Введение

Острые респираторные инфекции занимают значительную долю в структуре заболеваемости во всех странах мира, являясь частой причиной нетрудоспособности, сопряженных с ней существенных экономических потерь, а также смертности [1—3]. В качестве этиологических агентов этих заболеваний зачастую выступают вирусы, что предопределило не только выделение клинической группы болезней — острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ), но и присвоение некоторым из этих инфекций самостоятельных кодов в соответствии с Международной классификацией болезней [4].

К основным возбудителям ОРВИ относятся риновирусы, респираторно-синцитиальный вирус, вирусы гриппа A и B, коронавирусы, вирусы парагриппа, аденовирусы [2, 5—7]. Возможно сочетание различных возбудителей (микст-инфекция), когда у пациента обнаруживается два и более патогенных вирусов одновременно или происходит присоединение бактериальной инфекции [3, 7—9].

Непрямая этиологическая диагностика, заключающаяся в регистрации ответной реакции макроорганизма на внедрение патогена, является одним из важнейших направлений иммунодиагностики ОРВИ [2, 10]. Она позволяет установить факт перенесенного инфекционного заболевания, в том числе при отсутствии клинических проявлений, определить эффективность вакцинопрофилактики. При этом может оцениваться состояние как клеточного, так и гуморального иммунного ответа. Несмотря на значимость клеточного иммунитета при вирусных инфекциях, несомненный интерес представляет исследование состояния гуморального звена, что связано прежде всего с возможностью использования технически простых и быстрых методов лабораторной диагностики, позволяющих своевременно поставить правильный диагноз и, следовательно, начать лечение и принять необходимые противоэпидемические меры.

Как известно, при респираторных вирусных инфекциях специфические антитела обнаруживаются на слизистых оболочках (секреторные Ig) и в кровяном русле [10, 11]. В клинической практике для выявления секреторных иммуноглобулинов чаще всего получают назальные смывы, а для обнаружения циркулирующих в крови антител — сыворотку (плазму) крови.

По целому ряду причин особый интерес представляет исследование закономерностей обнаружения специфических антител, содержащихся в крови. Во-первых, данный вид биологического материала доступен в сравнительно большом количестве, что позволяет не только использовать его в любых реакциях, в том числе требующих сравнительно большого объема пробы, но и при необходимости повторить исследование. Особенно важным является то, что методика получения сыворотки и плазмы крови стандартизована и универсальна. Это обеспечивает получение высококачественного гомогенного материала для лабораторного тестирования. Напротив, назальные смывы, аспираты и мазки представляют собой неоднородный материал, качество которого существенно зависит от процедуры взятия [12, 13]. Получение материала из носа бывает технически весьма затруднительным и вызывает дискомфорт, особенно у детей [13, 14]. При этом объем получаемого образца невелик и может оказаться недостаточным для эффективного использования в анализе, особенно при низком содержании антител.

Кроме того, специфические противовирусные антитела, содержащиеся в крови и обладающие нейтрализующей активностью, могут рассматриваться в качестве терапевтического средства для лечения тяжелобольных пациентов. В частности, переливание антиковидной плазмы в ряде случаев предотвращает прогрессирование дыхательной недостаточности при тяжелом течении инфекции и улучшает прогноз [15, 16]. Это также обусловливает значимость выявления антител в крови, в частности у потенциальных доноров, переболевших эпидемически опасными респираторными вирусными инфекциями.

Для максимально эффективного использования возможностей серологической диагностики, проводимой с целью обнаружения специфических антител при ОРВИ, вызванных тем или иным возбудителем, необходимо располагать достаточными сведениями о сроках появления антител в крови, величине диагностического титра, специфичности, продолжительности циркуляции в детектируемых количествах. Рассмотрению именно этих вопросов и посвящен настоящий обзор литературы.

Риновирусы

Риновирусы человека (human rhinoviruses, RV) относятся к числу наиболее распространенных возбудителей ОРВИ у детей и взрослых [3, 17, 18]. Риновирусы — РНК-содержащие безоболочечные вирусы, принадлежащие к семейству пикорнавирусов (Picornaviridae) [3, 17, 19, 20].

