Введение

Наследственные болезни обмена (НБО) — это группа редких генетических заболеваний, которые обусловлены дефектами ферментов, кофакторов или транспортеров метаболических путей, приводящими к нарушению обмена веществ и/или накоплению токсичных промежуточных соединений [1]. На сегодняшний день известно более 1000 нозологий НБО, из которых около 25% проявляются в периоде новорожденности. В глобальной структуре детской смертности от неинфекционных заболеваний значительная доля приходится на НБО, от которых умирают более 3 млн детей в возрасте до 5 лет каждый год [2]. Предполагаемая частота заболеваний данной группы составляет приблизительно 1 на 2550 новорожденных, а доля НБО в структуре моногенных заболеваний достигает 10% [3, 4]. В РФ, по расчетным данным, число вновь выявленных детей с НБО составляет 35—75 тыс. в год [5].

С целью профилактики тяжелых осложнений и своевременного начала лечения НБО повсеместно проводится массовый скрининг новорожденных [6]. В нашей стране применяется метод двукратного биохимического скрининга НБО, в рамках которого проводят тесты для измерения маркерных метаболитов пяти заболеваний: иммунореактивного трипсиногена (ИРТ) (муковисцидоз), фенилаланина (ФА) (фенилкетонурия), 17-ОН-прогестерона (адреногенитальный синдром), галактозы общей (ГАО) (галактоземия), тиреотропного гормона (врожденный гипотиреоз). Указанные биомаркеры являются достаточно специфичными, однако их положительная прогностическая ценность из-за низкой распространенности каждого заболевания в популяции остается относительно низкой [7].

В то же время некоторые состояния, возникающие в раннем неонатальном периоде, могут вызывать колебания концентраций исследуемых аналитов. Например, новорожденные с низким весом при рождении или более ранним сроком гестации чаще имеют ложноположительные результаты для некоторых из скринируемых состояний, поскольку их эндокринная система не полностью развита [8]. При получении положительного результата скрининговых тестов необходимо проведение диагностических исследований, при этом в РФ единые протоколы подтверждающей диагностики в настоящее время не регламентированы.

Учитывая то, что большая часть заболеваний, включенных в программу неонатального скрининга, являются моногенными, наиболее эффективными в качестве подтверждающих могут выступать молекулярно-генетические методы диагностики. Появление метода секвенирования следующего поколения (next-generation sequencing — NGS) существенно увеличило эффективность определения последовательности генома за счет массового параллельного прочтения коротких фрагментов ДНК нескольких десятков образцов одновременно. Кроме того, возможность исследования целевых генов (регионов интереса) с применением таргетных панелей (таргетного секвенирования следующего поколения — tNGS) способствует оптимальному использованию данного подхода в диагностике отдельных генетически детерминированных заболеваний.

Высокий процент ложноположительных результатов, обусловленных ошибками преаналитического этапа исследований, сложность в интерпретации неоднозначных результатов биохимического скрининга, отсутствие стандартизованных протоколов подтверждающей диагностики, а также низкая распространенность отдельных групп НБО в популяции указывают на необходимость повышения эффективности неонатального скрининга путем разработки и оптимизации алгоритмов диагностики.

Цель исследования — разработка и апробация алгоритма неонатального скрининга моногенных наследственных болезней обмена — муковисцидоза, фенилкетонурии и галактоземии с включением технологии tNGS.

Материал и методы

В исследование включены 196 217 детей, родившихся в Санкт-Петербурге в период с 01.01.15 по 01.01.18, которым были сделаны лабораторные тесты в рамках существующего алгоритма неонатального скрининга, проводимого на 4—5-й день жизни у доношенных и на 7—9-й день у недоношенных и предполагающего определение биохимических маркеров по следующей схеме:

1) муковисцидоз: первичное измерение уровня ИРТ (ИРТ1) на 3—20-й дни жизни (cut-off <70 нг/мл), повторное измерение (ретест) ИРТ (ИРТ2) на 21—28-й дни жизни (cut-off <40 нг/мл), независимо от срока гестации при рождении (протокол ИРТ1/ИРТ2);

2) фенилкетонурия: первичное измерение уровня ФА (ФА1), ретест ФА (ФА2) (протокол ФА1/ФА2); cut-off <122 мкмоль/л, независимо от сроков взятия биоматериала;

3) галактоземия: первичное измерение уровня ГАО (ГАО1), ретест ГАО (ГАО2) (протокол ГАО1/ГАО2); cut-off <390 нг/мл, независимо от сроков взятия биоматериала.

