Введение
Известно, что техногенные химические факторы негативно влияют на состояние здоровья населения, и, прежде всего, детей. Так, у детей, проживающих в зоне аэрогенного воздействия выбросов промышленных предприятий, отмечаются нарушения функций иммунной системы, как следствие, гораздо чаще регистрируются различные заболевания органов дыхания, а также аллергические состояния [2, 3, 5, 10—12]. Одним из таких проявлений негативных воздействий поллютантов может служить высокий уровень стафилококкового бактерионосительства у детей экологически неблагоприятных регионов, связанный со снижением эффективности иммунитета [1, 6]. Резидентное стафилококковое бактерионосительство можно рассматривать как одно из первых проявлений нарушения антибактериальной защиты, которое формируется на фоне снижения резистентности организма [8, 9, 12—19]. Колонизация носоглотки детей S. aureus в свою очередь может обусловливать их транслокацию в органы и ткани, где эти бактерии вызывают различные гнойно-воспалительные заболевания, от локальных кожных до тяжелых системных инфекций, включая пневмонию, эндокардит, менингит и сепсис [4, 13, 15]. При этом вопрос о негативном воздействии металлополютантов на различные звенья иммунной системы остается недостаточно изученным.
Цель исследования — оценка частоты встречаемости бактерионосительства S.aureus и состояния факторов клеточного, гуморального, а также местного иммунитета у детей, проживающих в условиях воздействия отходов предприятия черной металлургии.
Материал и методы
Проведены изучение частоты встречаемости стафилококкового бактерионосительства и комплексный анализ состояния факторов местного, гуморального и клеточного иммунитета у 79 детей, проживающих в условиях воздействия выбросов предприятия черной металлургии (группа наблюдения). Группу сравнения составили 75 детей, проживающих на территории, свободной от воздействия промышленных вредных веществ. Дети обеих групп были в возрасте от 3 до 7 лет, сопоставимы по полу. Исследования проводили после получения положительного заключения комитета по этике при ФБУН «ФНЦ МПТ УРЗН».
Всем детям выполнены бактериологическое (на носительство S. aureus) и иммунологическое обследования.
Для бактериологического исследования стерильными тампонами параллельно забирали отделяемое из полости носа (ПН) и зева (ПЗ) в 1 мл забуференного физраствора (pH=7,2), материал центрифугировали (150 g) в течение 15 мин. Супернатант засевали на желточно-солевой (ЖСА) и кровяной агары, выделение и идентификацию культур S. aureus проводили в соответствии с рекомендациями Приказа МЗ СССР №535 от 1985 г. Наряду с бактериологическим исследованием в супернатанте определяли показатели местного иммунитета — уровень секреторного иммуноглобулина (sIgA) и лактоферрина (Лф) с использованием коммерческих тест-систем для ИФА производства «Вектор-бест» (Новосибирск). Стандартизацию супернатантов проводили по белку. Уровень белка определяли с помощью коммерческого набора (Human).
Исследование иммунного статуса также включало CD-фенотипирование лейкоцитов и анализ их фагоцитарной активности, определение концентрации общих IgA, IgG. Наряду с этим изучали уровень специфических анти-S. aureus-IgG в сыворотках крови обследованных детей.
CD-фенотипирование лимфоцитов осуществляли с использованием цитофлюориметра FACSCalibur и коммерческих наборов («Becton Dickinson», США) по инструкции производителя — определяли относительное и абсолютное количество клеток: CD3+-, CD3+CD25+-, CD3+CD4+-, CD3+CD8+-, CD19+-, CD16+56+.
Фагоцитарную активность клеток изучали по методу В.Н. Каплина [7]. В качестве объектов фагоцитоза использовали эритроциты барана — исследовали показатели неспецифического фагоцитоза. Уровень общих IgA, IgG и специфических противостафилококковых IgG исследовали в ИФА с использованием коммерческих тест-систем производства «Вектор-бест» (Новосибирск).
