Введение
Эпителиальные опухоли кожи представляют собой наиболее распространенную группу новообразований наружной локализации, из них базально-клеточный рак (БКР) и плоскоклеточный рак (ПКР) занимают лидирующие места в структуре общей онкологической заболеваемости населения РФ [1]. Согласно данным литературы [2], БКР и ПКР развиваются из очагов актинического кератоза (АК) в 36 и 65% случаев соответственно. Генетические альтерации в данных типах эпителиальных опухолей кожи изучены, однако вовлеченность генов эпигенетических регуляторов остается спорной.
Эпигенетические механизмы включают в себя метилирование/деметилирование ДНК, модификации гистоновых белков, ремоделирование хроматина, взаимодействие некодирующих РНК с хроматином и участвуют в регуляции экспрессии генов в течение жизни клетки [3]. Дерегуляция эпигенетических механизмов коррелирует с канцерогенезом, рецидивом и метастазированием опухоли, а также является маркером ответа на терапию. Профилирование соматических мутаций генов эпигенетической регуляции выявляет причины эпигенетической дерегуляции при эпителиальных опухолях кожи [4].
Материал и методы
В исследование включен биопсийный материал 57 опухолей, полученный при хирургической эксцизии в Пермском краевом онкологическом диспансере за 2018–2019 гг. (табл. 1): АК — 20 пациентов, БКР — 19 и ПКР — 18 больных. Всего в исследование вошли 26 мужчин и 31 женщин. Средний возраст мужчин составил 69±7,7 года, женщин — 64±13,5 года. Из внешних источников в исследование включено 95 образцов спорадического БКР (пациенты с синдромом Горлина—Гольца исключены), 144 образцов ПКР, 37 образцов АК, 75 образцов меланомы (de novo) и 361 образец метастатической меланомы. Совокупная внешняя выборка составила 712 образцов опухолей (см. табл. 1).
Таблица 1. Распределение пациентов по возрасту и полу из внутренних и внешних источников
| Нозология | Число пациентов в группе | Мужчины | Женщины | Медиана возраста мужчин, годы | Медиана возраста женщин, годы |
| Внутренняя выборка | |||||
| АК | 20 | 5 | 15 | 68±7,4 | 64±13,2 |
| БКР кожи | 19 | 6 | 13 | 67,5±9 | 70±11 |
| ПКР кожи | 18 | 15 | 3 | 70±7,5 | 60±21 |
| Всего | 57 | 26 | 31 | 69±7,7 | 64±13,5 |
| Внешняя выборка | |||||
| АК | 37 | 27 | 10 | 70±10,9 | 70±10,1 |
| БКР кожи | 95 | Неизвестно | Неизвестно | 73±13,9 | 73±13,9 |
| ПКР кожи | 144 | 109 | 35 | 67±16,9 | 69±21,9 |
| Первичная меланома | 75 | 44 | 31 | 63±14,8 | 65±13,9 |
| Метастатическая меланома | 361 | 222 | 131 | 56±15,6 | 57±16,3 |
ДНК из свежей опухолевой ткани АК, БКР и ПКР выделяли с помощью набора GeneRead DNA FFPE kit (Qiagen, кат. №180134). Высокопроизводительное параллельное секвенирование ДНК проводили на системе Ion S5 System («Thermo Fisher Scientific», США) с использованием 3 панелей: одной коммерческой панели Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 («Thermo Fisher Scientific», США, кат. №4475346) и 2 пользовательских панелей, включающих все кодирующие области, прилегающие области интронов и 5’-, 3’-нетранслируемые области 5 генов — PIK3CA, CDKN2A, CDH1, TP53, PTEN. Кроме того, в исследование включены 25 генов, участвующих в ремоделировании хроматина: DNMT1, MBD1, TET1, DNMT3A, DNMT3B, EZH2, KDM6A, EP300, JARID1B, CREBBP, HDAC2, SIRT1, SMARCB1, SMARCA2, SMARCA4, ARID1A, ARID2, BRD7, PBRM1, CHD5, CHD7, CHD4, KMT2A, KMT2D и KMT2C.