Материалом для исследования служили сухие пятна капиллярной крови, взятой в родильном доме из пятки новорожденного, на тест-бланках фильтровальной бумаги.

Биохимические маркеры определяли иммунофлуоресцентным, флуориметрическим или флуоресцентным методами с использованием наборов реагентов «ИРТ-Неоскрин», «Галактоза-Неонатал», «ФКУ-Неоскрин» (ООО «Иммуноскрин», Россия) на спектрофлуориметре Victor 2 (Perkin Elmer, США).

ДНК выделяли при помощи набора PureLink Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen/Life Technologies, США) согласно инструкции производителя. Спектр мутаций в генах CFTR (442 мутации), PAH (99 мутаций), GALT (40 мутаций) определяли методом tNGS с использованием специально разработанной панели VariFindTM Neoscreen assay (Parseq Lab, Россия). Создание библиотек осуществляли с использованием наборов Ion Ampliseq Library Kit, Template OT2 Reaction Kit, Ion PGM Sequencing Kit v2 (Life Technologies, США). Таргетное секвенирование проводили на платформе Ion Torrent PGM (Life Technologies) с использованием чипа Ion 318 Chip Kit v2 (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific), биоинформатический анализ данных — с помощью программного пакета VariFind Software v. 6.0 (Parseq Lab, Россия).

Статистический анализ данных

Для статистического описания мерных данных проверяли их согласие с нормальным распределением и оценивали средние значения, а также медианы с 95%-ми доверительными интервалами (ДИ). Для анализа мерных данных использовали программу PAST, непараметрические алгоритмы построения доверительных интервалов и статистических сравнений на основе процедур бутстрэпа и Монте-Карло. При расчетах диагностической информативности всех протоколов использовались принятые пороги для ИРТ, ФА и ГАО, рекомендованные производителями наборов.

Результаты

С целью повышения специфичности и эффективности неонатального скрининга на муковисцидоз, фенилкетонурию и галактоземию в настоящем исследовании был разработан алгоритм, основанный на комплексном применении традиционных биохимических тестов и tNGS (рис. 1).

Рис. 1. Алгоритм комплексного неонатального скрининга: протокол ИРТ1/ИРТ2/NGS, протокол ФА1/ФА2/NGS, протокол ГАО1/ГАО2/NGS.

Апробация комплексного алгоритма неонатального скрининга проведена на 858 из 196 217 новорожденных, у которых по результатам биохимического тестирования был выявлен повышенный уровень соответствующих маркерных метаболитов: 1) на 264 новорожденных с повышенным значением ИРТ2; 2) на 80 новорожденных с повышенным значением ФА2; 3) на 514 новорожденных с повышенным значением ГАО2. Во всех трех исследуемых группах было проведено tNGS генов CFTR, PAH, GALT, патогенные мутации в которых ассоциированы с развитием клинической манифестации муковисцидоза, фенилкетонурии и галактоземии соответственно (см. рис. 1).

Ниже приведены данные по оценке диагностической информативности разработанного алгоритма неонатального скрининга, включающего tNGS в качестве подтверждающего критерия, в сравнении с действующими протоколами.

Результаты исследований в группе с подозрением на муковисцидоз

Муковисцидоз — наследственное аутосомно-рецессивное заболевание, характеризующееся повышением уровня ИРТ у новорожденных в возрасте до 28 дней. Однако ИРТ может также повышаться у новорожденных при ряде врожденных патологий (таких как конъюгационная желтуха новорожденных, внутриутробные инфекции), что обусловливает наличие ложноположительных результатов при проведении неонатального скрининга на муковисцидоз.

