Введение
Респираторные болезни причиняют экономический ущерб молочному скотоводству, вызывая гибель или снижение скорости роста животных, увеличивая затраты на лечение, проведение диагностических и профилактических мероприятий [1—3].
Респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) крупного рогатого скота (КРС), являющийся по международной классификации Bovine orthopneumovirus или Bovine respiratory syncytial virus (BRSV) одним из этиологических агентов респираторных болезней, относится к семейству Pneumoviridae, роду Orthopneumovirus [4]. Респираторно-синцитиальная инфекция (РСИ) КРС регистрируется во всех странах мира, где развит интенсивный тип ведения животноводства [5, 6].
У восприимчивых животных вирус вызывает бронхиолиты, бронхиты, интерстициальную пневмонию и эмфизему легких [5, 7].
Впервые о выявлении РСИ КРС в нашей стране было сообщено в 1975 г. [8]. Многие исследователи в своих работах уделили большое внимание изучению особенностей распространения болезни и разработке средств и методов ее диагностики [9—12].
Актуальными являются определение эпизоотической ситуации по РСИ КРС в крупных молочных животноводческих хозяйствах, особенно с наличием импортированного скота, исследование тропизма вируса к органам респираторного тракта и его количественная оценка в них. Такие исследования необходимы для оптимизации противоэпизоотических мероприятий, изучения эффективности вакцин и противовирусных препаратов для животных [13—16].
Известно, что РСВ КРС проявляет близкое родство с РСВ человека и вызывает у телят клинические симптомы и патологические изменения, сходные с таковыми у детей [7, 16].
В настоящее время надежной модели РСИ человека не существует, хотя предпринимались попытки воспроизведения инфекции на шимпанзе [16], крупном рогатом скоте [17, 18], овцах [18], хлопковых крысах [19], мышах [20, 21].
Предполагается, что КРС может представлять собой альтернативную модель инфекции человека и использоваться не только для изучения конечной концентрации вируса в легких, как у хлопковых крыс или обезьян, но и для оценки динамики изменения клинических симптомов и концентрации вируса на каждой стадии болезни [20].
Количественная оценка накопления РСВ КРС в легких затруднительна по причине слабого размножения вируса в культуре клеток. Перспективным в этом направлении может быть использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. В доступной зарубежной литературе есть сообщения об оценке титра вируса при искусственном заражении телят-гнотобионтов только в назофарингеальных смывах или бронхоальвеолярном лаваже [22, 23], о поражении легких вирусом судили по результатам иммуногистохимического исследования легочной ткани [24—26].
С помощью количественной ПЦР возможно определить концентрацию возбудителей, которые плохо размножаются в культурах клеток или легко разрушаются. При этом для оценки сохранности нуклеиновых кислот в пробах применяют скрининг эталонных генов: 18S рРНК, GAPDH, ACTB, PRKG1, TBP и др. [27], экспрессия которых может варьировать в зависимости от вида ткани и условий эксперимента.
В настоящее время в качестве эталона (положительного контроля) для количественной оценки экспрессии генов в ПЦР используется ген Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). Уровень мРНК GAPDH в различных органах КРС достаточно стабилен [27], поэтому мы использовали его для количественной оценки РНК РСВ КРС.
Цель исследования — разработка ПЦР в реальном времени для выявления и количественной оценки РНК РСВ КРС и с ее помощью изучение количества вирусного генома в органах респираторного тракта у больных животных во время вспышек болезни.
Материал и методы
Исследования проводили на крупных молочных комплексах (мегафермы) в момент вспышек массовых респираторных болезней животных. Всего исследовали 273 пробы биоматериала, отобранные случайным образом от телят, возраст которых составлял от 10 дней до 6 мес: 171 пробу легких, 45 — носовых выделений, 24 — экссудата из трахеи, бронхов и носовых синусов, 14 — слизистой оболочки бронхов и трахеи, 10 — лимфатических узлов и 9 — бронхов, отобранных от павших и вынужденно убитых с диагностической целью животных. Пробы доставляли в замороженном состоянии или транспортной среде в течение не более 12 ч с момента отбора в лаборатории, в которой хранили при –80 оС.
