (гентамицину, тобрамицину, спектиномицину): aac(6’)/aph(2’’)-Ia, ant(9)-la, aph (3)-IIIa; к бета-лактамам (ампициллин, оксациллин, цефалоспорины I—III поколений): blaZ, blaI, blaR, mecA, mecI, mecR; к тетрациклину (tetM). Индуцибельный фенотип устойчивости к макролидам (эритромицину) и линкозамидам обеспечивали продукты генов: транспортер staphyloferrin A, вовлеченный в эффлюкс макролидов), msrA и msrB. Устойчивость к фторхинолонам обусловлена аминокислотными заменами в белках: NorA (G101S), субъединицах ДНК гиразы GyrA (S80F, S84L, H377R), GyrB (A440V, E317D), субъединицах ДНК топоизомеразы IV GrlA (Y80F) и GrlB (A438V). Резистентность к рифампицину обусловлена мутациями гена rpoB, приводящими к аминокислотным заменам кодируемого белка (L466S, M527I, V864I). Замена (K41E) в аминокислотной последовательности металлотиолфосфотрансферазы B определяла устойчивость к фосфомицину (fosB). Резистентность к хлорамфениколу обусловлена продуктом гена, кодирующего специфичный MFS транспортер. При анализе возможных механизмов резистентности к цефтаролину (МПК 4 мг/л) были выявлены замены в продуктах генов пенициллинсвязывающих белков mecA (табл. 1) и pbp2 (R262C и V627G). Штамм сохранял чувствительность к ванкомицину, даптомицину, линезолиду, тигециклину, фузидиевой кислоте.

Таблица 1. Сходство аминокислотных последовательностей продукта гена mecA в штаммах — представителях различных субклонов ST239 и в референсных штаммах S. aureus Col и S. aureus N315

Примечание. Жирным шрифтом выделены различия в числе аминокислот и идентичности аминокислотной последовательности со штаммом Col; полужирным курсивом выделены различия в идентичности со штаммом N315, а также аминокислотные замены.

1 — Евразийский субклон; 2 — Южноазиатский субклон; 3 — Южноамериканский/Ближневосточный субклон; 4 — Австралийский/Новозеландский субклон; 5 — Португальский субклон.

Характеристика вирулома. Среди факторов патогенности, закодированных в описываемом геноме, были обнаружены цитолитические токсины, в том числе гемолизины: альфа-гемолизин, гамма-гемолизины (HlgAB, HlgCB), бета-гемолизин, дельта-гемолизин, гемолизин Ш); лейкоцидины: LukE/D и LukG/H; фенолрастворимые модулины семейств альфа- и бета-, а также фенол-растворимый модулин mec в составе SCCmec. Были выявлены гены, кодирующие энтеротоксины (A, K), энтеротоксин-подобные протеины (Q, A/P), уникальный набор генов, кодирующих суперантигенподобные протеины (SSL1-10, в составе геномного острова υSAβ, а также SSL11, SSL12-14, расположенные в других участках генома и не обнаруженные ранее в подобном наборе в других геномах), сериновые и цистеиновые протеазы. Были идентифицированы многочисленные гены (clfA, clfB, fnbA, emp, efb,eap/map, cna, sasG и sdrC-E), кодирующие поверхностные клеточно-связанные протеины семейства MSCRAMM (микробные протеины, распознающие молекулы клеточной адгезии). Белки, входящие в эту группу, как правило, многофункциональны, имеют множество лигандов в организме хозяина. Основными функциями этих белков является участие в процессах колонизации и клеточной инвазии. Среди важнейших генов, продукты которых участвуют в механизмах иммунного уклонения, следует назвать coa, spa,sbi, ads,VWbp. Были выявлены гены, продукты которых участвуют в формировании полисахаридного матрикса биопленок (icaA-D, icaR), биосинтезе капсулы (cap1, cap5, cap8), а также регуляторные протеины.

Анализ консервативной части генома. Результаты анализа 1396 консервативных генов, т.е. генов, которые присутствовали во всех геномах выборки в одном экземпляре, отражены в табл. 2. Для упрощения в таблице представлено только 50 штаммов, выделенных в 30 странах мира на протяжении 1981–2017 гг., принадлежащих к различным субклонам. Предпочтение при возможности отдавали завершенным геномам.

