Дерматомикозы — поверхностные микозы кожи, вызываемые кератофильными микромицетами (дерматомицеты, син. — дерматофиты), составляют большую часть всех грибковых заболеваний человека и теплокровных животных. Частота их встречаемости колеблется в зависимости от климатических, региональных и социально-экономических особенностей от 5 до 30% [1]. Несмотря на наличие большого количества современных лекарственных препаратов для лечения дерматомикозов, эффективность терапии системными антимикотиками для некоторых клинических форм не превышает 80% [2]. Сложнее всего лечить онихомикоз. Часто терапия онихомикоза оказывается недостаточно эффективной, а в случаях успешного излечения развиваются рецидивы. Связано это с проблемой доставки лекарственных средств в пораженные участки ногтевой пластинки, особенно в зону матрикса. Лучшие результаты терапии онихомикоза получены при комбинации системных и местных антимикотиков [3]. Однако из-за риска развития нежелательных явлений при приеме системных препаратов монотерапия топическими антимикотиками более безопасна. Наиболее эффективны в терапии онихомикоза производные аллиламинов, так как оказывают фунгицидное действие на основные возбудители онихомикоза — дерматомицеты. Доказано также, что они активны и по отношению к недерматомицетам. Одним из применяемых средств для лечения онихомикоза является 1% раствор нафтифина гидрохлорида, при использовании которого за счет ингибирования фермента скваленэпоксидазы возникают нарушения биосинтеза эргостерола — основного компонента клеточных мембран. В результате этого клетки грибов погибают. Нафтифина гидрохлорид наиболее активен по отношению к дерматомицетам (Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, T. tonsurans, Microsporum spp., Epidermophyton floccosum), а также действует на плесневые микромицеты (Aspergillus spp., Penicillium spp.) и дрожжи (Rhodotorula mucilaginosa, Candida spp.) [4]. Механизм действия этого антимикотика в условиях культуры хорошо изучен на примере референтных штаммов дерматомицетов. Мы впервые исследовали демонстрирующее действие 1% раствора нафтифина гидрохлорида на возбудителей онихомикоза во время терапии данного заболевания у конкретного больного.

Цель исследования — изучить изменения морфологии колоний грибов и составляющих их клеток, а также изменения тканевых форм грибов в ногтевых пластинах, происходящие в результате действия 1% раствора нафтифина гидрохлорида на возбудителей онихомикоза в ходе 6-месячного лечения пациентки 30 лет при помощи микробиологических, гистологических методов исследования, а также сканирующей электронной микроскопии (СЭМ).

Материал и методы

Исследование проведено в НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина СЗГМУ им. И.И. Мечникова.

Больная онихомикозом, 30 лет, изменение ногтевых пластинок отметила за год до обращения в микологическую клинику. В первый визит предъявляла жалобы на изменение цвета, структуры ногтей на левой кисти. При осмотре выявлены клинические признаки онихомикоза: утолщение, деформация, помутнение, появление желтоватой окраски дистально-латеральной части ногтевых пластинок на II и III пальцах левой кисти. Подногтевой гиперкератоз захватывал 1/3 ногтевых пластинок, отмечен очаговый онихолизис.

Протокол исследования предусматривал следующие критерии включения: подписание информированного согласия, совершеннолетний возраст, подтверждение диагноза онихомикоза методами микологического исследования микроскопией и посевом с дальнейшей идентификацией возбудителя. Критерии исключения: наличие СПИД или иных иммунодефицитных состояний, медленный рост ногтей — менее 1 мм за месяц, наличие соматических и кожных заболеваний, сопровождающихся развитием ониходистрофий, употребление алкоголя и/или психотропных веществ.

После подтверждения диагноза и получения культуры возбудителя T. rubrum больной назначена наружная терапия 1% раствором нафтифина гидрохлорида. Для терапии был выбран оригинальный препарат Экзодерил, 1% раствор (действующее вещество — нафтифина гидрохлорид). Больная наносила его в соответствии с инструкцией 2 раза в день на протяжении всего срока лечения (6 мес).

