Введение
Роль уромодулина в развитии уролитиаза широко обсуждается [1, 2]. Ранее нами было показано, что уромодулин в различных условиях может существовать в двух основных олигомерных формах T&HE (7) с ММ 7 MD и T&HE (28) с ММ 28 MD [3] в зависимости от pH и концентрации одновалентных катионов в моче, а наличие в структуре уромодулина гликанов, содержащих сиаловые кислоты, обусловливает отрицательный заряд молекул уромодулина, который и приводит к их взаимному отталкиванию [3—5].
Целью исследования являлась оценка патофизиологической роли степени десиалирования уромодулина, а также влияние уреазопозитивных микроорганизмов в моче на изменение биофизических свойств уромодулина по величине Z-потенциала.
Материал и методы
Исследование проведено путем сравнения биофизических характеристик уромодулина, выделенного из мочи 100 пациентов с уролитиазом, верифицированного в условиях урологического отделения клиники ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, и пула уромодулина, выделенного из мочи 100 человек без уролитиаза: здоровых добровольцев и лиц, наблюдаемых в клинике челюстно-хирургической стоматологи ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова по поводу травм челюстно-лицевой области. Верификация уролитиаза или его отсутствия проводилась на основании комплексного клинико-лабораторно-инструментального обследования, включая микробиологическое исследование мочи каждого пациента и представителя группы сравнения. Для обеспечения однородности исследуемой группы с учетом физико-химических закономерностей кристаллообразования Са-содержащих солей, составляющих подавляющее число у больных уролитиазом (оксалатный уролитиаз), критерием включения являлись характерные для пациента данные рН в «общем анализе мочи» в диапазоне от 5,5 до 6,5 [6]. Среди больных были 45 (45%) мужчин и 55 (55%) женщин. Средний возраст больных составил 46,5±12,8 года, возраст при возникновении заболевания — 39,9±12,4 года, продолжительность заболевания — 6,6±6,9 года.
Для верификации уреазопозитивных микроорганизмов нами разработана технология проведения специфической полимеразной цепной реакции (ПЦР) [7].
Биофизическая оценка уромодулина, выделенного из мочи методом высаливания, включала измерение размеров частиц на спектрометре динамического светорассеяния ПЛСС (ООО «Интокс мед», Россия — РУ № 2014/1650/2014 г.) [3] и оценку поверхностного заряда молекул путем измерения Z-потенциала частиц в растворе, т. е. метод допплеровского электрофореза или электрофореза без поддерживающей среды, реализованного в методе М3-PALS (Phase Analysis Light Scattering) [8], по результатам которого осуществляли верификацию субфракций уромодулина с разной степенью сиалирования.
Результаты
В моче здоровых людей уромодулин представлен олигомерной формой T&HE (7) со средним гидродинамическим радиусом (Rh) 101±3 нм (рис. 1, а). В моче пациентов с выбранной формой уролитиаза наряду с олигомерной формой T&HE (7) присутствует олигомер T&HE (28) с Rh = 412±4 нм, который варьирует у разных больных в объеме от 10 до 30% (рис. 1, б). Оценка отношений концентраций двух вышеназванных олигомеров затруднительна в силу различных форм этих олигомеров: гауссов клубок у формы T&HE (7) и линейный полимер у формы T&HE (28).
Измерение Z-потенциала уромодулина, выделенного из мочи группы сравнения, показало одномодальное распределение уромодулина со средним значением 28,4 mV (рис. 2, а). Вид распределения близок к нормальному, дисперсия около 20 mV. Данная величина близка к величине Z-потенциала нормального уромодулина, полученной в других лабораториях [9]. У исследованной группы больных уролитиазом распределение уромодулина по Z-потенциалу было бимодальным (рис. 2, б) [4], что рассматривается нами как патохимический аспект патофизиологического феномена кристаллогенеза [4].
Методом ПЦР установлено, что при уролитиазе уреазопозитивные микроорганизмы (УПМ) встречались статистически значимо чаще, чем в популяции лиц, не страдающих уролитиазом: Corynebacterium urealyticum в 22%, а в группе контроля лишь в 2% (р<0,001), а Proteus mirabilis в 18%, а в группе контроля в 2% (р<0,001).