Содержание химических элементов (ванадий, марганец, никель) в сыворотке крови определяли методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ISP-MS) в соответствии МУК 4.1.3230—14 «Методика измерений массовых концентраций химических элементов в биосредах (кровь, моча) методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой».
Обработку полученных данных проводили с помощью программ Excel и Statistica 6.1 [9]. Для выборок с нормальным распределением для оценки вероятности (p) различий двух средних значений (M) использовали параметрический критерий Стьюдента. Взаимосвязь между показателями оценивали, рассчитывая относительный риск (RR), с использованием таблиц сопряженности.
Результаты
У 52,2% детей группы наблюдения в целом в полости носа и зева выявили S. aureus, тогда как в группе сравнения эти бактерии обнаружили у 12,9% детей (p=0,0001).
В группе детей, проживающих в зоне воздействия металлополютантов, констатировали уменьшение уровня лактоферрина в секретах слизистых оболочек носа (5293,7±1494,85 нг/г белка) и зева (2110,3±797,55 нг/г белка) в отличие от группы сравнения (5565,9±1128,41 и 2573,6±1257,95 нг/г белка соответственно) (см. рисунок). Различия для показателей концентрации лактоферрина в полости зева статистически значимы (p=0,01).
Уровни лактоферрина и sIgA в секретах слизистых оболочек носа и зева обследуемых детей.
Уровень sIgA в секретах слизистых оболочек носа и зева также был ниже у детей группы наблюдения и составил соответственно 55,2±12,1 и 39,1±8,1 мкг/г белка против 67,7±14,5 и 45,2±10,4 мкг/г белка детей группы сравнения (см. рисунок). Различия показателей по обоим локусам в сравниваемых группах статистически значимы (для секретов полости носа p=0,001, зева p=0,002).
Представленные на рисунке данные свидетельствуют о снижении местной резистентности слизистых оболочек этих биотопов. Следовательно, можно полагать, что высокий уровень бактерионосительства золотистых стафилококков среди детей этой группы обусловлен снижением уровня факторов местного иммунитета в слизистых оболочках полостей носа и зева.
Важно отметить, что на этом фоне в сыворотке крови детей, проживающих в условиях воздействия выбросов предприятия черной металлургии, статистически значимо повышены средние значения концентраций ванадия, марганца и никеля относительно аналогичных показателей детей группы сравнения (табл. 1).
Таблица 1. Уровень низкомолекулярных химических соединений в сыворотке крови обследованных детей, мг/л
| Химические соединения | Значения показателей | p | |
| группы | |||
| наблюдения (n=44), M±s | сравнения (n=75), M±s | ||
| Ванадий | 0,00152±0,0002 | 0,00017±0,0001 | 0,0001 |
| Марганец | 0,02580±0,0036 | 0,01440±0,0027 | 0,0001 |
| Никель | 0,21100±0,0190 | 0,18400±0,0130 | 0,0001 |
Примечание. M — среднее арифметическое значение; s — стандартное отклонение; p — вероятность различий по критерию Стьюдента.
Сравнительный анализ иммунограмм обследованных детей позволил установить, что у детей группы наблюдения общее количество T-лимфоцитов (CD3+), в том числе T-хелперов (CD3+, CD4+-клеток), T-цитотоксических лимфоцитов (CD3+, CD8+), активных T-лимфоцитов (CD3+, CD25+) статистически значимо снижено по абсолютному показателю. Аналогичная тенденция выявлена в отношении B-лимфоцитов (CD19+), причем снижение их уровня отмечено и по относительной, и по абсолютной величинам (табл. 2). Содержание NK-клеток (CD16+, CD56+) в обеих группах было в пределах физиологической нормы, однако у детей в группе наблюдения абсолютное содержание NK-клеток превышало аналогичный показатель в другой группе (p=0,019). Высокие значения относительного уровня апоптотических T-лимфоцитов (CD3+, CD95+) существенно чаще регистрировали у детей группы наблюдения, при этом их среднее количество также достоверно было выше, чем этот показатель в группе сравнения (p=0,001 по средним и p=0,04 по кратностям превышения).