До начала лечения онихомикоза кроме оценки клинических симптомов заболевания проведено морфологическое исследование культуры и составляющих ее клеток при помощи световой микроскопии и СЭМ, а также гистологическое исследование пораженных ногтевых пластинок. В соответствии с протоколом исследования оценка клинической и микологической эффективности терапии, а также определение характера изменений тканевых форм грибов в ногтевых пластинах и морфологии культуры и составляющих их клеток, произошедших в результате действия 1% раствора нафтифина гидрохлорида на возбудителей онихомикоза, должны были проводиться после 3 и 6 мес от начала лечения.

Клиническую эффективность нафтифина гидрохлорида оценивали на основании изменений цвета, прозрачности, толщины ногтя, площади поражения и наличия или отсутствия онихолизиса и/или гиперкератоза. Микологическую эффективность оценивали по результатам культурального и гистологического исследований.

Для культурального исследования провели посев патологического материала, полученного путем соскоба ногтевых пластинок и подногтевых гиперкератотических масс на среду Сабуро. Культуру гриба выращивали в термостате при 27°С. Через 20 сут получили колонию мицелиального гриба (рис. 1, а) диаметром 4,5 см. Молекулярно-генетическими методами изолят определен по ITS-локусу как Trichophyton rubrum (Castellani) Sabour. Последующие посевы патологического материала проведены через 3 и 6 мес после начала лечения 1% раствором нафтифина гидрохлорида.

Рис. 1. Общий вид 20-дневной колонии T. rubrum в стерео- (а) и в СЭМ (ж—н) микроскопах, гистология дистальной (б, в) и латеральной (г—е) частей пораженных ногтей до лечения 1% раствором нафтифина; общий вид 20-дневной колонии T. rubrum в стереомикроскопе (о) и гистология дистальной (п) и латеральной (р) частей ногтей через 3 мес после начала лечения. б—е, о—р, п, р — окрашивание PAS+Г. Мк — макроконидия.

Гистологическое исследование ногтевых пластинок проводили до лечения, а также в конце 3-го и 6-го месяцев от начала исследования. Для этого произвели забор небольших кусочков ногтевых пластинок с дистальной и латеральной частей ногтей II и III пальцев левой кисти пациентки до лечения. Для выявления грибов использовали окрашивание PAS-методом с докраской гематоксилином (PAS+Г).

Для СЭМ фиксировали кусочки питательной среды с частью колонии гриба из краевой, средней и центральной зон. Методы гистологического и электронно-микроскопического исследований, использованные в настоящем исследовании, описаны нами ранее в других работах [5, 6].

Колонии гриба изучали и фотографировали в стереоскопическом микроскопе SteREO Lumar. V12 (Carl Zeiss, Германия). Гистологические препараты исследовали и фотографировали в световом микроскопе Axio Lab. 1 (Carl Zeiss, Германия). Морфологические особенности колоний гриба и составляющих их клеток исследовали в СЭМ (JSM 6390-LA, Jeol, Япония).

Результаты

До начала лечения на целевых ногтях II и III пальцев левой кисти наблюдали желтовато-белую окраску, утолщение за счет гиперкератоза, деформацию в виде небольшой изогнутости, помутнение с дистального края обеих ногтевых пластинок. Подногтевой гиперкератоз захватывал одну треть каждой ногтевой пластинки, в 2 местах на одном из ногтей отмечен очаговый онихолизис. Таким образом, у больной до начала терапии выявлены клинические проявления, характерные для дистально-латерального онихомикоза, а также как минимум два прогностически неблагоприятных для эффективной терапии признака (онихолизис, подногтевой гиперкератоз).

В результате культурального исследования измененных ногтей получен рост дерматомицета T. rubrum. Диаметр колоний, выросших через 20 дней, достигал 4 см. Они были бархатистыми, мучнистыми, пурпурно-красной окраски (включая реверзум) с небольшой белой зоной в центре (см. рис. 1, а).