Учитывая метаболическую функцию УПМ, проведено модельное исследование динамики содержания различных форм уромодулина (из мочи пациентов с уролитиазом и лиц группы сравнения) в зависимости от концентрации ионов аммония в растворе. Представленные на рис. 3, а данные свидетельствуют о том, что при повышении концентрации аммония наблюдается уменьшение вклада олигомерной формы T&HE (7) в светорассеяние и увеличение вклада олигомерной формы T&HE (28), что существенно ярче проявляется при наличии уролитиаза (рис. 3, б).
Обсуждение
Показано, что уромодулин у пациентов с уролитиазом по величине Z-потенциала делится на две субфракции: первая, практически неотличимая от уромодулина здоровых лиц (около 30 mV), и вторая, с Z-потенциалом 6 mV. Существенное снижение Z-потенциала можно рассматривать как проявление десиалирования уромодулина. Доказано наличие корреляции между соотношением олигомерных форм и распределением Z-потенциала уромодулина, выделенного из мочи больных уролитиазом.
В целом полученные данные подтверждают концепцию роли степени сиалирования уромодулина как фактора устойчивости коллоидных систем [4, 10] в условиях широкого диапазона состава мочи, существенных колебаний величины pH и ионной силы в физиологических условиях для обеспечения гомеостаза организма.
При величине Z-потенциала менее 30 mV коллоидная система начинает терять устойчивость, а при величине менее 10 mV наблюдается массовая агрегация наночастиц в коллоидных системах. Десиализация уромодулина на 40% приводит к изменению pH на 1,5—1,9 единиц [9], что свидетельствует о критическом снижении Z-потенциала уромодулина и развитию кристаллообразования.
Полученные нами данные позволяют предположить, что уромодулин с высоким Z-потенциалом ассоциируется с олигомерной формой T&HE (7). В физиологическом диапазоне изменений значений pH и ионной силы мочи форма T&HE (7) остается доминирующей. Она существует в виде гауссова клубка с отрицательным зарядом на поверхности частицы. Такие частицы легко сорбируются на кристалле, покрывая его бо́льшую часть. При этом на поверхности кристалла создается сплошной отрицательный заряд, препятствующий агрегации кристаллов в конгломерат. Уромодулин с низким Z-потенциалом ассоциируется с олигомерной формой T&HE (28). Эта форма существует в виде линейного полимера диаметром 40 нм и длиной от 600 нм до 1000 нм. Благодаря низкому Z-потенциалу и линейной форме эта форма не сорбируется на кристаллы, а агрегирует в тяжи, которые в свою очередь образуют гиалиновые цилиндры.
Поскольку значительная часть уромодулина у больных уролитиазом десиалирована, образование формы T&HE (28) становится возможным уже в физиологическом диапазоне pH и ионной силы мочи. В этом случае концентрации формы T&HE (7) становится недостаточно для сплошного покрытия поверхности кристалла и на нем остаются области с положительным зарядом. Существование перемежающихся областей с положительным и отрицательным зарядом приводит к агрегации кристаллов и образованию почечных конкрементов. Для смены ингибирующей функции уромодулина на сенсибилизирующую достаточно, чтобы около 40—50% площади кристалла оказалось свободно от формы T&HE (7).
Такая оценка роли биофизических свойств различных постгеномных модификаций уромодулина позволяет объяснить и роль УПМ в развитии уролитиаза. Тот же механизм патологического кристаллообразования, вероятно, имеет место быть при наличии фистул в мочевом пузыре у урологических пациентов. УПМ метаболизируют мочевину в ионы аммония, что вызывает защелачивание мочи, приводя к кристаллизации фосфатов, а также увеличивая ионную силу мочи, инициируют полимеризацию молекул уромодулина в форму T&HE (28), что существенно снижает коллоидную устойчивость.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
*e-mail: mari-svn@yandex.ru