Повышение уровня ИРТ на первом этапе скрининга отмечено у 678 из 196 217 новорожденных, тогда как при повторном обследовании гипертрипсиногенемия (ИРТ2) сохранялась всего у 264 детей. При этом только у 31 из 264 ребенка с повышенным уровнем ИРТ2 имелись клинические проявления заболевания. В то же время одному ребенку с нормальным уровнем ИРТ на первом этапе скрининга (ИРТ1 = 43 нг/мл) согласно клиническим и анамнестическим данным был поставлен диагноз муковисцидоза (табл. 1). В данном случае причиной ложноотрицательного результата явилось наличие мекониального илеуса, который, согласно литературным данным, может обусловливать низкие значения ИРТ в крови новорожденных [7].

Таблица 1. Результаты диагностического протокола ИРТ1/ИРТ2 в зависимости от клинических и анамнестических данных

На основе полученных результатов уровня ИРТ с учетом клинических и анамнестических данных была проведена оценка информативности диагностического протокола ИРТ1/ИРТ2 (табл. 3).

Таблица 3. Сравнительный анализ эффективности протоколов ИРТ1/ИРТ2 и ИРТ1/ИРТ2/NGS

Таким образом, несмотря на высокие показатели чувствительности (Se=94%) и специфичности (Sp=99,9%) протокола ИРТ1/ИРТ2, при проведении неонатального скрининга сохраняется большая вероятность получения ложноположительных результатов (PPV=12%), а также не исключена возможность получения ложноотрицательных результатов теста в случае мекониального илеуса.

Всем 263 новорожденным с повышенным уровнем ИРТ в конце первого месяца жизни, а также одному ребенку с нормальным уровнем ИРТ 1 (43 нг/мл, мекониальный илеус), но с клинической картиной муковисцидоза проведена ДНК-диагностика мутаций в гене CFTR методом tNGS (табл. 2).

Таблица 2. Результаты диагностического протокола ИРТ1/ИРТ2/NGS в зависимости от клинических и анамнестических данных

Патогенные мутации в гене CFTR были выявлены только у 50 из 264 новорожденных: у 32 (12,12%) идентифицированы одновременно две патогенные мутации в гомозиготном или компаунд-гетерозиготном состоянии, что обусловливает клиническое проявление заболевания; у 18 (6,82%) установлено носительство одной патогенной мутации (рис. 2). Всего обнаружено 64 патогенные мутации у новорожденных с установленным диагнозом муковисцидоза. Следует отметить, что у 11 (34,4%) из 32 новорожденных, имевших две патогенные мутации, в генотипе присутствовала хотя бы одна редкая мутация, не входящая в основные российские панели для исследования мутаций в гене CFTR, ассоциированных с муковисцидозом. В то же время в 41 (64,06%) аллеле из 64 в гомозиготном или компаунд-гетерозиготном состоянии обнаружена мутация F508del — наиболее распространенная в европеоидной популяции, в 5 (7,81%) — мутация CFTRdele2,3(21kb), в 4 (6,25%) — 2143delT, остальные 14 (21,88%) аллелей содержали редкие мутации (p.3120+1G>A, p.Q98R, p.1811+1.6kbA>G, p.R1066C, p.K598X, p.W1282X, p.R792X, p.R117H, p.2184insA, p.R334W, p.1259insA, p.2721del11).

Рис. 2. Структура обследованных новорожденных с подозрением на муковисцидоз в зависимости от наличия патогенных мутаций.

Среди 18 носителей одной патогенной мутации в гене CFTR обнаружено всего 3 (16,67%) аллеля, содержащих мутацию F508del и 2 аллеля (11,11%) с мутацией CFTRdele2,3(21kb), в остальных 13 (72,22%) идентифицированы редкие мутации (p.S1196X, p.359insT, p.574delA, p.3821deT, p.S1253R, p.E217G, p.IVS19-24G>A, p.F1052V, p.W1282R), что является доказательством широкого генетического разнообразия популяции.

Неонатальный скрининг на муковисцидоз с использованием двухэтапного определения ИРТ в крови новорожденных был предложен в 1970-х годах [8]. Повышение уровня ИРТ в крови у детей с муковисцидозом связано с повреждением ацинарных клеток поджелудочной железы, что позволяет ферментам проникать в кровоток. При этом по мере прогрессирующего разрушения экзокринной ткани поджелудочной железы уровень ИРТ снижается. На основании указанных фактов скрининг на муковисцидоз состоит из двух этапов: первичное измерение уровня ИРТ в сухих пятнах крови в возрасте 3—20 дней жизни, в случае положительного результата — повторное измерение (ретест) на 21—28-й день жизни.

