Противоопухолевая генная терапия предполагает доставку в клетки опухоли или ее окружения терапевтических генов. К генотерапевтическим препаратам предъявляются следующие требования: 1) направленная доставка в целевые клетки; 2) экспрессия трансгена в целевых клетках; 3) безопасность применения и нетоксичность в отношении нецелевых тканей. Различают вирусные [1] и невирусные способы доставки. Среди последних наибольшую популярность приобретают полиплексы — комплексы с носителями на основе катионных полимеров [2], к числу которых относится полиэтиленимин (ПЭИ), обеспечивающий высокую эффективность трансфекции за счет эффекта «протоновой губки» [3, 4]. Однако ПЭИ обладает рядом недостатков — повышенной цитотоксичностью частиц [5], их неспецифическим взаимодействием с отрицательно заряженными молекулами [6, 7] и отсутствием направленной доставки [8]. Минимизация побочных эффектов достигается за счет модификации ПЭИ и/или добавления в состав полиплекса молекул, придающих ему заданные свойства. Одной из наиболее популярных модификаций полиплексов является добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ) [9]. Ранее нашими коллегами был разработан блок-сополимер ПЭГ-ПЭИ-ТАТ (ППТ) [10], который был успешно апробирован в нашей лаборатории для доставки в опухоль терапевтической плазмиды [11]. Однако недостатком ППТ является отсутствие таргетного действия, поэтому он применим преимущественно для локального, т. е. внутри-опухолевого введения. Альтернативой ПЭГ могут служить гликозаминогликаны, гиалуроновая кислота (ГК) и хондроитинсульфат (ХС), составляющие основу внеклеточного матрикса. Трехкомпонентные комплексы ДНК-ПЭИ-ХС/ГК несут поверхностный отрицательный заряд, препятствующий неспецифическому взаимодействию с отрицательно заряженными белками, обладают пониженной цитотоксичностью и повышенной трансфекционной эффективностью [12, 14]. Помимо этого, ГК и ХС являются лигандами рецептора CD44 [15], представленного на поверхности ряда солидных опухолей, стволовых раковых клеток [16] и ассоциированных с раком фиб-робластов [17], что делает возможным направленную доставку комплексов к опухолевым клеткам и их интернализацию эффективным рецептор-опосредованным эндоцитозом [18].

Цель данной работы — оценка трансфекционной активности ПЭИ-полиплексов с добавлением ХС и их сопоставление с ПЭИ- и ППТ-комплексами. В работе использовали клетки мышиной карциномы кишечника C26, обладающие повышенной представленностью поверхностного антигена CD44 [19].

В работе были использованы линейный ПЭИ 25 кД («Polysciences, Inc.», США), хондроитин сульфат, А («Sigma-Aldrich», США), эмбриональная бычья сыворотка, ростовые среды RPMI-1640 и Opti-MEM I, раствор антибиотиков (пенициллин 100 ед/мл и стрептомицин 100 мкг/мл), 0,05% трипсин-ЭДТА, PBS, Липофектамин 2000 («Thermo Fisher Scientific», США), реагент CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) («Promega», США), блок-сополимер ПЭГ-ПЭИ-ТАТ (ППТ) [10].

ПЭИ растворяли в воде при добавлении 1M HCl до pH 7.0, хондроитин сульфат, А растворяли в воде до концентрации 25 мг/мл, полученные растворы фильтровали через 0,22 мкМ фильтры Millex-cr («Millipore», Германия.

В работе использовали клетки мышиной карциномы кишечника C26. Клетки культивировали в среде RPMI-1640 c 12,5% эмбриональной бычьей сывороткой (далее ростовая среда) с антибиотиками при 37 °C в атмосфере 5% CO₂.

Использовали плазмидную ДНК pEGFP-N1 («Clontech», США) и pGL3-BV («Promega», США). Плазмиды нарабатывали в штамме E. coli DH5α и выделяли с использованием набора Maxi Prep Plasmid («Macherey Nagel», Германия).