По способности гомологичной сыворотки нейтрализовать вирус в культуре клеток возбудитель подразделяется на многочисленные серотипы [19] — к настоящему времени их известно около 160 [18].

Капсид риновирусов формируется четырьмя белками (Virus protein): VP1, VP2, VP3 и VP4, при этом первые три локализуются на поверхности вирусной частицы и определяют антигенное разнообразие RV [19]. Наиболее поверхностное расположение имеет белок VP1, который содержит несколько эпитопов распознаваемых вируснейтрализующими антителами [19]. Аналогично другим пикорнавирусам, разнообразие серотипов RV связывают с вариабельностью нуклеотидных последовательностей, кодирующих VP1 [19]. Показано, что образование специфических антител происходит преимущественно к N-терминальному фрагменту этого белка [17].

При риновирусной инфекции в сыворотке обнаруживаются специфические нейтрализующие антитела, относящиеся к классам A, M и G [17, 21, 22]. Показано, что статистически значимое повышение уровня специфических антител классов A и G, определяемое в ИФА к нативным вирусным частицам, можно зарегистрировать к 21—35-му дню после заражения. При этом возможно длительное сохранение уровней антител: через 1 год наблюдалось некоторое снижение титра IgA, тогда как уровень IgG оставался неизменным [22]. Сывороточные нейтрализующие антитела, относящиеся к классу G, циркулируют иногда в течение нескольких лет после перенесенного заболевания [21, 22].

Антитела к риновирусам отличаются высокой серотип-специфичностью и обладают незначительной кросс-нейтрализующей активностью в отношении других серотипов или не обладают ей совсем [23—25]. Присутствие же гомотипических нейтрализующих сывороточных антител в высоких титрах уменьшает выраженность специфической симптоматики риновирусной инфекции, что было продемонстрировано при экспериментальном заражении взрослых добровольцев штаммами риновирусов RV-39 и Hanks (RV-Н) [23, 24].

В парных сыворотках у лиц, как имевших антириновирусные антитела до инокуляции вируса, так и не имевших их, отмечается не менее чем четырехкратное увеличение титра специфических иммуноглобулинов [21, 23, 24, 26], что может служить диагностическим критерием риновирусной инфекции. Значимое увеличение титра в 84% случаев отмечалось через 3 нед после инокуляции вируса [26].

Методом ELISA у всех взрослых добровольцев, принимавших участие в экспериментальном заражении штаммом RV-16, как здоровых, так и страдающих бронхиальной астмой, в день заражения определялись сывороточные антитела IgG1, IgA и IgM антитела к VP1. Через 42 дня отмечалось значимое повышение уровня преимущественно группоспецифических антител IgG1 [17], тогда как изменения уровня антителопродукции на 4-й и 7-й день зарегистрировано не было. Это позволило авторам предположить, что для обнаружения повышения уровня антительного ответа на риновирусную инфекцию необходим период 6—8 нед и, возможно, даже более.

Сходная закономерность динамики антителообразования при инфицировании RV описана у детей. В сыворотках 92% дошкольников с подтвержденным ПЦР диагнозом риновирусной инфекции, вызванной RV-A, RV-B и RV-C, методом ELISA обнаруживались специфические IgG1 к рекомбинантным белкам VP-1 указанных групп возбудителя уже при первом визите к врачу в разгаре болезни. Более чем у половины (61%) из них при повторном исследовании спустя 11 нед после перенесенного заболевания отмечалось увеличение их уровня [27].

При риновирусной инфекции также детектируется специфический иммуноглобулин E, обнаружение которого, наряду с антителами других классов, у больных бронхиальной астмой указывает на участие RV в этиологии этого заболевания [11, 17, 20, 25, 28].