Перед исследованием пробы биоматериала растирали в фарфоровых ступках со стерильным песком, гомогенизировали и готовили 10% суспензии на физиологическом растворе, которые центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об/мин и исследовали в ОТ-ПЦР. Густые пробы носовых выделений и экссудата перед центрифугированием разводили стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:5. Для выделения РНК использовали по 100 мкл осветленного супернатанта.
В работе использовали штамм вируса РСВ КРС РС-Б, полученный из БелНИИЭВ им. С.Н. Вышелесского. Концентрация вируса была определена методом титрования в первично-трипсинизированной культуре легких теленка и составила 103,5 ТЦД50/см3.
Экстракция РНК и обратная транскрипция
РНК выделяли из 100 мкл гомогенизата органов или носовых выделений с помощью набора Литех (Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Очищенную РНК ресуспендировали в 50 мкл РНК-буфера. Для проведения обратной транскрипции использовали 10 мкл выделенной РНК. Реакцию проводили с помощью набора Реверта-L (Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. После проведения реакции объем пробы составлял 40 мкл.
Праймеры и зонды
Подбор праймеров и зондов осуществляли с использованием нуклеотидных последовательностей, полученных из международной базы данных GenBank. При выравнивании полученных последовательностей, а также анализе и расчете праймеров и зондов, изучении их специфичности применяли компьютерные программы Vector NTI 9.0 (Informax, США) и интернет-ресурсы базы данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI) в режиме онлайн. В качестве внутреннего контроля использовали праймеры и зонды к мРНК гена GAPDH крупного рогатого скота (табл. 1).
Таблица 1. Праймеры и зонды, использованные в работе для проведения ПЦР в режиме реального времени
| Вид | Ген | Последовательности | Размер (п.н.) | Источник |
| BRSV | Протеин нуклеокапсида (N) | 5-ATGCTGCAGGACTAGGTATAATGG-3 5-ACACTGTAATTGATGACCCCATTCTC-3 5-(FAM) ATGCTGCCAAAGCATATGCGGAACA CA-3(BHQ1) | 120 | Собственная разработка |
| Bos taurus | GAPDH | 5-GATGGTGAAGGTCGGAGTGAAC-3 5-GTCATTGATGGCGACGATGT-3 5-(ROX)-CTGGTCACCAGGGCTGCTT-3(BHQ2) | 100 | [27] |
Постановка ПЦР
ПЦР проводили в 30 мкл смеси, содержащей 5 мкл кДНК, 10 pMol каждого праймера и зонда, готовую смесь реактивов БиоМастер ПЦР-РВ («Биолабмикс», Россия). Программа амплификации: 5 мин 95 °C, затем 45 циклов 95 °C 15 с и 60 °C 1 мин.
Положительные контрольные образцы
Положительные контрольные образцы были получены в результате клонирования синтезированных ДНК-фрагментов, несущих вирусоспецифическую вставку, в плазмиду pCR2.1 (Invitrogen, США) с использованием для трансформации клеток Escherichia coli линии TOP 10 (Invitrogen).
Определение концентрации ДНК
Для определения концентрации плазмидной ДНК применяли коммерческий набор реагентов Quant-iT DNA HS (Invitrogen) и флуориметра QUBIT (Invitrogen).
Количественная оценка вирусной РНК
Для расчета количества РНК в образце была построена стандартная кривая амплификации с 10-кратными разведениями положительных контрольных образцов для генов гликопротеина N и GAPDH с известной концентрацией. Количество РНК вируса и GAPDH в образце оценивали путем сопоставления Ct образца со стандартной кривой и выражали в log10 копий РНК вируса на 105 копий GAPDH (log10 BRSV/GAPDH) [15].
Верифицикация результатов
Для верификации результатов дополнительно проводили исследование проб биоматериала тест-системой на основе ПЦР для диагностики РСИ КРС, разработанной в ИЭВСиДВ СФНЦА РАН: свидетельство о Госрегистрации №ПВР-1-8.9/02499. Данная тест-система была разработана для выявления фрагмента гена гликопротеина F-вируса.