Таблица 2. Результаты сравнительного анализа иммунологических показателей у детей сравниваемых групп
| Показатель | Группы | Межгрупповое различие (p) | ||||||
| наблюдения | сравнения | |||||||
| среднее значение (M±s) | частота регистрации проб с отклонением от физ. нормы, % | среднее значение (M±s) | частота регистрации проб с отклонением от физ. нормы, % | по средним | по кратностям превышения нормы | |||
| выше | ниже | выше | ниже | |||||
| CD16+56+, 109/дм3 | 0,3±0,05 | 5,0 | 0,0 | 0,27±0,04 | 0,0 | 0,0 | 0,486 | 0,32 |
| CD16+56+, % | 10,83±1,6* | 0,0 | 0,0 | 8,38±1,23 | 0,0 | 3,4 | 0,019 | 0,32 |
| CD19+, 109/дм3 | 0,42±0,08* | 15,0 | 0,0 | 0,57±0,06 | 20,7 | 0,0 | 0,003 | 0,41 |
| CD19+, % | 15,13±1,8* | 0,0 | 0,0 | 17,72±1,55 | 0,0 | 0,0 | 0,029 | — |
| CD3+CD25+, 109/дм3 | 0,13±0,01* | 0,0 | 20,0 | 0,16±0,02 | 0,0 | 3,4 | 0,013 | 0,62 |
| CD3+CD25+, % | 4,95±0,43 | 0,0 | 35,0 | 4,93±0,37 | 0,0 | 34,5 | 0,945 | 0,87 |
| CD3+CD4+, 109/дм3 | 1,03±0,1* | 0,0 | 0,0 | 1,28±0,12 | 10,3 | 0,0 | 0,002 | 0,11 |
| CD3+CD4+, % | 37,55±2,18 | 0,0 | 10,0 | 39,28±1,96 | 0,0 | 6,9 | 0,228 | 0,80 |
| CD3+CD8+, 109/дм3 | 0,65±0,08* | 0,0 | 0,0 | 0,8±0,08 | 3,4 | 0,0 | 0,013 | 0,32 |
| CD3+CD8+, % | 23,78±1,82 | 0,0 | 0,0 | 24,31±1,63 | 0,0 | 0,0 | 0,651 | — |
| CD3+CD95+, 109/дм3 | 0,33±0,04 | 0,0 | 75,0 | 0,34±0,04 | 0,0 | 72,4 | 0,792 | 0,87 |
| CD3+CD95+, % | 12,08±1,23 | 0,0 | 85,0 | 10,41±0,85 | 0,0 | 93,1 | 0,025 | 0,03 |
| CD3+, 109/дм3 | 1,82±0,17* | 0,0 | 0,0 | 2,27±0,19 | 31,0 | 0,0 | 0,001 | 0,04 |
| CD3+, % | 67,08±2,17 | 0,0 | 0,0 | 69,66±1,94 | 0,0 | 0,0 | 0,073 | — |
| Абсолютный фагоцитоз, 109/дм3 | 1,8±0,2 | 6,3 | 8,3 | 2,19±0,16 | 17,7 | 4,1 | 0,002 | 0,022 |
| Процент фагоцитоза | 40,6±2,98 | 0,0 | 33,3 | 51,1±2,42 | 16,3 | 6,1 | 0,000 | 0,000 |
| Фагоцитарное число, у.е. | 0,64±0,06 | 2,1 | 81,3 | 0,86±0,06 | 8,8 | 48,3 | 0,000 | 0,000 |
| Фагоцитарный индекс, у.е. | 1,48±0,08 | 2,1 | 47,9 | 1,72±0,08 | 12,9 | 32,7 | 0,000 | 0,007 |
Примечание. * — разница достоверна по отношению к группе сравнения (p<0,05); M — среднее арифметическое значение; s — стандартное отклонение; p — вероятность различий по критерию Стьюдента.