Такой алгоритм скрининга позволяет исключить ложноотрицательные результаты за счет установления cut-off ≥70 нг/мл (99-й процентиль в общей популяции) при первичном тестировании и минимизировать число ложноположительных результатов путем снижения cut-off до 40 нг/мл (99-й процентиль в общей популяции) с учетом снижения уровня ИРТ на 3—4-й неделе жизни.

Нами проведен анализ сроков забора крови для ретеста на муковисцидоз у 264 новорожденных с повышенным уровнем ИРТ при первичном тестировании. В результате обнаружено, что у 208 (78,78%) из 264 новорожденных забор крови осуществлялся до 21-го дня жизни и только у 56 (21,22%) кровь взята в срок с 21-го по 28-й день жизни включительно (рис. 3). Таким образом, ошибки на преаналитическом этапе также могут способствовать увеличению ложноположительных результатов скрининга.

Рис. 3. Анализ сроков взятия крови для проведения ре-теста ИРТ (ИРТ2) у детей с повышенным уровнем ИРТ при первичном тестировании в рамках неонатального скрининга.

На основе полученных результатов уровня ИРТ с учетом клинических, анамнестических и молекулярно-генетических данных была проведена оценка информативности диагностического протокола ИРТ1/ИРТ2/NGS. Сравнительный анализ эффективности двух протоколов показал статистически достоверные преимущества комплексного алгоритма неонатального скрининга ИРТ1/ИРТ2/NGS (табл. 3).

Таким образом, внедрение данного алгоритма значительно повышает прогностическую ценность положительного результата и специфичность неонатального скрининга, позволяет существенно сократить долю ложноположительных результатов, минимизировать влияние преаналитического этапа, в частности несоблюдения сроков взятия материала для повторного биохимического тестирования, на конечный результат, расширить спектр одновременно выявляемых патогенных мутаций в гене CFTR, снизить финансовую нагрузку на ведение новорожденных с подозрением на муковисцидоз.

Результаты исследований в группе с подозрением на фенилкетонурию

Фенилкетонурия (ФКУ) — группа наследственных заболеваний с аутосомно-рецессивным типом наследования, характеризующихся нарушением обмена незаменимой аминокислоты ФА. В результате метаболического блока превращения ФА в тирозин происходит значительное накопление ФА и его метаболитов в биологических жидкостях больного организма, что оказывает токсическое действие на центральную нервную систему и приводит к развитию тяжелой умственной отсталости. В настоящее время существует специфическая диетотерапия этого заболевания, которая позволяет предотвратить указанные осложнения при условии раннего начала лечения. Наиболее частыми формами (примерно 98% всех случаев заболеваний) являются классическая ФКУ и доброкачественная гиперфенилаланинемия (ГФА), ассоциированные с мутациями в гене фенилаланингидроксилазы (PAH). Мутации, приводящие к полной потере активности фермента, обусловливают развитие классической ФКУ и более тяжелого клинического фенотипа, в то время как для доброкачественной ГФА характерны «мягкие» мутации, следствием которых является сохранение достаточной активности фермента, при этом коррекция метаболического профиля не требуется.

На первом этапе скрининга повышение уровня ФА1 ≥122 мкмоль/л отмечено у 118 из 196 217 новорожденных, тогда как при повторном обследовании уровень ФА2 ≥122 мкмоль/л сохранялся у 80 детей. При этом только у 35 из 80 новорожденных с повышенным уровнем ФА2 имелись клинические проявления заболевания (табл. 4). Причиной ложноположительных результатов чаще всего является парентеральное питание, содержащее различные аминокислоты.

Таблица 4. Итоги неонатального скрининга на фенилкетонурию в Санкт-Петербурге

На основе полученных результатов уровня ФА с учетом клинических и анамнестических данных была проведена оценка информативности диагностического протокола ФА1/ФА2 (табл. 5).