Гистологическое исследование продольных срезов пораженных частей ногтевых пластин до начала терапии показало, что многочисленные гифы гриба сосредоточены непосредственно в толще ногтевой пластики (см. рис. 1, б, 1, в, стрелки), тогда как в вентральной ее части они отсутствовали (см. рис. 1, б, 2). В ногтевой пластинке гифы гриба располагались плотно и хаотично направленно относительно друг друга. Для гиф было характерно сильное ветвление (см. рис. 1, в, головки стрелок), эта особенность описана и другими авторами [7]. Контуры гиф гриба были относительно ровные. Элементы спороношения и другие типы клеток отсутствовали. В ногте гифы гриба были хорошо различимы и имели ярко-малиновую окраску (см. рис. 1, б, 1, в).

В участке латеральной части исследуемой ногтевой пластинки, прилежащем вплотную к ногтевому ложу, выявлены редкие, одиночные или в немногочисленных группах гифы мицелия (см. рис. 1, г, стрелки), которые располагались продольно относительно слоев роговых клеток, слегка извилистые, латеральное ветвление отсутствовало. Здесь также наблюдали варьирующие по размерам (от 15×5,2 до 30×90 мкм), продольно ориентированные относительно слоев рогового вещества структуры линзовидной формы (см. рис. 1, д, 1, е, стрелки), состоящие из плотно расположенных дрожжевых клеток эллипсоидной формы (1,5×4,5 мкм), находящиеся на разных стадиях почкования. Следует отметить, что скопления дрожжевых клеток локализовались на некотором удалении друг от друга и от скоплений гиф мицелия T. rubrum. Таким образом, дрожжевые формы гриба выявлены в ходе гистологического изучения срезов дистальных и латеральных частей пораженных ногтей, высевы которых на среду Чапека отсутствовали. Остается открытым вопрос о роли выявленных дрожжевых клеток в ходе течения онихомикоза. В обычной практике такие находки рассматривают как контаминацию дрожжами дерматомицетного поражения ногтей. Известно, что дрожжи — второй по частоте встречаемости (14,9%) возбудитель онихомикоза после дерматомицетов [8]. В этиологии онихомикозов доминирующее положение (70—95%) занимают дерматомицеты, а среди них — T. rubrum [9]. В литературе описан дрожжевой онихомикоз латеральной части ногтя у 28-дневного ребенка с формированием, как и в нашем случае, структур линзовидной формы, состоящих из дрожжевых клеток и гиф псевдомицелия Candida albicans [10]. Поэтому было решено оценить, какое действие оказывает нафтифина гидрохлорид не только на T. rubrum, но и на выявленные дрожжи.

Помимо этого, до начала лечения с помощью СЭМ изучено микроморфологическое строение краевой, средней и центральной частей 20-дневной колонии T. rubrum. В краевой части колонии рыхло и хаотично располагались тонкие (2—2,5 мкм) гифы с гладкой клеточной стенкой (см. рис. 1, ж, стрелки). Ветвление гиф мицелия было умеренным. Часто обнаруживали апикальные клетки гиф, простирающиеся по поверхности питательной среды, а также располагающиеся вертикально (см. рис. 1, з, стрелки). Гифы мицелия в краевой части колонии локализовались поодиночке или в немногочисленных плотных группах (см. рис. 1, ж).

В средней части колонии плотность расположения гиф гриба была намного выше (см. рис. 1, и, стрелки). Диаметр гиф колебался от 2,5 до 3 мкм. Редко встречались небольшого диаметра (5—15 мкм) неправильной формы полости (см. рис. 1, и), придававшие поверхности культуры ячеистый вид. Отличительной особенностью строения средней части колонии гриба так же, как и в краевой зоне, было наличие большого числа вертикально ориентированных апикальных клеток гиф (см. рис. 1, и, головки стрелок). В этой зоне наблюдали многочисленные латеральные или апикальные веретеновидной (4—6×15—25 мкм) формы макроконидии, ориентирующиеся вертикально и находившиеся на разных стадиях развития (см. рис. 1, к—м). Структура поверхности клеточной стенки макроконидий была слегка «морщинистой». В центральной части колонии гифы мицелия (см. рис. 1, н, стрелки) располагались хаотично и рыхло относительно друг друга, макроконидии отсутствовали.