Результаты и обсуждение
В табл. 1 приведены нуклеотидные последовательности праймеров и зондов. Специфичность выбранных олигонуклеотидов на этапе расчетов анализировали, применяя программу nucleotide Blast NCBI. По результатам исследований, установили, что выбранные праймеры и зонды не имели гомологии с ДНК КРС и основными вирусами, участвующими в этиологии респираторных болезней: вирус инфекционного ринотрахеита (Bovine herpes virus type 1, BoHV-1), вирус вирусной диареи (Bovine pestivirus type A, B, H, (BVDV)), коронавирус (Bovine coronavirus, BoCV), риновирус (Bovine Rhinovirus, BoRV) и вирус парагриппа-3 (Bovine parainfluenza type 3 virus, PI-3).
Положительные контрольные образцы (ПКО) использовали для оценки эффективности прохождения ПЦР в реальном времени, для чего были приготовлены последовательные 10-кратные их разведения. Исследование проводили в трех повторностях. Разведения ПКО вносили по 5 мкл на реакцию. Чувствительность реакции для выявления гена нуклеопротеина N РСВ КРС составила 2,5·103 геномных эквивалентов на 1 см3, а гена GAPDH — 1,2·103 геномных эквивалентов на 1 см3 с сильной линейной зависимостью (R2) — 0,9873 и 0,9976 соответственно. Коэффициент воспроизводимости для разных разведений колебался от 0,32 до 3,57%, что свидетельствует о высокой эффективности реакции (табл. 2).
Таблица 2. Точность количественного определения ПКО BRSV и GAPDH
| ПКО | Пороговый цикл (Ct) различных концентраций ПКО (log10/см3) | R2 | |||||||
| 9 | 8 | 7 | 6 | 5 | 4 | 3 | |||
| BRSV | Ср. Ct±Ст.О. | 13,39±0,39 | 15,55±0,55 | 18,92±0,30 | 22,82±0,20 | 24,70±0,12 | 28,99±0,86 | 33,84±0,66 | 0,9873 |
| КВ, % | 2,88 | 3,54 | 1,60 | 0,86 | 0,49 | 0,32 | 0,65 | ||
| GAPDH | Ср. Ct±Ст.О. | 16,74±0,60 | 19,47±0,46 | 22,26±0,58 | 26,45±0,46 | 29,44±0,32 | 32,71±0,37 | 35,76±0,31 | 0,9976 |
| КВ, % | 3,57 | 2,35 | 2,61 | 1,75 | 1,07 | 1,13 | 0,87 | ||
Примечание. Начальная концентрация положительных образцов составила 2,5·1010 ГЭ/мл для BRSV, и 1,2·1010 ГЭ/мл для GAPDH. Среднее Ct±стандартное отклонение (Ст.О.). Коэффициент вариации (КВ).
С помощью тестирования 10-кратных разведений контрольного штамма РСВ КРС РС-Б с заранее определенной концентрацией, равной 103,5 ТЦД50/см3, была оценена эффективность реакции для количественной оценки концентрации вирусной РНК. Для этого приготовили 7 последовательных 10-кратных разведений вируса, из которых выделили РНК и исследовали в ПЦР, а ее результаты сопоставили с данными кривой разведений ПКО. Предел чувствительности реакции составил 100,5 ТЦД50/см3 (рисунок), что соответствовало 5 log10 ПКО/см3.
Эффективность амплификации разведений штамма РС-Б относительно разведений ПКО.
График стандартной кривой разведений ПКО BRVS построен на основании среднего трех повторных измерений. Приведены коэффициент детерминации (R2) и уравнение регрессии кривой (у). + — пороговый цикл для разведений штамма РС-Б.
С использованием разработанной ПЦР исследовали 273 пробы биоматериала от животных. Вирус выявили в 53 пробах, что составило 19,4% (табл. 3).