Таблица 2. Сравнительный анализ консервативной части генома SA943 и представителей различных субклонов ST239 (классификация субклонов представлена согласно S. Monecke и соавт., 2018 [12])

Примечание. sasX/sesI — фактор адгезии, колонизации, участвующий в формировании биопленок; ccrC — кассетная хромосомная рекомбиназа С; mer — оперон устойчивости к ртути; fnbB — фибронектин связывающий протеин В; splA — сериновая протеаза А; splB — сериновая протеаза В; splE — сериновая протеаза.

Проведенный анализ показал, что наиболее близкими геному SA943 являются геномы штаммов, выделенных на территории Турции в 2008–2009 гг. [11, 21]. Различия между геномами наблюдались по аллелям 75—90 генов, тогда как различия с геномами других штаммов, в том числе выделенных на территории РФ, были более выраженным (см. табл. 2). Так, со штаммом S. aureus 16К различия наблюдались в последовательностях 143 генов, а при сравнении со штаммом OC3 — в 248 генах. Вместе с тем достаточно близкими оказались и штаммы, выделенные в Китае [22—24]. По сравнению со штаммом T0131 (CP035735.1) различия затронули 110 генов и 112—113 генов в штаммах S. aureus CN79 (NZ_ANCJ01000000.1), CUHK_BJ2002 (NZ_AZMY00000000.1), S. aureus CUHK_BJ2007 (NZ_AZMX00000000.1). При сравнении геномов SA943 и NCTC8325 различия были выявлены в последовательностях 504 генов.

Анализ мобильной части генома. Мобильный генетический пул представлен SCCmec, геномными островами, островами патогенности (PI), профаговыми последовательностями и IS-элементами. При анализе структуры SCCmec выявлен комплекс mec класса А (гены mecA, mecR1 и псевдоген mecI), рекомбиназы ccrAB3, гены, кодирующие резистентность к ионам кадмия в составе псевдотранспозона Tn554, фенолрастворимый-модулин mec. По набору генов кассета оказалась сходной как с кассетой mec (AB539727) размером 33148 н.п. в штамме S. aureus 16К, так и с SCCmec (GU235984) в штамме BK16704, выделенном в Румынии, и могла быть отнесена к типу III.1.1.4. Гены ccrC были выявлены в составе структуры, сходной с транспозоном Tn6072 (GU235985.1), протяженностью 29422 н.п., который дополнительно несет гены устойчивости к ряду аминогликозидов, включая спектиномицин [25]. Не представляется возможным указать точную локализацию этого транспозона в геноме штамма SA943, однако вполне вероятно, что он так же, как и в штамме S. aureus BK16691, выделенном в Румынии в 2005 г., в штаммах T0131 и 16K, локализован не в тандеме с SCCmec III.1.1.4, а находится по другую сторону от ori — места начала репликации хромосомы. В отличие от SCCmec III.1.1.1 (NC_017331) в штамме S. aureus 85/2082, размер которого составляет 67 тыс. н.п., SCCmec III.1.1.4 не содержит элемент SCCmecHg (протяженностью около 35 тыс. н.п.), содержащий гены mer оперона, обеспечивающие резистентность к ионам ртути и встроенную плазмиду pT181, несущую ген tetK, кодирующий резистентность к тетрациклину. SCCmec III.1.1.4 так же существенно отличается от присутствующего в штамме S. aureus OC3 элемента SCCmec III.1.1.2 размером 61780 н.п. (AB983237), который содержит большой фрагмент SCCmecHg, но не несет плазмиду pT181. Проведенный анализ аминокислотной последовательности продуктов генов комплекса mec в штаммах — представителях различных субклонов ST239 (см. табл. 1, табл. 3) показал, что продукт гена mecA в штамме SA943 имеет аминокислотную последовательность, отличную от таковой в референсных штаммах S. aureus Col, N315, и характеризуется наличием двух аминокислотных замен в позициях 146 и 246. Подобные замены выявлены только в штаммах S. aureus, выделенных в Турции (Mu7 и DEU15). Продукт гена mecR1 образован 585 аминокислотными остатками, идентичен подобному в штамме BK16704, выделенном в Румынии, но отличается от таких представителей Евразийского субклона, как S. aureus T0131 (561 аминокислота) и S. aureus 16K (551 аминокислота), но при этом сходен с подобным в других штаммах этого субклона, таким, например, как S. aureus CN79, выделенным в Китае, а также в штаммах — представителях Южноазиатского, Южноамериканского и Австралийского/Новозеландского субклонов. В последовательности гена mecI был выявлен внутренний стоп-кодон, в результате которого данный ген рассматривается как псевдоген, что сближает его с подобными генами в штаммах различных субклонов, за исключением Австралийского/Новозеландского, у которого имеется полноразмерный ген, кодирующий протеин размером 123 аминокислотных остатка. Продукт гена рекомбиназы ccrC, напротив, оказался идентичным только со штаммами Евразийского субклона. Степень его сходства со штаммами других субклонов не превышала 96,32%. Таким образом, мозаичность характерна не только для структурной организации самой кассеты тип III, но и затрагивает нуклеотидную последовательность генов комплекса mec класса A, а также дополнительного комплекса рекомбиназ ccrC, который может быть расположен как в составе кассеты, так и находиться на транспозоне. Эти данные наглядно подтверждают высказанную ранее точку зрения о том, что регионы SCCmec являются нестабильными мобильными элементами, и подвержены многочисленным генетическими перестройкам [26]. Тем не менее эти структурные перестройки, по-видимому, не влияют на эпидемический потенциал представителей клона.