Респираторно-синцитиальный вирус

Респираторно-синцитиальный вирус человека (human respiratory syncytial virus, RSV) — один из ведущих этиологических факторов тяжелых инфекций нижних отделов респираторного тракта у детей до 2 лет, у взрослых с сердечно-сосудистой патологией и иммунодефицитами, а также у ослабленных пожилых людей [29].

RSV является представителем семейства парамиксовирусов (Paramyxoviridae) подсемейства пневмовирусов (Pneumoviridae) и представляет собой оболочечный РНК-вирус с отрицательной цепью [30—32]. На основании генетических и антигенных различий возбудитель делится на две основные подгруппы (субтипа) — A и B [31, 32].

Из 11 известных структурных и неструктурных белков RSV на поверхности вириона обнаруживаются три: это гликопротеины F (белок слияния), G (белок прикрепления) и SH (малый гидрофобный белок) [31], при этом первые два служат основными мишенями для нейтрализующих антител с потенциально протективным действием [31, 34]. Антитела образуются как к зрелой, так и незрелой форме гликопротеина F, хотя последняя лишена части эпитопов, обеспечивающих вируснейтрализацию [32]. В крови также обнаруживаются антитела к нуклеокапсидному N белку [29, 30].

Гликопротеин F достаточно консервативен, в то время как гликопротеин G отличается антигенной вариабельностью [31, 32], что обусловливает, соответственно, высокую или незначительную степень кросс-реактивности антител к данному антигену. Показано, что антитела, направленные к центральной консервативной области гликопротеина G, могут реагировать со штаммами RSV подгрупп A и B, защищая организм от инфекции [32].

В сыворотке крови при ОРВИ, вызванной RSV, обнаруживаются специфические иммуноглобулины классов IgG, IgM, IgA и IgE. В ранних работах, посвященных изучению особенностей антителообразования при инфекции, вызванной RSV, сообщалось о том, что циркуляция антител разных классов в ответ на первичную инфекцию как в сыворотке, так и в респираторных выделениях носит временный характер: через 6 месяцев после начала первичной инфекции антитела не обнаруживаются. После повторного инфицирования уровень антител повышается и держится дольше в сравнении с первичным инфицированием [33]. В последние годы использование более чувствительных мультиплексных тестов к комплексу антигенов RSV показало, что концентрация специфических антител достигает плато в возрасте 5-9 лет и остается стабильной на протяжении жизни [29].

Особенно подробно изучается гуморальный иммунный ответ при острой респираторной инфекции, вызванной RSV, у детей разного возраста.

Показано, что у детей до года регистрируются довольно высокие уровни иммуноглобулинов класса G, направленных к гликопротеинам F и G, вероятно, материнского происхождения [35]. Поэтому обнаружение антител этого класса уступает по диагностической значимости детекции IgA, которые не передаются через плаценту. Особенно полезным инструментом диагностики инфекции RSV у младенцев может служить определение увеличения титра RSV-специфических IgA [29, 35].

Наиболее информативным с диагностической точки зрения в возрастной группе старше 1 года считается определение нарастания титра IgG. Антитела данного класса детектировались иммуноферментным методом (EIA) у всех заболевших детей до 2 лет, причем в 92% случаев отмечалось значительное увеличение их титра в течение болезни [36].

Выработка сывороточных IgM у детей старше года начинается через неделю после начала заболевания. Эти антитела сохраняются на детектируемом уровне до трех месяцев. В 77% случаев в этот же период обнаруживаются IgA, увеличение титра которых наблюдалось только у ²/₃ обследованных детей [36].

Во взрослой популяции, в том числе у пожилых людей, специфические сывороточные иммуноглобулина G (IgG) к разным антигенам RSV, стабильно обнаруживаются в сыворотке крови. Их наличие положительно связано с защитой против реинфекции RSV [29].

Образование небольшого количества вирус-специфических IgE во время инфекции расценивается как нормальное явление, так как IgE могут предположительно играть определенную роль в выздоровлении от инфекции. С другой стороны, продукция больших количеств вирусспецифических IgE может оказывать негативное влияние на течение и исход болезни [33].

