Разработка и испытание полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для идентификации и количественного определения респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота

Респираторные болезни причиняют экономический ущерб молочному скотоводству, вызывая гибель или снижение скорости роста животных, увеличивая затраты на лечение, проведение диагностических и профилактических мероприятий [1—3].

Респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) крупного рогатого скота (КРС), являющийся по международной классификации Bovine orthopneumovirus или Bovine respiratory syncytial virus (BRSV) одним из этиологических агентов респираторных болезней, относится к семейству Pneumoviridae, роду Orthopneumovirus [4]. Респираторно-синцитиальная инфекция (РСИ) КРС регистрируется во всех странах мира, где развит интенсивный тип ведения животноводства [5, 6].

У восприимчивых животных вирус вызывает бронхиолиты, бронхиты, интерстициальную пневмонию и эмфизему легких [5, 7].

Впервые о выявлении РСИ КРС в нашей стране было сообщено в 1975 г. [8]. Многие исследователи в своих работах уделили большое внимание изучению особенностей распространения болезни и разработке средств и методов ее диагностики [9—12].

Актуальными являются определение эпизоотической ситуации по РСИ КРС в крупных молочных животноводческих хозяйствах, особенно с наличием импортированного скота, исследование тропизма вируса к органам респираторного тракта и его количественная оценка в них. Такие исследования необходимы для оптимизации противоэпизоотических мероприятий, изучения эффективности вакцин и противовирусных препаратов для животных [13—16].

Известно, что РСВ КРС проявляет близкое родство с РСВ человека и вызывает у телят клинические симптомы и патологические изменения, сходные с таковыми у детей [7, 16].

В настоящее время надежной модели РСИ человека не существует, хотя предпринимались попытки воспроизведения инфекции на шимпанзе [16], крупном рогатом скоте [17, 18], овцах [18], хлопковых крысах [19], мышах [20, 21].

Предполагается, что КРС может представлять собой альтернативную модель инфекции человека и использоваться не только для изучения конечной концентрации вируса в легких, как у хлопковых крыс или обезьян, но и для оценки динамики изменения клинических симптомов и концентрации вируса на каждой стадии болезни [20].

Количественная оценка накопления РСВ КРС в легких затруднительна по причине слабого размножения вируса в культуре клеток. Перспективным в этом направлении может быть использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. В доступной зарубежной литературе есть сообщения об оценке титра вируса при искусственном заражении телят-гнотобионтов только в назофарингеальных смывах или бронхоальвеолярном лаваже [22, 23], о поражении легких вирусом судили по результатам иммуногистохимического исследования легочной ткани [24—26].

С помощью количественной ПЦР возможно определить концентрацию возбудителей, которые плохо размножаются в культурах клеток или легко разрушаются. При этом для оценки сохранности нуклеиновых кислот в пробах применяют скрининг эталонных генов: 18S рРНК, GAPDH, ACTB, PRKG1, TBP и др. [27], экспрессия которых может варьировать в зависимости от вида ткани и условий эксперимента.

В настоящее время в качестве эталона (положительного контроля) для количественной оценки экспрессии генов в ПЦР используется ген Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). Уровень мРНК GAPDH в различных органах КРС достаточно стабилен [27], поэтому мы использовали его для количественной оценки РНК РСВ КРС.

Цель исследования — разработка ПЦР в реальном времени для выявления и количественной оценки РНК РСВ КРС и с ее помощью изучение количества вирусного генома в органах респираторного тракта у больных животных во время вспышек болезни.

Исследования проводили на крупных молочных комплексах (мегафермы) в момент вспышек массовых респираторных болезней животных. Всего исследовали 273 пробы биоматериала, отобранные случайным образом от телят, возраст которых составлял от 10 дней до 6 мес: 171 пробу легких, 45 — носовых выделений, 24 — экссудата из трахеи, бронхов и носовых синусов, 14 — слизистой оболочки бронхов и трахеи, 10 — лимфатических узлов и 9 — бронхов, отобранных от павших и вынужденно убитых с диагностической целью животных. Пробы доставляли в замороженном состоянии или транспортной среде в течение не более 12 ч с момента отбора в лаборатории, в которой хранили при –80 ^оС.

Перед исследованием пробы биоматериала растирали в фарфоровых ступках со стерильным песком, гомогенизировали и готовили 10% суспензии на физиологическом растворе, которые центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об/мин и исследовали в ОТ-ПЦР. Густые пробы носовых выделений и экссудата перед центрифугированием разводили стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:5. Для выделения РНК использовали по 100 мкл осветленного супернатанта.

В работе использовали штамм вируса РСВ КРС РС-Б, полученный из БелНИИЭВ им. С.Н. Вышелесского. Концентрация вируса была определена методом титрования в первично-трипсинизированной культуре легких теленка и составила 10^3,5 ТЦД₅₀/см³.