N/P/-показатель комплекса представляет собой отношение молей аминов ПЭИ (N) к молям фосфатных групп ДНК (P) и отрицательно заряженных групп Х.С. Для расчетов N/P/- за среднюю массу одного заряда ДНК (P) принимали 330 Да, за среднюю массу одного заряда амина (N) — 43 Да, за среднюю массу двух отрицательных зарядов ХС (–) — 486 Да (с учетом одного иона натрия). Реакцию комплексообразования проводили при концентрации ДНК 40 нг/мкл. Заранее подготавливали растворы ДНК, ПЭИ и ХС в воде или PBS нужной концентрации, чтобы при смешивании одного объема раствора ДНК, одного объема раствора ХС (или двух объемов ДНК в случае двухкомпонентных полиплексов) и двух объемов раствора ПЭИ получать комплексы с заданным отношением N/P/-. Для приготовления двухкомпонентных полиплексов к раствору ДНК добавляли раствор ПЭИ, перемешивали на встряхивателе и далее инкубировали 30 мин при комнатной температуре. При приготовлении трехкомпонентных полиплексов замешивание проводили двумя способами: 1) к раствору ДНК добавляли раствор ПЭИ, перемешивали на встряхивателе, добавляли раствор ХС, перемешивали; 2) к раствору ДНК добавляли раствор ХС, перемешивали, добавляли раствор ПЭИ, еще раз перемешивали на встряхивателе. Полученные комплексы инкубировали 30 мин при комнатной температуре.

Приготовление полиплексов ПЭГ-ПЭИ-ТАТ проводили в соответствии с [11], приготовление липосом проводили в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя.

Приготовленные комплексы анализировали электрофоретически в 0,8% агарозном геле с 1xTAE. После прокрашивания геля бромистым этидием (0,1 мкг/мл) ДНК визуализировали на трансиллюминаторе при длине волны 365 нм. Данные фиксировали с использованием системы гель-документирования G: BoxF3 («Syngene», Великобритания) с использованием программного обеспечения, прилагаемого к прибору.

За день до эксперимента клетки C26 высевали на 24-/96-луночные планшеты с плотностью 1·10⁵ клеток в 1 мл/ 1,5·10⁴ клеток в 200 мкл ростовой среды на лунку, инкубировали при 37 °C в атмосфере 5% CO₂.

Бессывороточный протокол. Сформированные комплексы, содержащие 670/160 нг ДНК, добавляли к 300/50 мкл Opti-MEM, перемешивали, полученную смесь добавляли к клеткам с предварительно удаленной средой, инкубировали 3 ч при 37 °C в атмосфере 5% CO₂, после чего заменяли среду на 1 мл/200 мкл свежей ростовой среды, и инкубировали 48/24 ч при 37 °C в атмосфере 5% CO₂.

Протокол с сывороткой. Комплексы, содержащие 670 /160 нг ДНК, добавляли к 1 мл/200 мкл свежей ростовой среды, перемешивали, после чего полученную смесь добавляли к клеткам с предварительно удаленной средой, инкубировали 48/24 ч при 37 °C в атмосфере 5% CO₂.

По окончании инкубации клетки в 24-луночном планшете открепляли от поверхности 0,05% раствором трипсина, промывали PBS и суспендировали осадок в 700 мкл PBS. Суспензию анализировали на проточном цитофлюориметре FACScan («Becton Dickinson», США) с использованием программного обеспечения, прилагаемого к прибору, а также программного обеспечения Win MDI 2.8. Вычисляли долю GFP-позитивных клеток, а также параметр MFI, представляющий собой среднее геометрическое из интенсивностей флуоресценции GFP-позитивных клеток в произвольных единицах измерения.

По окончании инкубации из 96-луночных планшетов удаляли среду и в каждую лунку добавляли по 100 мкл свежей ростовой среды и 20 мкл реагента MTS, инкубировали 40 мин при 37 °C в атмосфере 5% CO₂, после чего измеряли оптическую плотность при длине волны 490 нм на планшетном ридере microplate spectrophotometer Benchmark Plus («Bio-Rad»). В качестве фона использовали 100 мкл ростовой среды. Выживаемость клеток оценивали как отношение оптической плотности для трансфицированных клеток к оптической плотности нетрансфицированных, предварительно вычитая значение для фона.

Эксперименты были поставлены минимум в 3 независимых повторах (далее n). Для данных рассчитывали среднее и 95% доверительный интервал и проверяли их на нормальность распределения методом Шапиро—Уилка. Сравнение групп проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа и критерия Стьюдента (одновыборочного или двухвыборочного для связанных или независимых выборок) или их непараметрических аналогов. Для поправки на множественность сравнений применяли метод Холма. Значение p менее 0,05 считали статистически значимым. При расчетах использовали программное обеспечение Microsoft Office Excel 2010, R3.5.2.

Для анализа трансфицируемости клеток мы использовали плазмиду pEFGP-N1, содержащую ген репортерного белка GFP.