Метапневмовирус

Метапневмовирус человека (human metapneumovirus, HMPV) — сравнительно недавно открытый респираторный патоген [37, 38]. Он был отнесен к роду Metapneumovirus подсемейства Pneumovirinae семейства Paramyxoviridae [39]. Полногеномный анализ показал, что HMPV существует в виде двух генотипов, A и B. На основании изменчивости последовательностей поверхностных гликопротеинов прикрепления (G) и слияния (F) эти два генотипа делятся на подгруппы A1, A2, B1 и B2. Подгруппа A2 дополнительно подразделяется на A2a и A2b [34, 40, 41].

Геном HMPV представлен одноцепочечной несегментированной отрицательно заряженной РНК, кодирующей 9 белков [42]. Оболочка вируса, аналогично RSV, представителю того же семейства, содержит 3 поверхностных белка: гликопротеины F, G и SH [40]. Нейтрализующую активность сыворотки связывают с антителами к F белку [34, 41]. Выработка антител также происходит к нуклеокапсидному N белку HMPV [39]. Антитела к указанным антигенам могут быть как специфичными в отношении HMPV, так и давать перекрестные реакции с RSV (особенно в отношении F белка) ввиду близкого родства этих вирусов [34, 38, 39, 41].

В первых исследованиях, посвященных новой ОРВИ, было показано, что сывороточные антитела к метапневмовирусу обнаруживаются вне заболевания методом непрямого иммунофлуоресцентного анализа с использованием инфицированных клеточных культур у четверти (25%) детей в возрасте от 6 мес до 1 года, а к 5 годам специфический гуморальный ответ наблюдается уже в 70% случаев. У детей старше 10 лет и взрослых антитела к HMPV выявляются у 100% обследованных [37].

Позже благодаря разработке более специфичных иммунодиагностических тестов были получены данные, демонстрирующие возможность проведения серологической диагностики метапневмовирусной инфекции при остром заболевании. Так, методом ELISA на основе рекомбинантного N белка HMPV групп A и B у детей до 4 лет и взрослых обнаруживались IgG к соответствующему антигену, причем после недавно перенесенного заболевания в парных сыворотках, собранных с 3-недельным интервалом, отмечалось нарастание титра специфических антител в 4 и более раз [39].

Также было показано, что через 28 дней после экспериментального заражения взрослых рекомбинантным штаммом метапневмовируса rHMPV-SHs было зарегистрировано 4-кратное и более увеличение титра сывороточных IgG к F белку с нейтрализующей активностью, а также IgA к тому же антигену. Данный феномен, однако, отмечался лишь у незначительной части обследованных [43].

Строгой зависимости уровня специфических иммуноглобулинов в сыворотке от тяжести болезни не отмечено: средние титры как антител к цельному вирусу в ИФА, так и нейтрализующих антител были примерно одинаковыми у пациентов с легким заболеванием и при более тяжелом течении, требующим госпитализации. Однако у тяжелых больных определялась тенденция к более сильному антительному ответу, о чем свидетельствовали более высокие титры в фазе реконвалесценции у госпитализированных пациентов по сравнению с находившимися на амбулаторном лечении [44].

Хотя в целом данные, отражающие возможности детекции специфических антител при инфицировании HMPV, указывают на ограниченную эффективность существующих методов для серологической диагностики острого заболевания [42], во многих случаях, особенно при асимптоматическом течении, это единственный способ выявить заболевших [44].

Вирусы гриппа A и B

Вирусы гриппа (influenza viruses) относятся к семейству Orthomyxoviridae. Это оболочечные вирусы, содержащие сегментированную одноцепочечную отрицательно заряженную РНК, которая кодирует в числе прочих два поверхностных белка — гемагглютинин (HA) и нейраминидазу (NA) [45, 46]. Эти белки играют ключевую роль в патогенезе инфекции и являются главными специфическими антигенами возбудителя. Они экспрессируются как на наружной поверхности вириона, так и на инфицированных клетках [47].