Фильтрацию патогенных мутаций в исследуемой выборке проводили по следующим параметрам: из анализа исключали однонуклеотидные замены, имеющие статус доброкачественных (Benign), вероятно доброкачественных (Likely benign) или доброкачественных/вероятно доброкачественных (Benign/Likely_benign), по данным ClinVar [5], а также однонуклеотидные замены, имеющие статус неясного значения (Uncertain significance), противоречивую интерпретацию патогенности (Conflicting interpretations of pathogenicity), отсутствие статистических данных (not provided) или другое (other), в том числе не соответствующие критериям патогенности по обоим из предикторов MetaSVM [6] и MetaLR [7]. При этом представленность альтернативного аллеля (VAF) должна быть более чем 3,0%, а встречаемость по базе данных gnomAD ниже, чем 0,01%. Все отфильтрованные однонуклеотидные замены и инделы просматривали вручную с помощью программы Integrative Genomics Viewer (IGV) [8]. Вариации числа копий (CNV) анализировали с помощью пакета CNVpanelizer R (версия 1.22.0) со стандартными параметрами. Биоинформатический анализ данных биопсийного материала выполнен с использованием программного обеспечения Torrent Suite software (version 5.10.1). Аннотирование генетических вариантов проводили с помощью программы ANNOVAR [9].
Для формирования группы сравнения использована информация из онлайн-базы данных cbioportal [10, 11]. В анализ включены выборки из БКР [12], ПКР [13–15], образцов первичной опухоли меланомы и метастазов меланомы [10, 11]. Для АК группа сравнения была взята из исследования The genomic landscape of actinic keratosis [16].
Фильтрацию патогенных однонуклеотидных замен и инделов проводили аналогично исследуемой внутренней выборке. Статистический анализ полученных данных выполнен с использованием программы R-studio. Для оценки достоверности при сравнении частотных показателей использовали точный критерий Фишера.
Результаты
Во внутренней выборке выявлено 132 однонуклеотидных замен и инделов, соответствующих критериям патогенности. Кроме того, с помощью пакета CNVpanelizer выявлено 48 делеций и 17 амплификаций. Суммарно выявлено 197 мутаций (табл. 2). С учетом целенаправленного анализа генов, участвующих в эпигенетической регуляции, в исследуемой нами внутренней когорте наиболее часто в опухолевом материале БКР встречались альтерации в генах KMT2D (47,0%), EZH2 (42,0%), TP53 (37,0%) и HDAC2 (32,0%). Причем альтерации в генах EZH2 и HDAC2 являлись исключительно делециями (см. рисунок). Пять из 7 образцов, в которых наблюдались мутации в гене TP53, имели «двойной удар», что соответствует двухударной модели канцерогенеза. Выявленная повышенная частота мутаций в генах KMT2D (9/19) и делеции гена HDAC2 (6/19) в образцах БКР ранее не наблюдалась в исследованиях. В 61,0% случаев ПКР встречались мутации в гене CDKN2A, в 56,0% образцах — мутации в гене TP53 (из которых только в 4 случаях фиксировалась двухударная модель канцерогенеза), в 44,0 и 28,0% образцах — в генах EZH2 и PBRM1 (см. рисунок). Интересным наблюдением является то, что мутации в EZH2 в данной группе опухолей являются исключительно делециями, так же как и в материале опухоли БКР (см. рисунок). В 40,0% случаев АК наблюдались несинонимичные мутации в генах PIK3CA и TP53, носящие патогенный статус, по данным ClinVar.
Таблица 2. Мутационный профиль эпителиальных опухолей кожи
| Нозология | Нонсенс мутации | Инделы | Сайт сплайсинга | Миссенс- мутации | Синонимичные | Делеция | Амплификация | Всего |
| АК | 8 | 3 | 1 | 41 | 3 | 0 | 0 | 56 |
| БКР кожи | 14 | 4 | 3 | 22 | 1 | 18 | 4 | 66 |
| ПКР кожи | 3 | 6 | 2 | 20 | 1 | 30 | 13 | 75 |
| Итого | 25 | 13 | 6 | 83 | 5 | 48 | 17 | 197 |
Мутационный профиль внутренней выборки кожных опухолей.