Через 3 мес от начала лечения отмечена выраженная положительная динамика: зона поражения ногтевых пластинок уменьшилась на 75% от исходного размера, проявления гиперкератоза разрешились, однако остался небольшой очаг онихолизиса. Несмотря на выраженную положительную динамику клинической симптоматики, микологические исследования выявили возбудителя в очаге поражения. Получен рост культуры T. rubrum. Через 20 дней роста на питательной среде (см. рис. 1, о) диаметр колонии составил 2,5 см. Следует отметить, что скорость роста данной культуры была меньше по сравнению со скоростью роста культуры, полученной до лечения. Выявлены дегенеративные изменения культуры, возникшие в результате применения (2 раза в день в течение 3 мес) 1% раствора нафтифина гидрохлорида. Отличительной чертой изменений культуры стало снижение интенсивности окраски (депигментация), наличие в центральной части неправильной формы более выраженного белого налета, расходящегося лучами до маргинальной части колонии (см. рис. 1, о, стрелки). Подобные изменения, а именно снижение интенсивности окраски колоний и депигментация, ранее обнаружены при исследовании действия нафтифина на дрожжевой вид гриба — Rhodotorula mucilaginosa [11].

Гистологическое изучение измененной части ногтевой пластинки с дистального края показало значительное уменьшение количества гиф гриба (см. рис. 1, п, стрелки). Они стали короче, сильно искривлялись, латеральные ветвления отсутствовали. Преобладали очень короткие и извилистые одиночные фрагменты гиф. Количество гиф в латеральных частях ногтей было еще меньше (см. рис. 1, р, стрелки), чем в дистальных частях. Они отличались более слабой окраской и отсутствием латерального ветвления. Следует отметить, что выявленные до начала лечения дрожжевые грибы в латеральной зоне ногтей при гистологическом исследовании через 3 мес не обнаружены (см. рис. 1, р). По данным A.C. Mot и соавт. [11], 1% раствор нафтифина гидрохлорида оказывает ингибирующее влияние на процесс почкования дрожжевых клеток R. mucilaginosa [11]. Вероятно, что и в нашем случае нафтифин оказал подобное действие на дрожжевые грибы, вызвав их гибель.

Результаты исследования микроморфологии 20-дневной колоний T. rubrum с помощью СЭМ, проведенного через 3 мес после начала лечения онихомикоза 1% раствором нафтифина гидрохлорида, показали, что в краевой ее части (рис. 2, а) апикальные сегменты гиф встречались редко, и для них вертикальная ориентация не была характерна (см. рис. 2, а, стрелка). У большей части гиф были сильно деформированные клеточные стенки с многочисленными перфорациями (см. рис. 2, а, головки стрелок). В средней части колонии гифы гриба располагались плотно и хаотично относительно друг друга (см. рис. 2, б). Диаметр вегетативных гиф стал заметно меньше и варьировал от 1,5 до 2 мкм. Встречались гифы с гладкой либо сильно деформированной клеточной стенкой, последние изменения преобладали. В клеточных стенках наблюдали многочисленные перфорации небольших размеров (0,3—0,5 мкм) и формы (сферические, эллипсоидальные, неправильной формы, щелевидные, см. рис. 2, б, головки стрелок). В центральной части колонии преобладали гифы с сильно деформированными перфорированными клеточными стенками (см. рис. 2, в). В изученной колонии макроконидии отсутствовали (см. рис. 2, а—в).

Рис. 2. Строение краевой (а), средней (б) и центральной (в) частей 20-дневной колонии T. rubrum через 3 мес после начала лечения в СЭМ, гистология дистальной (г) и латеральной (д, е) частей ногтей через 6 мес после лечения. г—е — окрашивание PAS+Г.

Через 6 мес после начала лечения 1% раствором нафтифина гидрохлорида клинических проявлений онихомикоза не наблюдали. Для контроля лечения были сострижены свободные части целевых ногтевых пластинок.