Заболевание у человека могут вызывать вирусы гриппа типов A, B и C, однако наибольшее значение в инфекционной патологии имеют первые два, обладающие эпидемическим потенциалом [45, 46].

На основании антигенной вариации HA и NA вирус гриппа A подразделяется на субтипы. В настоящее время идентифицировано 16 антигенных вариантов HA и 9 антигенных вариантов NA. Подтип вируса гриппа A определяется комбинацией антигенных вариантов HA и NA (например, H1N1, H5N1, H7N9 и т.п.). В отличие от вирусов гриппа A, вирусы типа B не подразделяются на подтипы [46].

Вспышки и эпидемии гриппа ассоциированы с более или менее существенными изменениями антигенной структуры HA и NA, причем у вируса гриппа B подобные изменения затрагивают только HA [46].

Исследованию гуморального иммунитета при гриппе уделяется большое внимание. Антительный ответ, индуцированный острым заболеванием гриппом, как правило, более широкий и длительный по сравнению с поствакцинальным [47]. При этом образуются антитела к HA и, в меньшей степени, к NA и ряду внутренних белков. При гриппе A, кроме HA и NA, доступными для B-клеток и специфических иммуноглобулинов является ряд антигенов, которые экспрессируются на поверхности зараженных клеток или высвобождаются при их гибели, например, нуклеопротеин (NP), M2 белок ионного канала, полимеразы (PB1, PB2 и PA), неструктурный белок 1 (NS1) и ядерный экспортный белок (NEP) и ряд других. Основными антигенами вируса гриппа B, вызывающими образование специфических антител, также являются HA и NA [47—49].

Иммуноглобулины классов A и M определяются в сыворотках подавляющего большинства заболевших гриппом A людей, причем нередко уже в первые дни после начала клинических проявлений [50, 51]. Впоследствии наблюдается увеличение титра антител всех классов, который достигает наиболее высоких значений в течение месяца [50—52]. Аналогичные закономерности характерны для антительного ответа при гриппе B [47, 52].

Антитела к глобулярному домену HA обладают вируснейтрализующей активностью, и именно они определяются в реакциях торможения (ингибирования) гемагглютинации и нейтрализации после перенесенной инфекции или вакцинации [49]. Постинфекционные антитела детектируются в крови в высоких титрах иногда на протяжении десятилетий, обеспечивая защиту от штаммов вируса, экспрессирующих соответствующий антиген аналогичной структуры [47, 53].

Антитела к нейраминидазе чаще всего определяются в тесте ингибирования фермента или ELISA. Закономерности их выявления в сыворотке крови аналогичны описанным для НА: антинейраминидазные антитела обнаруживаются у лиц всех возрастных групп, при этом у пожилых людей обычно регистрируют более высокие титры [47, 54].

Как при естественной инфекции, так и после иммунизации коммерческими вакцинами, содержащими полный спектр антигенов вируса гриппа, в крови также детектируются антитела другой специфичности, направленные, в частности, к консервативным внутренним мажорным белкам NP и M1, минорным белкам полимеразного комплекса и белку M2 [48, 49].

В отличие от большинства ОРВИ, вакцины к которым находятся на разных стадиях разработки и не внедрены в практику, вакцинопрофилактика гриппа проводится на регулярной основе. В ответ на введение любого вакцинного препарата у человека образуются антитела, спектр специфичности которых в известной степени зависит от типа противогриппозной вакцины [47]. Особенностью поствакцинального гуморального иммунитета является его нестойкость: антитела определяются в сыворотке крови в течение 0,5—1 года после введения любой вакцины [47, 48].

Вирусы парагриппа

Вирусы парагриппа человека (human parainfluenza viruses, PIV), относящиеся к семейству Paramyxoviridaie, имеют оболочку и содержат одноцепочечную отрицательно заряженную РНК, кодирующую шесть основных белков: нуклеокапсидный белок (NP), фосфопротеин (P), матриксный белок (M), гликопротеин слияния (F), гликопротеин гемагглютинин—нейраминидаза (HN) и РНК-полимеразу (L) [55, 56].

