Введение

На сегодняшний день выполнение общего анализа крови — это автоматизированный лабораторный процесс, требующий наличия в лаборатории специального оборудования, или гематологического анализатора (ГА). На рынке присутствует широкий перечень ГА, которые варьируют по своим техническим характеристикам, возможностям, способам измерения (импеданс, электропроводность, проточная цитометрия, фотометрия) [1]. В свою очередь сами лаборатории отличаются по возможностям: уровню оснащения, квалификации персонала и пр. Все это в целом создает неоднородность при измерении показателей общего анализа крови и придает этому процессу вариабельность.

ГА являются оборудованием для in vitro диагностики, и согласно европейскому и американскому законодательству на производителя такого оборудования накладывается обязанность по его валидации для объективных доказательств того, что заявленные характеристики оборудования являются действительно таковыми. Тем не менее, помимо валидации, проводимой производителем, авторитетные международные организации по стандартизации лабораторных исследований (International Council for Standardization in Haematology (ICSH), Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) и распространенный лабораторный стандарт ISO 15189 предписывают конечному пользователю после инсталляции ГА провести процесс верификации, т.е. независимо от производителя проверить характеристики оборудования [2—3]. Основная идея верификации в том, что локальные условия выполнения анализа могут иметь определенную специфику, в силу чего характеристики, заявленные производителем, могут не достигаться лабораторией.

Белорусское национальное законодательство не регулирует данные вопросы и не рассматривает процесс верификации конечным пользователем как обязательный. Однако, учитывая специфику работы Центра детской онкологии, гематологии и иммунологии, где основной контингент составляют онкологические и гематологические пациенты с инициальными отклонениями в общем анализе крови и изменениями вследствие прохождения специфического лечения, вопрос уверенности лаборатории в выдаваемых результатах и их клинической надежности, знание технических ограничений метода, т.е. по сути вопрос верификации вновь приобретенного ГА, были для нас принципиальными.

Цель исследования. Оценить аналитические характеристики гематологического анализатора Yumizen H-500 (производитель «Horiba ABX SAS», Франция) до его клинического использования.

Материал и методы

Общее количество исследованных образцов крови пациентов составило 145, количество исследований, выполненных на гематологических анализаторах, — 400. Кровь пациентов забиралась вакуумным способом в пробирки с антикоагулянтом К2ЭДТА с соблюдением всех правил преаналитики.

В исследовании были задействованы ГА: модель Yumizen H-500 («Horiba ABX SAS») и анализатор сравнения — модель XN-3000 («Sysmex», Япония). Были использованы реагенты, рекомендованные производителями анализаторов. Принцип и схема верификации были заимствованы из ранее опубликованных работ [2—5].

Внутрисерийная воспроизводимость (сходимость) была определена путем 10 последовательных измерений одного и того же образца (исследовано 10 образцов с нормальными и патологическими значениями по лейкоцитам, тромбоцитам, эритроцитам и гемоглобину). При исследовании межсерийной воспроизводимости были использованы образцы контрольной крови ABX Difftrol («Horiba ABX SAS») в трех уровнях, которые тестировались в течение 20 дней.

Сравнительная микроскопия для верификации флаггирования выполнялась специалистами с более чем 20-летним стажем работы с использованием микроскопов CX-31 («Olympus», Япония) и включала подсчет лейкоцитарной формулы для 80 образцов.

В эксперименте по линейности для серийных разведений с целью разбавления высококонцентрированной пробы применяли дилюент ABX Diluent («Horiba ABX SAS»).

Статистическая обработка проводилась средствами MS Office Excel и включала измерение среднего значения и стандартного отклонения, коэффициентов вариации, корреляции и детерминации, построение графиков линейной регрессии.

Подсчет диагностической чувствительности (ДЧ), диагностической специфичности (ДС), диагностической эффективности (ДЭ), предсказательной ценности положительного результата (ПЦПР), предсказательной ценности отрицательного результата (ПЦОР) проводили по формулам, приведенным в [2, 6]. Эффект переноса был рассчитан для лейкоцитов, тромбоцитов и концентрации гемоглобина согласно формулам, приведенным C. Briggs и соавт. [2].

Результаты

Были верифицированы основные характеристики анализатора Yumizen H-500 и оценены такие параметры, как сходимость, межсерийная воспроизводимость, линейность, эффект переноса, фон, флаггирование патологических проб.