Оценку эффективности трансфекции клеток C26 проводили по трем критериям. Во-первых, оценивали долю GFP-позитивных клеток, т. е. клеток, в которые попал репортерный ген, относительно общего количества трансфицируемых клеток (далее GFP+). Во-вторых, определяли среднюю интенсивность флуоресценции в трансфицированных клетках. Данный параметр может отражать силу экспрессии репортерного гена и количество копий плазмиды, попавших в клетку. В-третьих, оценивали выживаемость клеток. Для возможности сравнения эффективности трансфекции разными способами во всех экспериментах к клеткам всегда добавляли равное количество плазмидной ДНК.

В литературе встречаются разные параметры и условия как формирования трансфекционных комплексов, так и трансфекции эукариотических клеток с помощью ПЭИ-полиплексов в зависимости от типа клеток и форм ПЭИ [20]. Для подбора оптимальных условий трансфекции клеток линии С26 мы варьировали следующие параметры:

1) Ионная сила раствора. Известно, что частицы, собранные в разных солевых условиях, различаются по своим трансфицирующим свойствам. Ионная сила раствора влияет на размер образующихся двухкомпонентных частиц, способствуя их повышенной агрегации в высокосолевых растворах [20—22]. Полиплексы готовили в PBS как модели высокосолевого буфера, либо в воде в качестве примера раствора с низкой ионной силой.

2) Протокол трансфекции. Трансфекцию проводили с использованием двух альтернативных протоколов.

Первый состоит в том, что клетки инкубируются непродолжительное время (2—4 ч) с комплексами, добавленными в малом объеме минимальной среды без сыворотки, после чего среда заменяется на ростовую среду с сывороткой. Данный способ обеспечивает повышенную концентрацию ДНК-несущих частиц в среде, что способствует их более эффективному взаимодействию с прикрепленными клетками (далее бессывороточный (БС) протокол).

Согласно второму протоколу полиплекс добавляется в полный объем ростовой среды с сывороткой без последующей замены среды и удаления комплексов. В данном протоколе понижена концентрация трансфекционных частиц, однако, увеличено время инкубации с комплексами (далее протокол с сывороткой (СС)). Сыворотка может оказывать влияние на стабильность и размеры сформированных комплексов в трансфекционной среде [20, 23, 24].

В каждой серии экспериментов методом электрофореза в агарозном геле контролировали образование комплексов по их ретардации в лунке. Пример электрофореграммы приведен на рис. 1.

Для приготовления полиплексов использовали отношение N/P 12:1, как наиболее оптимальное согласно нашим и литературным данным [25—27]. В каждом эксперименте значения, полученные для Липофектамина 2000 при трансфекции по БС протоколу, принимали за 100% (далее ЛФ2000-БС).

ПЭИ-полиплексы проявляли разную трансфекционную активность в зависимости от ионной силы раствора и протокола трансфекции (рис. 2).

Значительная разница для двух протоколов наблюдалась в случае комплексов, приготовленных в воде. При использовании СС-протокола доля GFP±клеток составляла не более 10% относительно ЛФ2000-БС. Напротив, при трансфекции по БС-протоколу доля GFP+ клеток достигала 95%.

Добавление ХС сходно с гиалуроновой кислотой и может препятствовать агрегации частиц в высокосолевых условиях, уменьшать влияние сыворотки [14], а также обеспечивать проникновение комплекса внутрь клетки более эффективным рецептор-опосредованным эндоцитозом [18].

Мы готовили комплексы с соотношениями N/P/-, равными 12:1:4, 12:1:8 и 12:1:12. При приготовлении к ДНК сначала добавляли ХС, а затем ПЭИ (далее такой порядок будет обозначен как ДХП). Согласно литературным данным, такой порядок смешивания является наиболее эффективным для гиалуроновой кислоты [14]. Параллельно готовили комплексы в обратном порядке, т. е. к образованному полиплексу ДНК-ПЭИ добавляли ХС (далее ДПХ).

Эффективность трансфекции оценивали относительно данных для ПЭИ-полиплексов, приготовленных в тех же условиях. Результаты представлены в таблице.

Во всех случаях добавление ХС приводило к увеличению доли GFP±клеток. Изменение доли ХС в трехкомпонентных комплексах не позволило выявить значимых закономерностей для доли GFP±клеток и интенсивности флуоресценции. При увеличении количества ХС наблюдалась тенденция к снижению выживаемости клеток.

