Введение

Молекулярная патология рецессивного дистрофического буллезного эпидермолиза (РБДЭ) связана с биаллельными вариантами мутаций с потерей функции в гене COL7A1. В связи с этим одним из основных подходов генной терапии РДБЭ является разработка методов генной заместительной терапии (ГЗТ) с участием полноразмерной кДНК COL7A1 [1].

Доклинические исследования (ДИ), проведенные на иммунодефицитных животных, показали, что применение трансдуцированных экзогенной полноразмерной кДНК дикого типа кератиноцитов и дермальных фибробластов (ДФ) ex vivo в составе кожных эквивалентов безопасно и эффективно, выявлены продукция C7 (коллаген VII типа), формирование якорных волокон (ЯВ) и дермо-эпидермальных соединений (ДЭС) [2—5]. Достижения в понимании биохимии и молекулярной биологии ДЭС/базальной мембраны и их изменений при РДБЭ обеспечили необходимую основу для клинических исследований (КИ) ГЗТ RDEB [6]. Успешно проведенные КИ способствовали созданию перспективных кожных эквивалентов [7—9], один из которых получил статус ускоренного рассмотрения и статус орфанного препарата от FDA (Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов, США) и EMA (Европейское агентство по лекарственным средствам) и имеет все основания в ближайшее время поступить в клиническую практику [1].

Первым генным продуктом, одобренным регуляторными органами ряда стран и ставшим доступным для лечения РДБЭ, стал разработанный для местного применения (in vivo) с использованием нереплицирующегося вируса простого герпеса 1-го типа (ВПГ-1), несущего копии гена COL7A1, препарат B-VEC [10, 11]. В 2022 г. опубликованы результаты III фазы КИ по применению B-VEC при RDEB (NCT04917874) [10], которые продемонстрировали через 6 мес полное заживление 67% ран, обработанных B-VEC, по сравнению с 22% ран, обработанных плацебо. Данный препарат может использоваться неоднократно.

Таким образом, имеющиеся данные свидетельствуют, что в настоящее время достигнут значительный прогресс в лечении пациентов с РДБЭ, который позволяет использовать методы, исходящие из генетической детерминированности заболевания, и значительно улучшить качество жизни пациентов [12]. Среди предстоящих задач по-прежнему актуальны усовершенствование подходов ex vivo, разработка новых подходов in vivo, особенно в направлении системного их применения, и предотвращение потенциальных иммунных реакций.

Часть III. Перспективы генной терапия РДБЭ. Генная заместительная терапия: генные продукты и векторы их доставки

Генная заместительная терапия представляет собой замещение в клетках кожи мутантного аллеля гена на экзогенный полноразмерный ген дикого типа путем трансдукции последнего. Суть технологии заключается в следующем: из биоптата кожи пациента выделяют кератиноциты и/или ДФ, культивируют, затем полученные клеточные культуры подвергают манипуляциям для получения новой популяции аутологичных генно-модифицированных клеток, содержащих функциональный COL7A1, которые возвращаются пациенту в виде эпидермальных кератиноцитов или кожных эквивалентов (кератиноциты и ДФ) трансплантатов или интрадермальных инъекций (ДФ) [13].

Векторы доставки генных продуктов

В настоящее время в качестве векторов доставки генного продукта в клетки чаще всего используют ретровирусы (RVs, из которых наиболее предпочтителен γRVs), лентивирусы (LVs), и герпесвирусы (HSVs) [14].

RVs — РНК-содержащие вирусы — инфицируют только митотически активные клетки. Главный недостаток их использования — риск развития инсерционного мутагенеза при интеграции этих вирусов в активно транскрибируемые гены, что может приводить к нарушению их физиологической экспрессии [15—17]. Однако имеющиеся данные ДИ и КИ с применением генной терапии ex vivo на основе γRV не показали инсерционного онкогенеза у пациентов с РДЭБ [14]. Кроме того, сейчас используют преимущественно SIN-γRVs (самоинактивирующиеся — γRVs), для которых характерна делеция U3-области 30LTR, что устраняет сильный вирусный энхансер и тем самым снижает склонность γRV активировать гены, обеспечивая их более безопасное применение.