Таблица 5. Сравнительный анализ эффективности протоколов ФА1/ФА2 и ФА1/ФА2/NGS

Значение прогностической ценности положительного результата протокола ФА1/ФА2 составило 44%, то есть при положительном результате теста практически равновероятно, что обследуемый может являться как больным, так и здоровым. Таким образом, проведение подтверждающих тестов по выявлению патогенных мутаций, ассоциированных с развитием ФКУ, является неотъемлемой составляющей в случае положительного ответа.

Всем 80 новорожденным, имевшим повышенный уровень ФА2 (≥122 мкмоль/л), была проведена ДНК-диагностика мутаций в гене PAH методом таргетного секвенирования. Патогенные мутации в гене PAH были выявлены только у 37 из 80 новорожденных: у 32 (40%) обнаружены две патогенные мутации в гомозиготном или компаунд-гетерозиготном состоянии, у 5 (6,25%) — одна. При этом у 21 ребенка обнаружены патогенные аллели, характерные для классической ФКУ (уровень ФА >1200 мкмоль/л), а у 11 (13,75%) выявлены мутации, обусловливающие развитие доброкачественной ГФА (уровень ФА 153—459 мкмоль/л) (рис. 4). В группе обследуемых с диагнозом доброкачественной ГФА из 24 идентифицированных патогенных аллелей 7 были представлены R408W (29,2%), а остальные 17 (70,8%) включали редкие мутации, идентификация которых возможна только при расширенном тестировании гена PAH. Также у одного пациента выявлен ранее не описанный вариант D435V (p.D435V).

Рис. 4. Генотипы обследованных новорожденных с диагнозом доброкачественной гиперфенилаланинемии.

У одного (1,25%) ребенка с уровнем ФА=1310 мкмоль/л и установленным диагнозом классической ФКУ была выявлена только одна патогенная аллель R408W в гетерозиготном состоянии. Позже у данного пациента была выявлена делеция экзона №5 методом MLPA в другой лаборатории. При этом у другого (1,25%) ребенка с высоким уровнем ФА (2326 мкмоль/л) в гене PAH не было выявлено ни одной патогенной мутации, что также может быть связано с наличием крупных геномных перестроек. Следует отметить, что диагноз доброкачественной ГФА по результатам ФА2 был поставлен 2 (2,5%) новорожденным, имеющим одну патогенную мутацию в гетерозиготном состоянии, однако впоследствии диагноз был снят на основании нормализации биохимического профиля ФА и отсутствия клинической симптоматики. Таким образом, при проведении генетического тестирования в группе детей с подозрением на ФКУ получено два ложноотрицательных результата.

На основе полученных результатов уровня ФА с учетом клинических, анамнестических и генетических данных была проведена оценка информативности диагностического протокола ФА1/ФА2/NGS (см. табл. 5).

Сравнительный анализ эффективности действующего и предложенного алгоритмов показал, что метод NGS уступает методу определения ФА по чувствительности (см. табл. 5). Это обусловлено ограничениями метода, а также может быть вызвано наличием мутаций в некодирующих областях гена, исследование которых не проводилось. При этом совместное применение биохимического скрининга и генетического обследования в рамках алгоритма ФА1/ФА2/NGS улучшает информативность лабораторного обследования, позволяет существенно сократить число ложноположительных результатов (PPV=97,14%), а также выявлять мутации различного функционального типа, в том числе и «мягкие» генотипы, обусловливающие развитие доброкачественной ГФА. Преимущества основанного на NGS метода были показаны и для диагностики ФКУ.

Результаты исследований в группе с подозрением на галактоземию

Галактоземия — наследственное нарушение обмена углеводов, при котором в организме накапливается избыток галактозы и ее метаболитов, что обусловливает клиническую картину заболевания и формирование отсроченных осложнений. Галактоземия объединяет несколько генетически гетерогенных форм, наиболее тяжелой из которых является классическая галактоземия, возникающая в результате мутаций в гене GALT и, как следствие, дефицита активности фермента галактозо-1-фосфатуридилтрансферазы (ГАЛТ). Заболевание обычно манифестирует в первые дни — недели жизни, быстро прогрессирует и при отсутствии лечения носит жизнеугрожающий характер. Кроме того, к этому типу галактоземии относится биохимический вариант Дуарте, приводящий к повышению уровня ГАО в крови. Однако при этом варианте остаточная активность фермента ГАЛТ составляет 25—75%, этого достаточно для утилизации галактозы в организме, поэтому развития клинической симптоматики не происходит.