Во всех изученных образцах внутренней выборки замечена вовлеченность генов, чьи продукты принимают участие в эпигенетической регуляции. Например, в образцах БКР 84,0% случаев мутаций обнаружены в генах гистоновых модификаторов типа «писатели» (см. рисунок). Гены, связанные с гистоновыми модификаторами типа «стиратели» и кофакторами гистоновых модификаторов типа «писатели», занимали второе место с одинаковой долей в 36,8% случаев (см. рисунок). В образцах ПКР мутации наблюдали в группе гистоновых модификаторов типа «писатели» и их кофакторов в 55,5% случаев и типа «читатели» в 38,8% случаев (см. рисунок). В образцах АК гены гистоновых модификаторов типа «писатели» и их кофакторы встречались в 40,0 и 45,0% соответственно. Однако статистически значимых различий между изучаемыми группами не обнаружено. Установлены статистически достоверные различия между АК и базально-клеточной карциномой (p-value 0,000118) и актиническим кератозом и плоскоклеточным раком кожи (p-value 0,0434) в группе генов, участвующих в сигнальном пути Ras/MAPK/PI3K, где мутации значимо чаще встречались в выборке АК (табл. 3).
Таблица 3. Группы генов эпигенетической регуляции во внешней выборке, в которых наблюдаются статистически значимые различия частот мутаций между типами опухолей
| Группа сравнения | p-value |
| Ремоделинг хроматина | |
| БКР против первичной меланомы | 0,000118 |
| БКР против метастазов меланомы | 0,0158 |
| АК против первичной меланомы | 0,00459 |
| БКР против ПКР | 0,0102 |
| Кофакторы ремоделинга хроматина | |
| БКР против первичной меланомы | 0,0447 |
| Кофакторы гистоновых модификаторов | |
| БКР против первичной меланомы | 0,00872 |
| БКР против метастазов меланомы | 0,00467 |
| БКР против ПКР | 0,00677 |
| Гистоновые модификаторы типа «стиратели» | |
| БКР против первичной меланомы | 0,00311 |
| БКР против метастазов меланомы | 0,0298 |
| АК против ПКР | 0,00973 |
| АК против первичной меланомы | 0,00816 |
| БКР против ПКР | 0,00311 |
| Кофакторы гистоновых модификаторов типа «стиратели» | |
| БКР против первичной меланомы | 0,0205 |
| АК против первичной меланомы | 0,00614 |
| АК против метастатической меланомы | 0,0455 |
| Гистоновые модификаторы типа «читатели» | |
| БКР против первичной меланомы | 0,0019 |
| Первичная меланома против метастазов меланомы | 0,0019 |
| Гистоновые модификаторы типа «писатели» | |
| БКР против первичной меланомы | 9,34·10–6 |
| БКР против метастазов меланомы | 0,000148 |
| ПКР против первичной меланомы | 0,00142 |
| ПКК против метастазов меланомы | 0,0314 |
| АК против первичной меланомы | 0,00513 |
| Кофакторы гистоновых модификаторов типа «писатели» | |
| БКР против первичной меланомы | 2,49·10–9 |
| БКР против метастазов меланомы | 1,96·10–6 |
| ПКР против первичной меланомы | 2,13·10–11 |
| ПКР против метастазов меланомы | 3,02·10–9 |
| АК против первичной меланомы | 1,02·10–5 |
| АК против метастазов меланомы | 3,11·10–3 |
| Первичная меланома против метастазов меланомы | 9,88·10–3 |
| РНК-модификаторы | |
| БКР против первичной меланомы | 0,0154 |
| АК против первичной меланомы | 0,00124 |
| Первичная меланома против метастазов меланомы | 0,0184 |
Анализ внешней выборки показал, что гены эпигенетических регуляторов играют гораздо более заметную роль в этиопатогенезе исследуемых опухолей. При сравнении с меланомой статистически достоверны различия в 9 группах генов эпигенетических регуляторов, включая ремоделинг хроматина, кофакторы и гистоновые модификаторы типа «читатели», «писатели» и «стиратели», а также РНК-модификаторы (см. табл. 3), что говорит о большей вовлеченности генов эпигенетических регуляторов в эпителиальных опухолях кожи. Помимо этого, отмечены статистически значимые различия вовлеченности генов эпигенетических регуляторов внутри группы эпителиальных опухолей. Так, наблюдались различия между БКР и ПКР в группах генов ремоделирования хроматина (p-value 0,0102), кофакторов модификации гистонов (p-value 0,00677) и гистоновых модификаторов типа «стиратели» (p-value 0,00311) (см. табл. 3). Установлено, что в вышеуказанных группах генов наблюдалась низкая частота мутаций в плоскоклеточной карциноме кожи по сравнению с БКР. Также статистически достоверные различия наблюдались в группе гистоновых модификаторов типа «стиратели» между АК и ПКР (p-value 0,00973), где АК агрегировал больше мутаций. В этих группах генов частоты мутаций различались между типами опухолей. Так, в группе генов ремоделинга хроматина в образцах ПКР мутации наиболее часто встречались в генах EP400 и SRCAP, по 17% для каждого гена; в базально-клеточной карциноме мутации выявлялись только в гене SRCAP — 28% случаев; в АК наибольшая частота мутаций выявлена в генах группы ремоделеров хроматина CHD5 и ATAD2, по 30% для каждого гена. В группе кофакторов модификации гистонов во всех 3 выборках эпителиальных опухолей мутации наиболее часто встречались в гене ERBB4 (29, 11 и 8% в БКР, АК и ПКР соответственно), а в группе гистоновых модификаторов — в гене SRCAP (28, 27 и 17% в БКР, АК и ПКР соответственно). Несмотря на значительную частоту мутаций этих генов в исследуемых образцах опухолей, они в подавляющем числе случаев являлись миссенс-вариантами, которые не описаны в базе данных ClinVar, но имеют патогенный статус по предикторам MetaSVM [3] и MetaLR [4].