Посевы с дистальных и латеральных частей ногтей II и III пальцев левой кисти оказались отрицательными. Гистологическое изучение продольных срезов дистальных частей ногтевых пластин выявило наличие небольшого числа единичных коротких прямых, продольно располагающихся гиф (см. рис. 2, г, стрелки). В вентральной части ногтевой пластины отмечены светлые узкие полости (см. рис. 2, г, головки стрелок) небольшой протяженности, представляющие собой участки, образовавшиеся после лизиса гиф. В латеральных частях ногтевых пластин выявлены одиночные (см. рис. 2, е, стрелки) или в небольших группах (см. рис. 2, д, стрелка), короткие прямые или слегка извилистые гифы.

Обсуждение

Мониторинг эффективности терапии онихомикоза, несмотря на все достижения медицинской микологии последних лет, представляет несомненную сложность и важность. Известно, что она не превышает 80—90% даже при использовании комбинаций топических и системных антифунгальных препаратов [2]. Это объясняется многими факторами как со стороны возбудителей, так и со стороны больного онихомикозом. Возбудитель может обладать резистентностью к применяемым антимикотикам, а у больного может быть целый спектр прогностически неблагоприятных факторов, таких как подногтевой гиперкератоз, онихолизис, медленный рост ногтевых пластинок, дерматофитомы, сахарный диабет и т. д. [3]. Существует еще много недостаточно изученных обстоятельств, которые могут способствовать низкой эффективности терапии. Недостаточно сведений о влиянии нескольких возбудителей онихомикоза в одной ногтевой пластинке на эффективность терапии. Актуальными остаются следующие вопросы: с какой силой действует применяемый антимикотик на разных возбудителей, достаточно ли при длительно текущем, плохо поддающемся лечению онихомикозе стандартной продолжительности терапии?

Антимикотики местного действия, применяемые для лечения онихомикоза, более безопасны по сравнению с системными препаратами. Их эффективность обусловлена прежде всего механизмом действия на клетку гриба. Считается, что наиболее эффективно работают антифунгальные средства, оказывающие на грибы фунгицидное действие. Одним из таких веществ является нафтифина гидрохлорид — действующее вещество препарата «Экзодерил», 1% раствор. Этот препарат широко применяется для лечения онихомикоза в Российской Федерации как в качестве монотерапии, так и в сочетании с системными антимикотиками. Нафтифина гидрохлорид относится к аллиламинам и активен по отношению к большинству возбудителей онихомикоза, наибольшую активность проявляет в отношении дерматомицетов. Наше исследование продемонстрировало его фунгицидное действие, о чем свидетельствуют дегенеративные изменения культуры и нарушения строения клеток гиф возбудителя, а также образование перфораций в стенках клеток гиф дерматомицета T. Rubrum и полная элиминация дрожжевого гриба, возникшие в результате применения нафтифина в терапии онихомикоза.

Мониторинг лечения онихомикоза показал, что через 3 мес после начала применения 1% раствора нафтифина гидрохлорида значительно снизилась скорость роста колонии T. rubrum, отмечено ослабление ее пигментации и появление в воздушном мицелии большого количества гиф без пигмента. Изучение колонии в СЭМ показало отсутствие спороношения, появление большого числа сильно деформированных гиф, имеющих многочисленные перфорации в клеточной стенке, что в норме не характерно для этого вида гриба [12, 13]. Перфорации локально «обнажают» плазматическую мембрану, а следовательно, делают ее и впоследствии другие внутриклеточные структуры доступными для данного антимикотика. Интересным представляется то, что подобные изменения мы наблюдали в трансмиссионном электронном микроскопе при изучении действия изоконазола (антимикотика азолового ряда) на бактерии. Его фармакологическое действие, как и нафтифина гидрохлорида, связано с ингибирующим действием на процесс синтеза эргостерола — составной части мембран клетки. Воздействие изоконазола привело к образованию большого числа перфораций в клеточной стенке бактерий — Staphylococcus aureus и S. haemolyticus [14]. По всей видимости, эти механизмы действия антимикотиков являются универсальными для любого вида клеток-мишеней, в том числе таких, как бактерии и грибы.