В отличие от RVs, LVs (также РНК-содержащие вирусы) инфицируют и делящиеся, и покоящиеся клетки, благодаря чему эти вирусы могут трансдуцировать более широкий пул клеток [18], при этом LVs и γRVs обладают схожей LTR-энхансерной активностью [19]. Вместе с тем ДИ показали, что практически все LV-трансдуцированные кератиноциты продуцировали усеченный или фрагментированный C7 в большом количестве [14]. Напротив, только 25% RV-трансдуцированных кератиноцитов продуцировали один аберрантный C7 при полноразмерном белке, что, по мнению L. De Rosa и соавт. [14], позволяет, используя γRVs, получать стабильные сертифицированные клеточные линии, которые можно использовать в течение многих лет. В то же время показано, что LV оказался более эффективным и менее токсичным при трансдукции первичных культур ДФ человека [20, 21]. В настоящее время для трансдукции ДФ используют преимущественно этот тип вируса.

ВПГ — это ДНК-вирусы, они обладают высокой способностью к упаковке и трансдукции как делящихся, так и покоящихся клеток, по сравнению с LVs и γRVs имеют более высокий профиль безопасности. Все это делает ВПГ наиболее подходящими для использования в методах генной терапии in vivo [14, 22]. Недостатком является то, что они сохраняют способность оставаться в циркулярной эписомальной форме в ядре, что может приводить к снижению длительности терапевтического эффекта.

Разработка продуктов генной заместительной терапии ex vivo

В разработке инновационных продуктов ГЗТ наиболее актуальны следующие направления: создание трансгенных эпидермальных трансплантатов (ТЭТ), содержащих кератиноциты; разработка трансгенных трансплантатов, содержащих кератиноциты и ДФ; поиск методов стабилизации численности кератиноцитов и ДФ в аутологичных кожных эквивалентах РДБЭ-пациентов; продление сроков эффективного функционирования трансплантатов; создание продуктов ГЗТ для местного использования.

Применение трансгенных эпидермальных трансплантатов, содержащих кератиноциты

В области применения ТЭТ, содержащих кератиноциты, проведены как ДИ, так и первые КИ. Получены обнадеживающие результаты ДИ на иммунодефицитных мышах, которым на кожные раны накладывали трансплантаты, полученные из трансдуцированных кератиноцитов РДБЭ-пациентов, продемонстрировавшие в течение нескольких месяцев после трансплантации продукцию C7, образование ЯВ, а также стабилизацию ДЭС [1, 2, 7, 23]. Исходя из этих данных были проведены пилотные КИ, в ходе которых РДБЭ-пациентам накладывали на раны ТЭТ, содержащие генно-модифицированные аутологичные кератиноциты. Трансплантаты полноценно приживались, отмечено нормальное функционирование клеток, синтезирующих C7, не отличающегося от белка здоровой кожи. Зарегистрировано и образование ЯВ [6, 24, 25].

Z. Siprashvili и соавт. [23] провели I фазу КИ (NCT01263379) продукта, названного позднее EB-101, используя вирусный вектор доставки — γRV, содержащий полноразмерную копию кДНК гена COL7A1 (см. таблицу). Восстановив в аутологичных кератиноцитах РДБЭ-пациентов продукцию полноразмерного C7, исследователи выполнили трансплантацию трансгенных эпидермальных графтов 4 пациентам, каждому из которых было пересажено по 6 ТЭТ. После трансплантации в коже больных выявлены продукция C7 и образование ЯВ, наблюдалось восстановление целостности кожного покрова, не отмечено серьезных побочных эффектов и нежелательных явлений. Зарегистрировано линейное увеличение уровня C7 в 90% биоптатов через 3 мес и в 42% через 12 мес, образование ЯВ наблюдалось в 71% биоптатов через 3 мес и в 25% биоптатов через 12 мес, заживление ран на 75% и более по сравнению с исходным уровнем наблюдалось в 87% случаев через 3 мес и в 50% случаев через 12 мес. По мнению исследователей, отмеченное снижение, вероятно, связано с низким количеством эпидермальных стволовых клеток (ЭСК), которые можно выделить из биоптатов кожи РБДЭ-пациентов, а также с возрастным снижением пролиферативного потенциала кератиноцитов в культуре [23].

Клинические исследования по использованию трансгенных трансплантатов в лечении РДБЭ

Далее в КИ (I/IIa фазы, NCT01263379) S. Eichstadt и соавт. [25] трансплантировали аутологичные ТЭТ на хронические раны 7 РДБЭ пациентов (см. таблицу). Через 6 мес после трансплантации 95% обработанных ран продемонстрировали увеличение заживления более чем на 50%, через 3 года — 71% ран.