Таблица 3. Сходство аминокислотной последовательности продуктов генов комплекса mec и рекомбиназы ccrC в штамме SA943 с аналогичными в штаммах — представителях различных субклонов ST239

Примечание. н/о — не обнаружено; жирным шрифтом выделено сходство аминокислотного состава; курсивом выделены различия в идентичности аминокислотной последовательности.

1 — Евразийский субклон; 2 — Австралийский/Новозеландский субклон; 3 — Южноазиатский субклон; 4 — Южноамериканский/Ближневосточный субклон; 5 — Португальский субклон; 6 — псевдоген; * — внутренний стоп-кодон; ** — частично делетирован.

Геномный остров υSAα (тип I) содержал гены рестрикции-модификации, набор генов суперантиген-подобных протеинов (SSl 1-10), кластер генов липопротеинов и был сходен с подобным в штамме N315 (BA000018.3). Геномный остров υSAβ был сходен по строению с таким же в штамме S. aureus MW2 (BA000033.2) и содержал гены лейкоцидина LukE/D, гены, кодирующие бактериоцины и оперон, кодирующий сериновые протеазы splA, splB, splC, splF. Особенностью этого острова было наличие обширной делеции размером 1744 н.п., которая привела к утрате двух протеаз — splE и splD. Были выявлены еще несколько регионов, имеющих признаки островов патогенности. При анализе с использованием программы BLASTn было установлено, что фрагмент геномной ДНК размером 34314 н.п. (контиг 22) был сходен (99,98% идентичности) с геномной ДНК в штамме T0131. В составе контига был выявлен небольшой регион размером около 3000 н.п., на котором присутствовали гены, кодирующие суперантигены SEQ и SEK, совместно с интегразой и еще несколькими белками, специфичными для острова патогенности. Данный регион был схожим с подобным фрагментом в составе SaPI1 (AB983198.1) штамма OC3, а также в составе транспозона Tn557 (U93688.2). Еще несколько мелких контигов (47, 71, 72, 100, 101) были схожими с отдельными регионами острова патогенности штамма OC3. Фрагмент геномной ДНК протяженностью 15475 (36 контиг) имел наибольшее сходство с геномной ДНК в штамме T0131 (100% покрытие, 99,98% идентичности) и признаки острова патогенности (специфические белки, включая сайт-специфическую терминазу). Были выявлены гены, кодирующие субъединицы лейкоцидина LukG/H и сфингомиелиназу (бета-гемолизин). Выявили 5 неполных профаговых областей протяженностью 28; 25,8; 19,8; 9,7 и 8,3 тыс. н.п. соответственно. Область протяженностью 28 тыс. н.п. проявляла наибольшее сходство (98—99% идентичности) с последовательностями фагов 53 (PHAGE_Staphy_53NC_007049) и 85 (PHAGE_Staphy_85NC_007050) из Международного фагового набора (BIS) для типирования S. aureus, а также фагом phiNM2 в штамме S. aureus Newman (PHAGE_Staphy_phinm2NC_028913). Анализ профаговой области размером 25857 н.п. выявил ее сходство с профагами в штаммах S. aureus N315 (NC_004740), Newman (NC_008617), а также фагом φSA3 в штамме S. aureus OC8 (LC129040.1), принадлежащем к ST8. Однако в отличие от полноразмерных профагов (около 43,3 тыс. н.п.) данная область не содержала большинства генов кластера иммунного ускользания (IEC), за исключением гена, кодирующего энтеротоксин А. Еще одна профаговая область протяженностью 8,3 тыс. н.п. оказалась сходной с фагами 77 (NC_005356), 52А (NC_007062), 80 (NC_030652) из BIS, а также с профагом (AB983235.1) в штамме S. aureus OC3 (98% идентичности). Остальные 2 профаговых региона не проявляли сходства известными стафилококковыми фагами, но были выявлены в геномах других штаммов S. aureus. Так, регионы, сходные с областью протяженностью 9,7 тыс. н.п., присутствовали в геномах штаммов S. aureus JKD6004, Bmb9393, T0131, Z172 (100% покрытие, 100% идентичность). Область протяженностью 19 959 н.п. оказалась сходной с геномной ДНК в штамме S. aureus WSH-SK (CP031537.1). Кроме того, в составе генома SA943 были обнаружены несколько типов IS элементов, большинство из которых принадлежали семействам IS5/IS1182, IS200/IS605, а также IS6 и IS256. Данные PlasmidFinder свидетельствовали об отсутствии плазмид в изучаемом геноме.