Поскольку классическая галактоземия является тяжелым, смертельным заболеванием, с 2006 г. в РФ проводится биохимический неонатальный скрининг на данное заболевание путем измерения уровня ГАО в сухих пятнах крови новорожденных. В табл. 6 приведены результаты диагностического протокола ГАО1/ГАО2.

Таблица 6. Результаты диагностического протокола ГАО1/ГАО2 в зависимости от клинических и анамнестических данных

На основе полученных результатов уровня ГАО в зависимости от клинических и анамнестических данных была осуществлена оценка информативности диагностического протокола ГАО1/ГАО2 (табл. 7). Ввиду неспецифичности маркера — ГАО, уровень которой может повышаться транзиторно, двукратный биохимический скрининг приводит к получению 99% ложноположительных результатов (PPV=0,6%).

Таблица 7. Сравнительный анализ эффективности протоколов ГАО1/ГАО2 и ГАО1/ГАО2/NGS

ДНК-диагностика мутаций в гене GALT в группе 514 новорожденных с подозрением на галактоземию выявила: у 2 (0,4%) пациентов — генотип с двумя патогенными мутациями (Q188R/Q188R, Q188R/K285N), в 30 (5,8%) случаях — генотип галактоземия/Дуарте (G/D), в 30 (5,8%) случаях — только одну патогенную аллель (G/N), у 35 (6,8%) обследованных — генотип Дуарте (D/D). Самой распространенной мутацией в группе новорожденных с подозрением на галактоземию была Q188R, которая обнаружена в 34 (36,2%) из 94 идентифицированных патогенных аллелей: у обоих пациентов с генотипом G/G, у 13 (43,3%) новорожденных с генотипом G/D и в 19 (63,3%) случаях гетерозиготного носительства патогенного варианта (G/N).

На основе полученных результатов уровня ГАО с учетом клинических, анамнестических и генетических данных была проведена оценка информативности диагностического протокола ГАО1/ГАО2/NGS (см. табл. 7).

При сравнении вычисленных значений показателей информативности диагностических методов видно, что существующий протокол диагностики галактоземии при условии положительного результата имеет низкие диагностические показатели (см. табл. 7). Применение протокола ГАО1/ГАО2/NGS позволяет минимизировать количество ложных результатов теста ГАО2. Влияние гетерозиготного носительства мутантных аллелей гена GALT, а также аллелей, характерных для биохимической формы галактоземии Дуарте, на уровень ГАО в крови у новорожденных подтверждает необходимость проведения ДНК-диагностики для верификации результатов неонатального скрининга. Таким образом, алгоритм ГАО1/ГАО2/NGS по своей информативности превосходит традиционные методы диагностики галактоземии.

Заключение

Включение исследования последовательности генов методом tNGS в алгоритмы неонатального скрининга наряду с биохимическими тестами позволит значительно повысить прогностическую ценность положительного результата и специфичность неонатального скрининга, сократить долю как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов. Анализ всего гена открывает возможности для выявления геновариантов, приводящих как к классическим, так и к атипичным фенотипам наследственных болезней обмена, что позволяет подтвердить диагноз заболевания до его клинической манифестации.

Дополнительно использование таргетных панелей позволяет избежать этических проблем, связанных с обнаружением случайных находок. Отсутствие необходимости повторного взятия крови у новорожденных с повышенными результатами ретеста, а также сокращение сроков постановки диагноза благодаря результатам tNGS являются важными факторами, снижающими психологический стресс родителей.

Таким образом, внедрение метода tNGS, обладающего высокой пропускной способностью, в программы массового обследования новорожденных в РФ, проводимого специализированными молекулярно-генетическими центрами оптимально для подтверждающей диагностики моногенных наследственных болезней обмена после проведенных биохимических тестов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.