В последующем КИ EB-101 (NCT01263379), проведенном J. So и соавт. [7], наблюдали тех же 7 пациентов с целью получения долгосрочных данных (в среднем 5,9 года) по эффективности и безопасности (см. таблицу). Результаты исследования показали, что на пятом году наблюдений в 70% случаев наблюдалось заживление обработанных ран не менее чем на 50% по сравнению с исходным уровнем. Серьезных побочных эффектов или нежелательных явлений не зарегистрировано.

К настоящему времени завершена III фаза открытых КИ EB-101 для лечения РДБЭ-ран (NCT04227106, Abeona Therapeutics Inc.) (см. таблицу) [1] (результаты исследования пока не опубликованы). FDA предоставило EB-101 статус «ускоренный режим», «передовая терапия регенеративной медицины» и «редкие педиатрические заболевания», и FDA и EMA — орфанный препарат).

Наряду с полученными положительными результатами и отсутствием серьезных побочных эффектов отмечено, что со временем клинический эффект от применения ТЭТ снижается. Это может происходить по нескольким причинам, одна из которых недостаточное количество ЭСК в первичных клеточных культурах, полученных от РДБЭ-пациентов [3, 26]. Другой причиной может быть существенная вариабельность в продукции de novo ЯВ, обеспечивающих прочность соединения эпидермиса с дермой.

Разработка трансгенных трансплантатов, содержащих кератиноциты и ДФ

Ряд исследователей в своей работе исходили из того, что в формировании структурно полноценных ЯВ участвуют оба типа клеток кожи, ассоциированных с продукцией C7: и кератиноциты, и ДФ [20, 21]. Так, ряд ДИ показал, что при пересадке иммунодефицитным мышам кожных эквивалентов генно-модифицированными по COL7A1 кератиноцитами и ДФ наблюдается выраженная и долговременная de novo C7-продукция [12, 20, 22]. Результаты исследований in vitro и на иммунодефицитных мышах, проведенные с использованием эквивалентов кожи, содержащих кератиноциты и ДФ от РДБЭ-пациентов и от здоровых добровольцев, подтвердили, что для образования оптимально функционирующих ЯВ необходима экспрессия гена COL7A1 обоими типами клеток, участвующими в организации ДЭС [27, 28].

Эти данные подтверждаются и результатами КИ S. Boyce и соавт. [29], которые применили для лечения 40 ожоговых больных культивированные кожные заменители, состоящие из аутологичных кератиноцитов и ДФ на коллагеновых губках. Установлено, что культивированные кожные заменители обеспечивают стабильное заживление ран у пациентов с ожогами с минимальной потребностью в пересадке и незначительным рубцеванием. По мнению исследователей, такой двуслойный трансплантат, содержащий аутологичные кератиноциты и ДФ, способствует осуществлению паракринных взаимодействий этих клеток. В результате образуются полноценные C7 и ЯВ, обеспечивающие заживление ран [29, 30].

Важность паракринных взаимодействий кератиноцитов и ДФ для оптимального морфогенеза кожи продемонстрирована и в работах A. Wojtowicz и соавт. [28] и A. Ghalbzouri и соавт. [31]. Исследователи показали, что двуслойные аутологичные графты, содержащие кератиноциты и ДФ, являются оптимальными трансплантатами для лечения кожных ран у РДБЭ-пациентов.

M. Titeux и соавт. [4] в своей работе использовали генетически корректированные кератиноциты и ДФ от РДБЭ-пациентов для создания кожных эквивалентов, которые затем трансплантировали иммунодефицитным мышам. Исследователи использовали разработанные ими новые минимальные SIN-γRV-векторы, в которых кДНК COL7A1 находится под контролем промоторов человеческого фактора элонгации 1альфа (EF-1alpha) или COL7A1-промоторов. Результаты исследования продемонстрировали долговременную продукцию рекомбинантного C7, образование ЯВ и дермо-эпидермальную адгезию, что подтверждает функциональную состоятельность данных эквивалентов.

С учетом обнадеживающих результатов ДИ в настоящее время начат финансируемый Европейской комиссией проект по разработке безопасной и эффективной генной терапии РДБЭ, получивший название The GENEGRAFT project (www.genegraft.eu) (см. таблицу) [8, 9]. В рамках проекта проводятся I/II фазы КИ по изучению возможности применения биоинженерного двуслойного графта для трансплантации РДБЭ-пациентам (EBGraft, NCT01874769). EBGraft представлят собой кожный эквивалент, основанный на генетически модифицированных клетках ex vivo посредством SIN-γRV вектора, кодирующего полноразмерный COL7A1 в аутологичных кератиноцитах и ДФ РДБЭ-пациентов (n=30).