Анализ общего набора неконсервативных белок-кодирующих генов, также как и анализ последовательностей консервативных генов, выявил наибольшую близость со штаммами S. aureus, выделенными на территории Турции (Измир, 2008–2009 гг.). Минимальные отличия имели штаммы S. aureus DEU2 (Турция, Измир, 2009 г.) и S. aureus DEU15 (Турция, Измир, 2008 г.), с которыми у SA943 оказались общими 2800 из 2841 тестированных групп ортологичных белок-кодирующих генов (из 2841, присутствующего у SA943). Достаточно близкими оказались и выделенные в Китае штаммы S. aureus CN79 и S. aureus BJ2002: 2786 и 2787 общих групп соответственно; однако со штаммом S. aureus T0131 число общих групп генов оказалось несколько меньше, чем ожидалось, и составило 2784. При сравнении со штаммом OC3 было выявлено 2737 общих групп, а со штаммом 16К — только 2697. Существенные различия между геномами SA943 и NCTC8325 были также подтверждены, у этих штаммов общими оказались только 2504 группы из 2841. Результаты секвенирования позволили выявить не только принадлежность SA943 к Евразийскому субклону ST239 (отсутствие гена, кодирующего фибриногенсвязующий белок B, mer оперона в составе SCCmec; наличие дополнительного комплекса рекомбиназ, а также генов splA и splB в составе оперона сериновых протеаз при отсутствии splE), но и целый ряд генетических особенностей, отличающих его как от штамма S. aureus 16K, так и от штамма OC3.

Результаты полногеномного секвенирования S. aureus 943 представлены в DDBJ/ENA/GenBank под номером QLNS00000000, а также в архиве коротких ридов NCBI SRA accession PRJNA476233.

Обсуждение

В последние десятилетия получены многочисленные доказательства, свидетельствующие о том, что только ограниченное число клональных вариантов MRSA имеют наибольшее значение в патологии человека. К числу таких эпидемически наиболее успешных генетических вариантов и принадлежит гибридный эпидемический клональный комплекс СС8/СС239 и в особенности входящий в его состав эпидемический штамм ST239. В настоящем исследовании впервые представлены данные о генетической организации штамма S. aureus SA943, ST239-SCCmecIII spa t-18470. Наличие одной нуклеотидной замены в структуре вариабельного фрагмента гена spa отличает его от доминирующего в стационарах Центрального и Северо-Западного регионов РФ эпидемического варианта ST239-SCCmecIII spa t-030 [14,15]. Выявлено наличие у этого штамма более 60 генов, кодирующих факторы патогенности. Несмотря на сходство структуры регионов, ассоциированных с SCCmec, у S. aureus 16K и SA943, данные об аминокислотной последовательности гена mecR1 с уверенностью позволяют заключить, что эти штаммы не являются близко родственными. Необходимо отметить, что продукты генов mecA и mecR1 SA943 идентичны подобным у штамма S. aureus OC3, тем не менее структурная организация кассет различается, различна и аминокислотная последовательность продукта гена рекомбиназы ccrC. Помимо структурных особенностей кассеты mec штамм SA943 отличается от OC3 содержанием и других мобильных элементов, включая профаги, острова патогенности, IS элементы. Набор генов патогенности также различен. В отличие от OC3 в геноме SA943 отсутствует ген, кодирующий токсин синдрома токсического шока, но присутствует ген, кодирующий энтеротоксин А. Различия затрагивают спектр цитолитических токсинов (SA943 содержит интактный ген, кодирующий бета-гемолизин, гемолизин Ш, лейкоцидин Luk G/H), набор генов адгезинов, кластеры генов, кодирующих суперантиген-подобные белки, а также сериновые протеазы. Данные проведенного геномного анализа свидетельствуют о существенных различиях и в структуре консервативной части генома представителей ST239, при этом различия между SA943 и 16K составили 143 гена, тогда как со штаммом OC3 — 248 генов. На основании отсутствия в геноме SA943 генов, кодирующих генов fnbB, splE данный штамм согласно классификации [12] следует отнести к Евразийскому субклону, однако ряд существенных генетических особенностей отличает его от представителей этой группы. Можно предположить его более позднее происхождение и более тесную генетическую взаимосвязь с представителями других субклонов.