РНК выделяли из 100 мкл гомогенизата органов или носовых выделений с помощью набора Литех (Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Очищенную РНК ресуспендировали в 50 мкл РНК-буфера. Для проведения обратной транскрипции использовали 10 мкл выделенной РНК. Реакцию проводили с помощью набора Реверта-L (Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. После проведения реакции объем пробы составлял 40 мкл.

Подбор праймеров и зондов осуществляли с использованием нуклеотидных последовательностей, полученных из международной базы данных GenBank. При выравнивании полученных последовательностей, а также анализе и расчете праймеров и зондов, изучении их специфичности применяли компьютерные программы Vector NTI 9.0 (Informax, США) и интернет-ресурсы базы данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI) в режиме онлайн. В качестве внутреннего контроля использовали праймеры и зонды к мРНК гена GAPDH крупного рогатого скота (табл. 1).

Таблица 1. Праймеры и зонды, использованные в работе для проведения ПЦР в режиме реального времени

ПЦР проводили в 30 мкл смеси, содержащей 5 мкл кДНК, 10 pMol каждого праймера и зонда, готовую смесь реактивов БиоМастер ПЦР-РВ («Биолабмикс», Россия). Программа амплификации: 5 мин 95 °C, затем 45 циклов 95 °C 15 с и 60 °C 1 мин.

Положительные контрольные образцы были получены в результате клонирования синтезированных ДНК-фрагментов, несущих вирусоспецифическую вставку, в плазмиду pCR2.1 (Invitrogen, США) с использованием для трансформации клеток Escherichia coli линии TOP 10 (Invitrogen).

Для определения концентрации плазмидной ДНК применяли коммерческий набор реагентов Quant-iT DNA HS (Invitrogen) и флуориметра QUBIT (Invitrogen).

Для расчета количества РНК в образце была построена стандартная кривая амплификации с 10-кратными разведениями положительных контрольных образцов для генов гликопротеина N и GAPDH с известной концентрацией. Количество РНК вируса и GAPDH в образце оценивали путем сопоставления Ct образца со стандартной кривой и выражали в log₁₀ копий РНК вируса на 10⁵ копий GAPDH (log₁₀ BRSV/GAPDH) [15].

Для верификации результатов дополнительно проводили исследование проб биоматериала тест-системой на основе ПЦР для диагностики РСИ КРС, разработанной в ИЭВСиДВ СФНЦА РАН: свидетельство о Госрегистрации №ПВР-1-8.9/02499. Данная тест-система была разработана для выявления фрагмента гена гликопротеина F-вируса.

В табл. 1 приведены нуклеотидные последовательности праймеров и зондов. Специфичность выбранных олигонуклеотидов на этапе расчетов анализировали, применяя программу nucleotide Blast NCBI. По результатам исследований, установили, что выбранные праймеры и зонды не имели гомологии с ДНК КРС и основными вирусами, участвующими в этиологии респираторных болезней: вирус инфекционного ринотрахеита (Bovine herpes virus type 1, BoHV-1), вирус вирусной диареи (Bovine pestivirus type A, B, H, (BVDV)), коронавирус (Bovine coronavirus, BoCV), риновирус (Bovine Rhinovirus, BoRV) и вирус парагриппа-3 (Bovine parainfluenza type 3 virus, PI-3).

Положительные контрольные образцы (ПКО) использовали для оценки эффективности прохождения ПЦР в реальном времени, для чего были приготовлены последовательные 10-кратные их разведения. Исследование проводили в трех повторностях. Разведения ПКО вносили по 5 мкл на реакцию. Чувствительность реакции для выявления гена нуклеопротеина N РСВ КРС составила 2,5·10³ геномных эквивалентов на 1 см³, а гена GAPDH — 1,2·10³ геномных эквивалентов на 1 см³ с сильной линейной зависимостью (R²) — 0,9873 и 0,9976 соответственно. Коэффициент воспроизводимости для разных разведений колебался от 0,32 до 3,57%, что свидетельствует о высокой эффективности реакции (табл. 2).

Таблица 2. Точность количественного определения ПКО BRSV и GAPDH

Примечание. Начальная концентрация положительных образцов составила 2,5·10¹⁰ ГЭ/мл для BRSV, и 1,2·10¹⁰ ГЭ/мл для GAPDH. Среднее Ct±стандартное отклонение (Ст.О.). Коэффициент вариации (КВ).