В образцах эпителиальных опухолей кожи внешней выборки наиболее часто обнаруживали мутации гена TP53 — 70,8% образцов ПКР, 58,9% образцов БКР и 55,5% образцов АК. Вторым по частоте встречаемости мутаций был ген KMT2D. Так, в образцах БКР и ПКР его мутации выявлялись в 30,5 и 20,8% случаев соответственно. Установлено, что мутации в гене KMT2C в образцах АК встречались в 44,4% случаев, а в гене KMT2D — в 33,3% образцов.
Обсуждение
Эпигенетические механизмы, такие как ДНК-метилирование/деметилирование, модификации гистоновых белков, ремоделирование хроматина и действие некодирующих РНК, участвуют в формировании паттернов экспрессии генов в течение жизненного цикла клетки [3, 17, 18].
В исследуемых когортах внутренней выборки и группы сравнения превалировали эпигенетические мутации в генах гистоновых модификаторов. «Стиратели», «писатели» и «читатели» гистонов являются ферментами, которые играют одну из важных ролей в эпигенетической регуляции. «Писатели» гистонов (гистоновые ацетилтрансферазы и гистоновые метилтрансферазы) добавляют к гистонам специфические посттрансляционные модификации, тогда как «стиратели» гистонов (гистоновые деацетилазы и гистоновые деметилазы) удаляют эти модификации. «Читатели» гистонов распознают специфические модификации гистонов и опосредуют их функциональный результат, они участвуют в изменении структуры хроматина и экспрессии генов. Мутации в генах, которые кодируют вышеуказанные ферменты, связывают с развитием онкологических заболеваний [19].
Базально-клеточная карцинома является наиболее распространенной злокачественной эпителиальной опухолью и составляет 3/4 всех опухолей данного вида [20]. По данным литературы, чаще всего генетическими альтерациями, наблюдаемыми в опухолевом материале БКР, являются мутации в генах сигнального пути hedgehog, на который приходится более 80,0% случаев мутаций [12, 21, 22]. В исследовании Bonilla и соавт. [12] проанализировано 293 образца опухолевого материала БКР от 236 пациентов, в число наиболее часто встречающихся генов с мутациями входят гены PTCH1 (85,0%), SMO (20,0%) и SUFU (8,0%). В 61,0% случаев мутации встречаются в гене онкосупрессоре TP53, однако лишь в 6,0% из них обнаружена вторая мутация. В нашем исследовании в образцах БКР встречались альтерации (исключительно делеции) в генах KMT2D (47,0%), EZH2 (42,0%), TP53 (37,0%) и HDAC2 (32,0%). При этом повышенная частота мутаций в генах KMT2D (9/19) и HDAC2 (6/19) при БКР ранее не наблюдалась в исследованиях, причем механизмы участия в канцерогенезе гена KMT2D в настоящее время полностью не изучены [24–25].