Одной из отличительных особенностей ST239 является его множественная резистентность к антимикробным препаратам, которая, по-видимому, и обеспечивает данному штамму значительные преимущества для распространения в стационарах. Исследуемый нами штамм несет гены устойчивости к 8 классам антимикробных препаратов, включая фторхинолоны и римфампицин, сохраняя чувствительность к ограниченному числу антибиотиков, таких как ванкомицин, тигециклин, линезолид и даптомицин. Формирование устойчивости к цефтаролину у представителя этого успешного эпидемического клона представляет значительную угрозу и делает необходимостью проводить дополнительные исследования при использовании названного антибиотика в стационарах, где MRSA стали эндемичными. Эти исследования становятся тем более актуальными в связи с появлением сообщений о нарастании доли штаммов устойчивых цефтаролину среди MRSA, выделенных в стационарах Турции [27]. Есть сообщения о выделении штаммов ST239 со сниженной чувствительностью к ванкомицину и устойчивых к даптомицину [28, 29]. Накопленные данные свидетельствуют о способности представителей именно этой генетической линии очень быстро адаптироваться к изменяющимся условиям стратегии антимикробной терапии, используемой в стационарах. Появление кассет mec меньших по размеру может послужить предпосылкой для их передачи в штаммы других сиквенс-типов и дальнейшего формирования новых, в том числе и внебольничных штаммов MRSA по аналогии со штаммами, содержащими кассету IV типа. Среди охарактеризованных с использованием ДНК-микрочипов в работе Monecke представлены данные о штаммах, выделенных в 2011—2012 гг. в Москве, Санкт-Петербурге, Челябинске и Кургане spa типов t-030, t-632 и t-4238 и отнесенные авторами к Евразийскому, Южноазиатскому и Португальскому субклонам. Однако эти результаты необходимо подкрепить данными их полногеномного секвенирования. Тем не менее полученные нами результаты, а также данные [12] позволяют заключить, что было несколько эпизодов заноса представителей ST239 в российские стационары. Результаты полногеномного секвенирования не только расширяют представления о патогенном потенциале представителей ST239, но и заставляют пересмотреть подходы к проведению молекулярного мониторинга MRSA. Совершенно очевидно, что схема типирования должна включать наряду с определением сиквенс-типа по результатам MLST обязательное проведение spa-типирования, а также исследование дополнительных генетических маркеров в составе кассет mec и мобильных элементов, кодирующих токсины, обладающие суперантигенной активностью. Накопленные к настоящему времени данные свидетельствуют о значительной дивергенции представителей ST239, но пока не позволяют ответить на ключевой вопрос о генетических механизмах, обеспечивающих данному клону столь широкое географическое распространение. Можно только предполагать, что наличие мощного патогенного потенциала, способности активно противостоять действию иммунной системы макроорганизма в совокупности с арсеналом механизмов, обеспечивающих резистентность ко многим антимикробным препаратам, обеспечивают ему в отсутствии эффективных мер инфекционного контроля возможность длительное время циркулировать на «захваченных территориях». Появление представителей ST239 в стационарах следует рассматривать как сигнал эпидемического неблагополучия, предусматривающий проведение всего комплекса противоэпидемических мероприятий, направленных на их немедленную элиминацию.

Благодарность. Коллектив авторов выражает благодарность за техническую помощь в оформлении публикации Шабановой Александре.

Финансирование. Работа проведена в рамках выполнения Государственного задания (№115030470036, №АААА-А18-118032390061-0).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.