Табл. 1 иллюстрирует полученные нами данные по сходимости (внутрисерийной воспроизводимости) Yumizen H-500. Отмечено, что спецификацией производителя установлены достаточно мягкие требования к ГА, поэтому дополнительно было проведено сравнение данных с текущими критериями, изложенными рядом авторов-экспертов в гематологии [4]. По результатам сравнения видно, что большинство измеренных параметров верифицировано. Исключение составляют абсолютное количество лейкоцитов и тромбоцитов в области крайне низких концентраций, для которых коэффициенты вариации равняются 19,5 и 28,7% соответственно, что является клинически неприемлемым. В связи с этим для исследования образцов крови с выраженной тромбоцитопенией и/или лейкопенией в лаборатории разработаны отдельные внутренние правила.

Таблица 1. Внутрисерийная воспроизводимость (сходимость) анализатора Yumizen H-500

В табл. 2 перечислены результаты по исследованию межсерийной воспроизводимости для Yumizen H-500. Эксперимент проводился в течение 20 рабочих дней путем измерения трех уровней контрольной крови ABX Difftrol («Horiba ABX SAS»). Нами достигнуты лучшие результаты, чем по спецификации производителя, но при сопоставлении полученных результатов с текущими требованиями [4] ситуация не настолько оптимистичная. Проблемными аналитами, как и в случае с внутрисерийной воспроизводимостью, остаются количество тромбоцитов при измерении низкого уровня контрольного материала и параметры лейкоцитов (абсолютное число), из которых особенно неудовлетворительно выглядит подсчет моноцитов и эозинофилов.

Таблица 2. Межсерийная воспроизводимость для анализатора Yumizen H-500

Поскольку эталонных образцов для исследования правильности у нас не было, правильность проверялась по сравнению результатов, полученных на тестируемом ГА, с результатами ГА, уже находящегося в использовании (анализатор XN-3000, «Sysmex»). Общее количество измерений составило 160, в исследование включали нормальные и патологические образцы. Полученные данные были обработаны с помощью методов линейной регрессии (табл. 3). Наихудшие коэффициенты корреляции (R) и детерминации (R²) по результатам линейной регрессии были получены для абсолютных значений базофилов (R=0,549, R²=0,301) и абсолютных значений «больших незрелых клеток» (R=0,658, R²=0,433). По остальным параметрам коэффициенты корреляции и детерминации были близки к единице, а для абсолютного числа лимфоцитов составили 1,0, что удовлетворяет критерию сопоставимости. В случае подсчета базофилов такая невысокая корреляция методов была ожидаема, поскольку базофилы — крайне редкий элемент лейкоцитарной формулы, в связи с чем их количество действительно подвержено сильной вариации [4—5]. Аналогично редкой встречаемостью можно объяснить и низкую сопоставимость методов при подсчете «больших незрелых клеток» (параметр, аналогичный незрелым гранулоцитам для XN-3000, «Sysmex»), которые в большинстве исследованных проб были <1%.

Таблица 3. Исследования по сопоставимости результатов анализаторов Yumizen H-500 и XN-3000

Для определения линейности нами были выполнены серийные разведения (не менее 5) клинических образцов с высокими значениями лейкоцитов, эритроцитов, гемоглобина и тромбоцитов (концентрации в неразведенном образце 210·10⁹/л, 6,23·10¹²/л, 211 г/л и 1066·10⁹/л соответственно; измерения подтверждены подсчетом форменных элементов в камере). Во всех случаях линейность подтверждена. Типичный график линейной регрессии отображен на рисунке. Следует сказать, что при выполнении данного эксперимента мы были ограничены в диапазоне измерения (производителем заявлен более широкий диапазон измерения), поскольку использовали имеющиеся в наличии клинические образцы с выраженными патологическими значениями в общем анализе крови. Тем не менее нами верифицированы диапазоны линейности, достаточные для большинства клинических образцов.

График и уравнение линейной регрессии для серийных разведений тромбоцитов (диапазон от 0 до 1066·10⁹/л).

В тесной связи с линейностью находится еще один важный параметр для верификации — лимит определения (LoD), или наименьшая концентрация аналита, которую ГА отличает от фона. Для нашей ситуации информированность о данной величине была особенно важна в случае определения тромбоцитов, что вызвано необходимостью переливания тромбомассы пациентам при значениях тромбоцитов 10·10⁹/л и менее. По результатам измерений было зафиксировано пороговое значение 12,1±3,07 ·10⁹/л, при котором коэффициент вариации для тромбоцитов равняется 25%, что лимитирует их определение [4]. Как видно, данная величина LoD делает неприемлемым использование Yumizen H-500 в описанных выше клинических ситуациях. Лимит определения для лейкоцитов составил 0,1±0,01·10⁹/л (коэффициент вариации равняется 15%).

Эффект переноса был рассчитан для следующих параметров анализа крови: количество лейкоцитов, тромбоцитов и концентрация гемоглобина. Из табл. 4 видно, что данный критерий выполняет/превосходит характеристики спецификации производителя, и можно констатировать, что искажение измерения вследствие эффекта переноса практически отсутствует.