Вторым по частоте встречаемости раком является ПКР. Исследования показывают, что при данной опухоли мутации чаще встречаются в генах сигнального пути Notch (79,5%), p53 (71,1%), Rb и в генах, продукты которых участвуют в ремоделинге хроматина (по 38,6%). В основном это гены TP53 (66,3%), NOTCH1 (55,4%), NOTCH2 (36,1%), CDKN2A (34,9%) и FAT1 (30,1%), EZH2 (2,4%) [15]. EZH2 является изученным онкогеном, связанным с агрессивными клиническими формами и менее благоприятным прогнозом многих видов рака, включая меланому, ПКР и БКР [26, 27]. Мы обнаружили в образцах ПКР мутации в генах CDKN2A — 61,0% случаев, TP53 — 56,0%, EZH2 — 44,0% и PBRM1 — 28,0%. Следует отметить, что мутации гена PBRM1 в материалах ПКР кожи ранее зарегистрированы не были.
АК считается предшественником плоскоклеточной карциномы кожи. Показано, что не менее 2/3 ПКР возникают из АК [28, 29]. Мутационный профиль АК схож с плоскоклеточной карциномой кожи: в 73,0% случаев выявляются мутации TP53, в 68,0% — NOTCH1, в 65,0% — FAT1 [18]. В нашем исследовании в 40,0% случаев АК наблюдались несинонимичные мутации в генах PIK3CA и TP53, носящие патогенный статус, по данным ClinVar.
Как во внутренней, так и во внешней выборке нами отмечена высокая вовлеченность генов эпигенетического регулирования в онкогенез эпителиальных опухолей. На основании полученных данных выявлены статистически значимые различия между АК и ПКР, а также между АК и БКР.
В эпителиальных опухолях различия наблюдались между группами генов, участвующих в ремоделировании хроматина (БКР и ПКР), кофакторов модификации гистонов (БКР и ПКР) и гистоновых модификаторов типа «стиратели» (АК и ПКР). Выявлены частые мутации генов в ПКР, БКР и АК. Так, в плоскоклеточной карциноме установлены мутации в генах EP400 и SCRAP, в БКР наиболее часто встречались мутации гена ERBB4, а в АК — в генах CHD5 и ATAD2. Необходимо отметить, что ранее данные гены не были отмечены в исследованиях, которые включали большое количество образцов [11, 14, 15].
Заключение
Исследована вовлеченность разных групп генов эпигенетической регуляции при эпителиальных опухолях кожи. Установлена высокая частота соматических мутаций разных типов генов эпигенетической регуляции как во внутренней, так и во внешней выборке. Наиболее явное отличие наблюдалось в группе гистоновых модификаторов кофакторов типа «писатели». В ПКР установлены частые мутации в генах EP400 и SCRAP, в БКР наиболее часто встречались мутации гена ERBB4, а в АК — в генах CHD5 и ATAD2.
В обеих когортах отмечены статистические различия вовлеченности разных групп генов эпигенетических регуляторов между АК и ПКР, между АК и БКР. Так, в нашем исследовании установлены частые мутации гена KMT2D и TP53 в опухолевом материале БКР, ПКР и АК, мутации в генах CDKN2A и PIK3CA при ПКР и АК. Выявлена большая вовлеченность генов эпигенетических регуляторов в эпителиальных опухолях кожи по сравнению с меланомой.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования, написание текста — Аношкин К.И.
Сбор материала — Седова Т.Г.
Редактирование — Седова Т.Г., Хлебникова А.Н., Стрельников В.В.
Анализ данных и интерпретация результатов — Карандашева К.О.
Выделение ДНК из образцов биопсийного материала — Дерягина Т.А.
Выполнение молекулярно-генетического анализа — Бычкова Е.В.
Анализ данных и интерпретация результатов — Бяхова М.М.
Источник финансирования. Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России для ФГБНУ «МГНЦ» на выполнение НИР в 2023 г.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Authors’ contributions:
The concept and design of the study, drafting the manuscript: Anoshkin K.I.
Collecting the data: Sedova T.G.
Revising the manuscript: Sedova T.G., Hlebnikova A.N., Strelnikov V.V.
Data analysis and interpretation of results —Karandasheva K.O.
DNA isolation from biopsy samples —Deryagina T.A.
Performing molecular genetic analysis — Bichkova E.V.
Data analysis and interpretation of results —Byahova M.M.
The source of financing. The work was carried out within the framework of the state assignment of the Ministry of Education and Science of the Russian Federation for the Federal State Budgetary Scientific Institution «MGNC» to carry out research in 2023.