Проблема стабилизации численности кератиноцитов в аутологичных трансплантатах РДБЭ-пациентов: возможные пути решения

Исследователи считают, что для поддержания стабильной численности кератиноцитов в аутологичных кожных эквивалентах РДБЭ-пациентов прежде всего необходимо добиться увеличения количества ЭСК в первичных культурах этих клеток кожи [3, 26]. С этой целью в ряде работ использованы индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), которые можно получать из соматических клеток кожи (кератиноцитов или ДФ) РДБЭ-пациентов, перепрограммируя их в эмбриональное состояние, применяя комбинацию транскрипционных факторов [32—34].

Важным преимуществом ИПСК являются их неограниченный пролиферативный потенциал и плюрипотентность, которая позволяет им дифференцироваться в различные клеточные линии. Последние могут быть использованы для генетической модификации и последующего клинического применения [35—37].

Интересно отметить, что в ряде исследований для получения ИПСК использовали ревертантные кератиноциты РДБЭ-пациентов (феномен ревертантного мозаицизма, проявляющийся участками нормальной кожи и наблюдаемый у некоторых пациентов с РДЭБ вследствие спонтанной коррекции наследственной мутации второй мутацией в соматических клетках) [38]. Показано, что ревертантные кератиноциты способны преобразовываться в ИПСК с последующей дифференцировкой в натуральные генно-корректированные кератиноциты [39]. A. Gostynski и соавт. на животной модели показали, что полученные таким способом кератиноциты можно эффективно использовать для получения ex vivo аутологичных эпидермальных графтов [39].

J. Jackow и соавт. [34] получили ИПСК из ДФ РДБЭ-пациентов путем электропорации 4 специфических факторов, кодирующих факторы транскрипции (OCT4, SOX2, KLF4 и C-MYC). Выполнив в этих клетках коррекцию COL7A1, исследователи дифференцировали их в ЭСК и ДФ, на основе которых создали двуслойные кожные эквиваленты и затем трансплантировали их иммунодефицитным мышам.

Результаты этого исследования показали, что трансплантация генно-модифицированных графтов на основе генно-корректированных кератиноцитов и ДФ, полученных из ИПСК, способствует увеличению продукции C7, образованию ЯВ и дермально-эпидермальной адгезии на ксенографтной модели. Исследователи подтвердили целесообразность использования генно-терапевтических продуктов на основе ИПСК-технологии для лечения РБДЭ-пациентов.

Продукты, основанные на ИПСК, в настоящее время находятся на стадии ДИ, однако полученные результаты уже дают основание заключить, что применение двуслойных трансплантатов на основе кератиноцитов K и ДФ, полученных из ИПСК РБДЭ-пациентов, позволит получить клинически эффективные кожные эквиваленты с длительным сроком функционирования.

Следует отметить, что, хотя в ДИ и КИ стратегии замещения генов ex vivo рассматриваются как наиболее продвинутые, этот подход имеет определенные недостатки, в частности инвазивность при проведении биопсии кожи (от одной до нескольких) для выделения ЭСК, проведение травматичных манипуляций для подготовки раневого ложа, являющегося важным условием для успешного приживления трансплантата [6, 14]. Есть также риск развития инфекций кожных ран и инсерционного мутагенеза, при котором генный продукт (трансген) может встраиваться в геном клетки и нарушать экспрессию генов, что может приводить к развитию канцерогенеза [40]. Кроме того, присутствует риск сверхэкспрессии трансгена [41], сопровождающейся выключением встроенного гена [42], а также риск развития аутоиммунного буллезного эпидермолиза у пациентов без остаточной продукции C7 [43].

Актуальные продукты генной заместительной терапии in vivo

Одной из самых успешных разработок ГЗТ in vivo считают Beremagene geperpavec (B-VEC), генный продукт для местного применения, действие которого направлено на восстановление синтеза C7 обоими типами продуцирующими этот белок клетками кожи пациента [10, 11]. Особенность этого генного продукта заключается в том, что он представляет собой биоинженерный нереплицирующийся COL7A1, содержащий ВПГ-1 вектор (эписомальный, неинтегрирующийся, лишенный риска инсерционного онкогенеза).