Таблица 4. Эффект переноса для анализатора Yumizen H-500

Как известно, современные ГА обладают возможностями сигнализировать о пробах с разнообразными предполагаемыми патологиями, так называемым флаггированием патологии. В нашем случае, учитывая онко-гематологическую направленность, особенно необходимым представлялось флаггирование присутствия в пробах патологических клеток, в связи с чем мы рассчитали ДЧ и ДС для следующих сообщений Yumizen H-500 о патологии: сдвиг влево, большие незрелые клетки, агрегация тромбоцитов или эритробласты. ДЧ и ДС рассчитали методом сравнения с референсным микроскопическим исследованием на выборке из 80 проб, 44 (55%) из которых имели патологию по морфологии. На основании полученных данных также рассчитали показатели ПЦПР, ПЦОР и ДЭ флаггирования. Полученные результаты отображены в табл. 5, из которой следует, что ДС для вышеуказанных флагов достаточно высока, особенно для случаев со сдвигом лейкоцитарной формулы влево (ДС=98,3%). В то же время все исследованные флаги имеют низкую ДЧ. Особенно это выражено в случае флага большие незрелые клетки, где ДЧ равняется всего лишь 46,7%, что оставляет вероятность пропустить патологические клетки в пробах пациентов. Вместе с тем можно констатировать, что ДЭ, определяемая как количество истинных результатов ко всем полученным, для данного типа анализатора является удовлетворительной. Следует отметить, что наше исследование было ограничено количеством проб и показатели точности флаггирования могли бы улучшиться при исследовании бо`льшей выборки.

Таблица 5. Характеристики флаггирования патологических клеток анализатором Yumizen H-500

Таким образом, по результатам процесса верификации нами констатирована пригодность ГА для конкретных целей использования в наших условиях — для исследования проб амбулаторных пациентов, находящихся под динамическим наблюдением после прохождения лечения. Исключение составляют пробы с тромбоцитопенией 10,0·10⁹/л и менее и лейкопенией 0,5·10⁹/л и менее, которые требуют повторения исследования унифицированными методами подсчета форменных элементов в камере с подтверждением результатов исследования микроскопией окрашенного мазка крови. Однако в данной когорте обследуемых пациентов количество таких проб минимально.

Отдельным аспектом, который, на наш взгляд, заслуживает внимания, является метрологический надзор (метрологическая аттестация и поверка), необходимый для данного типа оборудования в соответствии с законодательством Республики Беларусь [7]. На сегодняшний день специалистами метрологической службы проверяются такие показатели, как диапазон измерений лейкоцитов, эритроцитов, гемоглобина, тромбоцитов и предельное значение относительного среднеквадратичного отклонения, что эквивалентно коэффициенту вариации. Все исследования выполняются только на образцах контрольной крови в течение 1 дня. В случае установления пригодности поверяемого оборудования, т.е. при достижении паспортных значений производителя по измеряемым параметрам, пользователю выдается свидетельство о поверке установленного образца с описанием метрологических характеристик.

Как видно из табл. 6, информация, получаемая конечным пользователем по результатам такой поверки, неполная. Не подтверждены все технические характеристики (фон, эффект переноса, правильность и пр.). Полученные значения вариации обобщены для всех уровней концентрации (низкий, средний, высокий), что также неверно, поскольку, как следует из наших собственных данных, вариация в области высоких концентраций значительно ниже, а в области низких концентраций для некоторых параметров критично высока. Поэтому, несмотря на то, что метрологическая поверка отчасти дублирует исследования, необходимые при верификации, она не может полностью заменить верификацию ГА. С другой стороны, при расширении спектра поверяемых характеристик метрологическая поверка ГА независимыми аттестованными лабораториями могла бы рассматриваться как полноценная верификация, проводимая третьей стороной, что допускается глобальным стандартом ISO 15189 и нормативными документами ICSH [2].

Таблица 6. Характеристики Yumizen H-500, полученные в ходе метрологической поверки

Заключение

Полученные нами данные демонстрируют, что анализатор Yumizen H-500 является достаточно надежным инструментом для целей нашей лаборатории и предполагаемой популяции пациентов.

Несмотря на то что процесс верификации ГА является длительным (в нашем случае около 2 мес) и требует отдельных финансовых затрат, он необходим лаборатории для подтверждения надежности получаемых данных. В результате процесса верификации ГА лаборатория получает реальную картину своих технических возможностей относительно исследования показателей общего анализа крови, которая может отличаться от заявленной производителем и требовать определенной коррекции при исследовании некоторых клинических образцов. Метрологическая поверка в ее сегодняшнем состоянии не является полноценной альтернативой процессу верификации и не может его заменить.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.