С помощью тестирования 10-кратных разведений контрольного штамма РСВ КРС РС-Б с заранее определенной концентрацией, равной 10^3,5 ТЦД_50/см³, была оценена эффективность реакции для количественной оценки концентрации вирусной РНК. Для этого приготовили 7 последовательных 10-кратных разведений вируса, из которых выделили РНК и исследовали в ПЦР, а ее результаты сопоставили с данными кривой разведений ПКО. Предел чувствительности реакции составил 10^0,5 ТЦД_50/см³(рисунок), что соответствовало 5 log₁₀ ПКО/см³.

Эффективность амплификации разведений штамма РС-Б относительно разведений ПКО.

График стандартной кривой разведений ПКО BRVS построен на основании среднего трех повторных измерений. Приведены коэффициент детерминации (R²) и уравнение регрессии кривой (у). + — пороговый цикл для разведений штамма РС-Б.

С использованием разработанной ПЦР исследовали 273 пробы биоматериала от животных. Вирус выявили в 53 пробах, что составило 19,4% (табл. 3).

Таблица 3. Результаты выявления вируса РСИ КРС методом ПЦР в пробах биоматериала различного происхождения (n=273)

Из данных табл. 3 видно, что геном вируса чаще выявляли в легких — 10,61% положительных проб, пробах трахеального и бронхиального экссудатов — 4,03%, носовых выделениях — 2,2% и бронхах — 1,1%. Реже вирус обнаруживали в слизистой оболочке трахеи и бронхов, а также в легочных лимфатических узлах — по 0,73% положительных проб. Концентрация вируса в пробах биоматериала различалась, что, возможно, свидетельствует о различных стадиях развития инфекции у животных, при которых они были отобраны. Максимальные концентрации генома вируса определяли в легких (1,3±0,5—4,8±0,47 log₁₀ копий РНК BRSV/GAPDH), носовых выделениях (1,5±0,75—2,1±0,25 log₁₀ копий РНК BRSV/GAPDH) и экссудате трахеи, бронхов и носовых синусов (0,3±0,21—2,8±0,15 log₁₀ копий РНК BRSV/GAPDH).

Результаты в 100% случаев совпадали с данными, полученными при исследовании этих же образцов биоматериала при помощи ранее разработанной тест-системы с электрофоретической детекцией продуктов амплификации.

При создании набора для ПЦР в реальном времени, позволяющего провести идентификацию и количественную оценку РНК РСВ КРС в пробах биоматериала от животных, нами был выбран ген оболочечного гликопротеина N-вируса, поскольку он является одним из наиболее консервативных генов. В качестве гена сравнения и контроля ПЦР использовали мРНК гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH), поскольку она наиболее стабильно экспрессируется в легких КРС на высоком уровне. Обе реакции обладали высокой чувствительностью и воспроизводимостью. Коэффициент воспроизводимости для разных разведений колебался от 0,32 до 3,57%, что свидетельствует о высокой эффективности реакции (см. табл. 2).

С помощью тестирования 10-кратных разведений контрольного штамма РСВ КРС РС-Б с известной концентрацией была определена диагностическая чувствительность реакции. Концентрация вируса, равная 10^3,5 ТЦД_50/см³, соответствовала 8 log₁₀ ПКО, а концентрация 10^0,5 ТЦД_50/см³ — 5 log₁₀ ПКО. Наши результаты в общем виде согласуются с данными зарубежных исследователей, сообщавших о высокой чувствительности количественной ПЦР, равной 0,1 ТЦД_50/см³ при тестировании вакцинного вируса и проб транстрахеальных лаважей от больных телят [28, 29].

Ранее нами было изучено распространение вируса в органах респираторного тракта телят, больных РСИ, при помощи ПЦР в электрофорезном формате, однако концентрацию агента определить не удалось по причине ограничения метода [30]. В настоящей работе при помощи количественной ПЦР в режиме реального времени нами была предпринята попытка определения количества генома вируса в пробах, отобранных от больных телят случайным образом, без учета стадии развития инфекции.

В нашей работе максимальное накопление вируса происходило в легких и носовых выделениях, что подтверждает данные об его тропизме к интерстицию легочной ткани [5, 7]. Концентрация вируса в бронхах была ниже, чем в легких, что может быть связано с миграцией возбудителя со слизистой оболочки в ткань легких и вызванными деструктивными изменениями в ней. Косвенным подтверждением этому является наличие интерстициальной пневмонии и эмфиземы легких при вскрытии трупов обследуемых телят.

Проведена работа по созданию набора компонентов для выявления и количественного определения РНК РСВ КРС в пробах биоматериала от животных при естественном заражении во время вспышек инфекции. В результате определения диагностической и аналитической чувствительности набора показано, что он обладает высокой специфичностью и чувствительностью, благодаря чему может быть использован для идентификации и определения количества РСВ КРС при изучении патогенеза болезни, эффективности вакцин или противовирусных препаратов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.