Таблица 3. Результаты выявления вируса РСИ КРС методом ПЦР в пробах биоматериала различного происхождения (n=273)
| Биоматериал | Количество исследованных проб/положительных | Количество положительных проб от количества исследованных, % | Концентрация вируса в пробе, log10 копий РНК BRSV/GAPDH |
| Носовые выделения | 45/6 | 2,2 | 1,5±0,75—2,1±0,25 |
| Экссудат из трахеи, бронхов, носовых синусов | 24/11 | 4,03 | 0,3±0,21—2,8±0,15 |
| Слизистая оболочка трахеи и бронхов | 14/2 | 0,73 | 0,3±0,21—1,3±0,21 |
| Бронхи | 9/3 | 1,1 | 0,5±0,03—1,2±0,29 |
| Легкие | 171/29 | 10,61 | 1,3±0,5—4,8±0,47 |
| Легочные лимфатические узлы | 10/2 | 0,73 | 0,1±0,03—0,3±0,03 |
| Всего | 273/53 | 19,4 | 0,6±0,28—2,08±0,23 |
Из данных табл. 3 видно, что геном вируса чаще выявляли в легких — 10,61% положительных проб, пробах трахеального и бронхиального экссудатов — 4,03%, носовых выделениях — 2,2% и бронхах — 1,1%. Реже вирус обнаруживали в слизистой оболочке трахеи и бронхов, а также в легочных лимфатических узлах — по 0,73% положительных проб. Концентрация вируса в пробах биоматериала различалась, что, возможно, свидетельствует о различных стадиях развития инфекции у животных, при которых они были отобраны. Максимальные концентрации генома вируса определяли в легких (1,3±0,5—4,8±0,47 log10 копий РНК BRSV/GAPDH), носовых выделениях (1,5±0,75—2,1±0,25 log10 копий РНК BRSV/GAPDH) и экссудате трахеи, бронхов и носовых синусов (0,3±0,21—2,8±0,15 log10 копий РНК BRSV/GAPDH).
Результаты в 100% случаев совпадали с данными, полученными при исследовании этих же образцов биоматериала при помощи ранее разработанной тест-системы с электрофоретической детекцией продуктов амплификации.
При создании набора для ПЦР в реальном времени, позволяющего провести идентификацию и количественную оценку РНК РСВ КРС в пробах биоматериала от животных, нами был выбран ген оболочечного гликопротеина N-вируса, поскольку он является одним из наиболее консервативных генов. В качестве гена сравнения и контроля ПЦР использовали мРНК гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH), поскольку она наиболее стабильно экспрессируется в легких КРС на высоком уровне. Обе реакции обладали высокой чувствительностью и воспроизводимостью. Коэффициент воспроизводимости для разных разведений колебался от 0,32 до 3,57%, что свидетельствует о высокой эффективности реакции (см. табл. 2).
С помощью тестирования 10-кратных разведений контрольного штамма РСВ КРС РС-Б с известной концентрацией была определена диагностическая чувствительность реакции. Концентрация вируса, равная 103,5 ТЦД50/см3, соответствовала 8 log10 ПКО, а концентрация 100,5 ТЦД50/см3 — 5 log10 ПКО. Наши результаты в общем виде согласуются с данными зарубежных исследователей, сообщавших о высокой чувствительности количественной ПЦР, равной 0,1 ТЦД50/см3 при тестировании вакцинного вируса и проб транстрахеальных лаважей от больных телят [28, 29].
Ранее нами было изучено распространение вируса в органах респираторного тракта телят, больных РСИ, при помощи ПЦР в электрофорезном формате, однако концентрацию агента определить не удалось по причине ограничения метода [30]. В настоящей работе при помощи количественной ПЦР в режиме реального времени нами была предпринята попытка определения количества генома вируса в пробах, отобранных от больных телят случайным образом, без учета стадии развития инфекции.
В нашей работе максимальное накопление вируса происходило в легких и носовых выделениях, что подтверждает данные об его тропизме к интерстицию легочной ткани [5, 7]. Концентрация вируса в бронхах была ниже, чем в легких, что может быть связано с миграцией возбудителя со слизистой оболочки в ткань легких и вызванными деструктивными изменениями в ней. Косвенным подтверждением этому является наличие интерстициальной пневмонии и эмфиземы легких при вскрытии трупов обследуемых телят.
Заключение
Проведена работа по созданию набора компонентов для выявления и количественного определения РНК РСВ КРС в пробах биоматериала от животных при естественном заражении во время вспышек инфекции. В результате определения диагностической и аналитической чувствительности набора показано, что он обладает высокой специфичностью и чувствительностью, благодаря чему может быть использован для идентификации и определения количества РСВ КРС при изучении патогенеза болезни, эффективности вакцин или противовирусных препаратов.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.