Добавление ХС до ПЭИ приводило к увеличению доли GFP+ клеток до 2,7 раза, а интенсивности флуо-ресценции до 1,8 раза при незначительной вариации выживаемости клеток. При этом добавление ХС обеспечивало сравнимые результаты для БС- и СС-протоколов, т. е. для работы с двух- или трехкомпонентными комплексами, формируемыми в PBS, применимы оба протокола. Для трехкомпонентных ком-плексов, сформированных в высокосолевых условиях, характерна зависимость эффективности трансфекции от порядка приготовления комплексов. Комплексы, замешанные в порядке ДХП, обеспечивают долю GFP±клеток минимум в 1,6 раза выше по сравнению с ДПХ для обоих протоколов трансфекции (значение p для двухвыборочного теста для связанных выборок при сравнении ДХП-ДПХ во всех случаях не превышает 0,004, n=4).

Добавление ХС по-разному влияло на свойства полиплексов в зависимости от протокола трансфекции. Как было показано ранее, ПЭИ-полиплексы, сформированные в воде, при использовании СС-протокола обеспечивали самую низкую долю GFP±клеток (до 10% от ЛФ2000-БС), добавление ХС приводило к резкому увеличению доли GFP±клеток и средней интенсивности флуоресценции до 6 и 3 раз соответственно, без существенных изменений в выживаемости клеток. При использовании БС-протокола, напротив, ПЭИ-полиплексы были сопоставимы с Липофектамином 2000 по доле GFP±клеток (95% от ЛФ2000-БС), и добавление ХС не приводило к статистически значимому увеличению этого показателя (максимум в 1,2 раза), при этом происходило уменьшение интенсивности флуоресценции (максимум в 1,4 раза) и увеличение выживаемости (максимум в 1,3 раза), которая, однако, снижалась при увеличении доли Х.С. Порядок приготовления комплексов в воде не влиял на эффективность трансфекции (разница в пределах 10%).

Для двухкомпонентных комплексов при приготовлении их в растворах с разной ионной силой и/или использовании разных протоколов трансфекции наблюдался значительный разброс значений в показателях трансфицируемости клеток, например, для доли GFP±клеток он достигал 10 раз (см. рис. 2). Добавление Х.С. приводило к уменьшению этих различий (до 2,5 раза для доли GFP±клеток) (рис. 3).

В случае ППТ показатели эффективности трансфекции были значимо меньше минимум в 1,3 раза при использовании БС-протокола в сравнении с СС-протоколом, т. е. при работе с клетками линии С26 БС-протокол не применим для ППТ-комплексов. Напротив, для трехкомпонентных комплексов наилучшие показатели эффективности трансфекции были достигнуты для водных комплексов при использовании БС-протокола. Сравнение наиболее эффективных протоколов для ППТ- и трехкомпонентных комплексов выявило, что показатели выживаемости клеток и средней интенсивности флуоресценции для них сопоставимы, а доля GFP±клеток выше у трехкомпонентного комплекса (рис. 4).

Подобранные в данной работе сочетания ДНК, ПЭИ и ХС обеспечивают сравнимые результаты с Липофектамином 2000 и ППТ. При переходе к системам in vivo трехкомпонентные комплексы могут оказаться более перспективными. В частности, они обладают рядом преимуществ по сравнению с ППТ. Во-первых, их приготовление не сопряжено со сложным процессом синтеза блок-сополимера, а может осуществляться уже из готовых охарактеризованных компонентов, количественный состав которых при необходимости оптимизации условий легче варьировать. Во-вторых, ХС является разрешенным к употреблению в медицинских целях препаратом. В-третьих, наличие лиганд-рецепторного взаимодействия между раковыми клетками и носителем делает возможным системное применение трехкомпонентного комплекса. Рассмотренные выше возможности требуют дальнейшей проверки на модельных организмах.

Финансирование работы. Работа выполнена при поддержке гранта КОМФИ № 17−00−00190 «Исследование регуляторных элементов специфической экспрессии генов в опухоль-ассоциированных фибробластах и возможности их использования для инженерии искусственных иммунных коактиваторных взаимодействий».

Соблюдение этических стандартов.

Конфликт интересов: Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.

Сведения об авторах

Буланенкова С.С. — e-mail: sun-lioness@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-5304-4590

Снежков Е.В. — e-mail: cell6370@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0001-8421-9728

Потапов В.К. — e-mail: vk@ibch.ru

Акопов С.Б. — e-mail: sergeyakopov@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-3000-8025

Свердлов Е.Д. — e-mail: edsverd@gmail.com

Автор, ответственный за переписку:

Буланенкова С.С. — e-mail: sun-lioness@mail.ru

Как цитировать:

Буланенкова С.С., Снежков Е.В., Потапов В.К., Акопов С.Б., Свердлов Е.Д. Хондроитинсульфат увеличивает эффективность трансфекции клеток комплексами ДНК-ПЭИ. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019;37(4):178-185. https://doi.org/molgen201937041