По генетической и антигенной структуре вирусы парагриппа подразделяются на четыре типа. Вирусы парагриппа 1, 2 и 3 типов являются наиболее частыми возбудителями ОРВИ у человека [55]. Все PIV имеют общие антигены, поэтому после перенесенной инфекции происходит выработка гетеротипических антител, что зачастую не позволяет дифференцировать анамнестический контакт с вирусом определенного серотипа и перекрестную реактивность со сходными антигенными структурами PIV разных серотипов при остром заболевании [55]. Тем не менее, эти вирусы содержат также достаточное количество уникальных серотип-специфических антигенов, индуцирующих в эксперименте образование нейтрализующих антител, например к гликопротеинам оболочки HN и различным конформациям F-белка [57, 58].

Для детекции антител к вирусам парагриппа предложены разные методы, включая ELISA, радиоиммунный, реакцию связывания комплемента, вируснейтрализации и др. Постановка серологического диагноза принципиально базируется на обнаружении нарастающего титра специфического иммуноглобулина G или при обнаружении иммуноглобулина M [59].

Как и при ОРВИ, вызванных другими возбудителями, на острую инфекцию указывает четырехкратное (иногда более) повышение титра при одновременном тестировании парных проб сыворотки в острой фазе и в фазе выздоровления. Парные сыворотки рекомендуется хранить замороженными и тестировать одномоментно. При этом первая проба сыворотки (острая фаза) должен быть собран как можно раньше от начала клинических проявлений. Второй образец сыворотки (фаза выздоровления) должен быть взят, когда регистрируется пик антителопродукции. Для нейтрализующих антител это происходит между 3 и 5 неделями после заражения [55].

Диагностически значимое увеличение количества сывороточных антител IgG было обнаружено методом иммуноферментного анализа в 70, 69 и 87% случаев заражения парагриппом 1, 2 и 3 типа соответственно. Иммуноглобулины класса M детектировались у 42% пациентов, чаще всего у детей младше двух лет и редко у взрослых [60].

Установлены отличия в интенсивности антительного ответа в случае первичного инфицирования и реинфекции, а также в зависимости от возраста заболевшего. В частности показано, что у взрослых уровни антител к гликопротеинам HN и F PIV3 были в целом ниже, чем у детей. При повторном заражении у детей наблюдалась более интенсивная выработка антител, чем при первичном инфицировании. У младенцев 4—7-месячного возраста, в сыворотках которых обнаруживались материнские антипарагриппозные иммуноглобулины, продукция антител была менее интенсивной по сравнению с серонегативными детьми [61].

Заключение

Проведенный анализ литературы, посвященной особенностям гуморального ответа при различных ОРВИ, показал, что динамика синтеза специфических антител имеет ряд особенностей в зависимости от этиологического агента заболевания, хотя принципиально она соответствует описанной для вирусных инфекций в целом [10, 11].

Необходимо подчеркнуть, что несмотря на значительные успехи, достигнутые в области изучения антительного ответа при ОРВИ, остается немало вопросов, требующих дальнейшего изучения. Так, например, по-прежнему актуален поиск уникальных специфических эпитопов диагностически значимых антигенов респираторных вирусов и повышение чувствительности методов детекции иммуноглобулинов, циркулирующих в крови. Перспективным направлением является описание особых кинетических профилей антител разных классов к комплексу вирусных антигенов с целью получения более точной информации о фазе заболевания и характере его течения. Особую важность приобретает возможность прогнозирования исходов тяжелых ОРВИ на основании результатов анализа процесса антителопродукции.

Дальнейшее глубокое исследование особенностей обнаружения специфических антител при ОРВИ с применением современных технологий и методических приемов позволит усовершенствовать диагностику этих серьезных заболеваний, расширит возможности оценки эффективности вакцинации и уровня коллективного иммунитета, обеспечит повышение качества проводимого эпидемиологического мониторинга.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.