Что касается фагоцитарного звена, то все изученные показатели статистически значимо были снижены у детей группы наблюдения (табл. 2). Таким образом, высокий уровень металлоконтаминантов в сыворотках крови детей негативно отражается на фагоцитарной активности лейкоцитов.
У 83,1% детей группы наблюдения установлено также статистически значимое снижение содержания общего IgA, а у 54,2% — общего IgG. Различия с показателями детей группы сравнения статистически значимы (p<0,05).
Анализ отношения шансов изменения этих факторов гуморального иммунитета при возрастании концентрации контаминантов в крови позволил установить снижение содержания общего IgG в сыворотке крови при увеличении концентрации марганца, ванадия (RR=0,11—0,41 при p<0,05).
Необходимо отметить и отрицательную тенденцию влияния оксидов этих металлов на формирование специфического гуморального иммунитета. Так, титр специфических IgG к антигенам S. aureus в сыворотках детей, проживающих в районе техногенного загрязнения, был ниже, чем у детей группы сравнения, однако разница не была статистически значима (p=0,07).
Обсуждение
Выявленное у большинства (>50%) детей группы наблюдения носительство S. aureus на слизистых оболочках зева и носа объясняется как снижением резистентности этих биотопов, так и уменьшением степени выраженности активности гуморального иммунного ответа на стафилококковое инфицирование. Наряду с этим у этой группы детей обнаружено снижение уровня общих IgA и IgG, а также среднего количества исследованных субпопуляций T-лимфоцитов, B-лимфоцитов и уменьшение активности различных показателей фагоцитоза. Следовательно, негативное влияние металлополютантов отражается на различных механизмах как неспецифических, так и специфических (IgG к антигенам S. aureus) факторов защиты. В большей мере это положение справедливо в отношении неспецифических факторов резистентности и, прежде всего, фагоцитарного звена. На этом фоне в меньшей степени снижается титр специфических IgG к S. aureus. Настоящее исследование построено на основе комплексного подхода к анализу результатов негативного влияния металлополютантов на различные звенья иммунной системы. Наряду с этим объясняются возможные причины высокой частоты встречаемости стафилококкового бактерионосительства у детей, проживающих в зоне влияния существенной техногенной нагрузки. Ранее в работах различных исследователей преимущественно изучалось состояние тех или иных компонентов иммунной системы у детей, проживающих в экологически неблагополучных районах [2, 4, 7]. Выявленные закономерности отрицательного воздействия металлополютантов на различные звенья иммунной защиты организма детей свидетельствуют о более высокой их восприимчивости как к соматическим, так и к инфекционным заболеваниям. В силу чего необходима более широкая и углубленная диспансеризация этого контингента. Можно полагать, что выявление бактерионосительства S. aureus у таких детей будет косвенным показателем нарушения иммунного статуса.
Выводы
1. При бактериологическом обследовании 79 детей, проживающих в условиях воздействия выбросов предприятия черной металлургии, у 52,2% детей в носоглотке обнаружены S. aureus, что в 4 раза чаще, чем у детей из экологически благоприятного района.
2. Выявлено снижение уровня факторов местного иммунитета данных биотопов у детей в зоне неблагоприятного воздействия вредных веществ. Концентрация sIgA и лактоферрина в этой группе детей существенно ниже, чем в группе сравнения.
3. Установлено, что на фоне воздействия металлополютантов (соединения ванадия, марганца, никеля) формируются негативные реакции иммунной системы, которые проявляются в снижении показателей уровня фагоцитарной активности, а также факторов гуморального и клеточного иммунитета.
Конфликт интересов и источники финансирования отсутствуют.
Авторы подтверждают, что статья или ее части ранее не были опубликованы.
The authors declare no conflicts of interest.