B-VEC используется в виде геля, что не требует госпитализации пациента, анестезии и инвазивных хирургических вмешательств [11]. Функциональный COL7A1 доставляется напрямую в клетки кожи, попадает в их ядро, после чего происходит генерация транскриптов COL7A1, что позволяет клеткам производить и секретировать функциональный C7, образующий ЯВ. Поскольку используемый ВПГ-1 не способен к репликации и встраиванию в геном клетки, возможно многократное его применение. I. Gurevich и соавт. [11] провели рандомизированное плацебо-контролируемое КИ (I/II фазы, NCT03536143), показавшее, что после лечения B-VEC у пациентов наблюдают увеличение продукции C7, образование ЯВ, уменьшение размеров кожных ран. S. Guide и соавт. [10] провели двойное слепое рандомизированное плацебо-контролируемое КИ (III фаза, NCT04917874). Результаты исследования показали, что через 6 мес после применения B-VEC полное заживление ран наблюдалось у 67% пациентов, в то время как как в группе плацебо — у 22%. В 2023 г. B-VEC получил лицензию FDA на клиническое применение в США [1].

Таким образом, B-VEC представляет собой первый генный продукт для лечения РДБЭ (и ДДБЭ) пациентов, уже доступный для пациентов с этими заболеваниями.

Следует отметить, что при использовании B-VEC, так же как и других генных продуктов, у пациентов с нулевой продукцией C7 высок риск развития неблагоприятных иммунных реакций против синтезируемого функционального белка, поэтому эту терапию могут принимать только пациенты с остаточной продукцией C7 и отсутствием антител к белковому продукту терапии [44].

Можно заключить, что благодаря значительным достижениям в генных технологиях, пониманию молекулярных механизмов РДБЭ и оптимизации протоколов получения/ведения клеточных культур, достигнуты большие успехи в ГЗТ (и ex vivo, и in vivo) этого тяжелого заболевания. Так, среди всех генных технологий ex vivo стратегии ГЗТ продвинулись дальше всех в КИ. С учетом способности RVs-векторов интегрироваться в геном клетки (что может приводить к устойчивой и не поддающейся контролю экспрессии трансгенов) Разработаны новые, более безопасные в применении вирусные векторы, такие как SIN γRVs и LVs. Помимо этого, выяснено, что для оптимального формирования структурно нормальных ЯВ необходимо, чтобы в производстве C7 участвовали и кератиноциты, и ДФ, поскольку в процессе формирования ЯВ важную роль играют внеклеточный матрикс и паракринный эффект [27]. В связи с этим в настоящее время особое внимание уделяется развитию проекта GENEGRAFT, продукт которого представляет собой двуслойный кожный эквивалент EBGraft (NCT04186650), основанный на применении аутологичных кератиноцитов и ДФ кожи пациента, трансдуцированных ex vivo полноразмерной кДНК COL7A1 с использованием SIN γRVs-вектора [8, 9].

Однако ГЗТ имеет и ряд недостатков, в частности, для подхода ex vivo характерны инвазивность (требуется проведение неоднократных биопсий кожи для успешного выделения ЭСК), серьезная санация раневого ложа для успешного приживления трансплантата, системная анестезия. По этой причине большое внимание уделяется стратегиям, которые позволили бы избежать перечисленных недостатков. В качестве одного из вариантов рассматривается ГЗТ in vivo, и в этом направлении достигнут существенный успех. Ученым удалось разработать и внедрить в клиническую практику уникальный генный продукт B-VEC на основе COL7A1, содержащего ВПГ-1, который доставляет COL7A1 напрямую в оба типа продуцирующих С7 клеток кожи. Поскольку используемый ВПГ-1 не способен к репликации и встраиванию в геном клетки, то возможно многократное использование B-VEC начиная с раннего детства. Локальное нанесение препарата на раны и пузыри в виде геля, естественно, исключает недостатки, характерные для стратегии ех vivo [14, 23].

С учетом системного характера RDEB наряду с разработкой топических продуктов in vivo большое внимание также уделяется разработке in vivo стратегий ГЗТ для системного применения.

Следует также сделать акцент на проблеме, которая остается актуальной для всех стратегий генной инженерии: высокий риск развития аутоиммунного буллезного эпидермолиза у пациентов с нулевой продукцией C7 вследствие образующихся нейтрализующих антител к данному белку [44]. Результаты исследований генной терапии РДБЭ показали, что наличие даже низких уровней антител к C7 у пациентов с RDEB обязывает с осторожностью рассматривать таких пациентов в качестве кандидатов на заместительную терапию C7. В связи с этим большое внимание уделяется разработке подходов, которые исключили бы риск развития аутоиммунных реакций у РДБЭ-пациентов при применении генной терапии.

Таким образом, основными задачами в области ГЗТ РДБЭ по-прежнему являются совершенствование технологий ex vivo, дальнейшая разработка стратегий in vivo, как топических, так и системных, и подходов, предотвращающих развитие иммунных реакций.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.