Таким образом, 1% раствор нафтифина гидрохлорида способен вызывать локальный лизис хитина клеточных стенок вегетативных гиф T. rubrum. Очевидно, что этот феномен, а также подавление биосинтеза эргостерола плазмалеммы и других внутриклеточных мембран клеток гиф приводили к нарушению тургора клеток, целостности и сильной деформации их стенок, что вызывало их гибель. Подтверждением того, что выявленные изменения связаны именно с действием применяемого антимикотика, является тот факт, что в ходе естественного старения клеток гиф клеточная стенка дерматомицетов, по данным трансмиссионной электронной микроскопии, долго сохраняет присущую ей форму (вплоть до полного опустошения содержимого клеток) и только после этого распадается на фрагменты [15], а не деформируется как в описываемом нами случае.

Изучение колоний T. rubrum в СЭМ через 3 мес после начала лечения показало, что макроконидии более чувствительны к действию раствора нафтифина, чем клетки вегетативного мицелия, что подтверждает их полное отсутствие в колониях гриба. Бóльшая чувствительность к данному антимикотику выявлена при гистологическом исследовании и у дрожжевых грибов, ранее обнаруженных в латеральных участках ногтей.

Микробиологически действие 1% раствора нафтифина гидрохлорида на строение колоний T. rubrum и входящих в их состав клеток выражалось в снижении скорости роста и интенсивности окраски колоний, а также в частичной депигментации. При гистологическом исследовании выявлены элиминация дрожжевого гриба в латеральных частях ногтей и значительное уменьшение числа гиф T. rubrum в дистальной и латеральных частях ногтей, а также сокращение протяженности гиф и исчезновение латерального ветвления. Электронно-микроскопически выявлено снижение количества апикальных сегментов гиф вегетативного мицелия и изменение характера их ориентации (с вертикальной на горизонтальную), отсутствие спороношения в виде макроконидий, наличие для большей части гиф сильно деформированных и перфорированных клеточных стенок. Очевидно, что ингибирование синтеза эргостерола приводит к редукции апикального роста гиф, характерного для формирующихся макроконидий. В свете полученных результатов исследования на микроскопическом и ультраструктурном уровнях действия нафтифина гидрохлорида на дерматомицет T. rubrum становится понятным и его ингибирующее действие на процесс почкования дрожжевых клеток R. muclaginosa [11], происходящий у всех видов дрожжей путем чередования апикального и изодиаметрического роста дочерней клетки [16, 17].

Согласно результатам исследования, 1% раствор нафтифина гидрохлорида не только ингибирует синтез эргостерола мембран клеток грибов, но и вызывает формирование перфораций в клеточной стенке возбудителя. Итогом действия данного антимикотика на клеточные стенки T. rubrum являются их депигментация и нарушение целостности. Интересно, что у дрожжевых клеток R. mucilaginosa [11] нафтифина гидрохлорид также вызывал депигментацию внутреннего слоя клеточной стенки, что, по нашему мнению, способствует облегченному проникновению его по направлению к плазмалемме и другим внутриклеточным мембранам.

С клинической точки зрения интересно, что, несмотря на полное выздоровление больной, о чем свидетельствуют результаты клинических (отрастание полностью здоровых ногтевых пластинок) и микробиологических (отсутствие высева) исследований, при гистологическом исследовании ногтей с окраской методом PAS и гематоксилином выявлены редкие, одиночные, короткие, тонкие, без признаков латерального ветвления, слабо окрашенные фрагменты сильно измененных отмерших гиф возбудителя. Впервые примененный нами при изучении онихомикоза метод гистологического исследования ногтей при помощи окраски методом PAS и гематоксилином показал его высокую чувствительность, поскольку он позволяет выявить даже минимальное количество сильно измененных и отмерших фрагментов гиф гриба после проведенной эффективной терапии. С целью предотвращения рецидива требуется проведение наружной терапии не только до полного отрастания визуально здоровой ногтевой пластинки, но и некоторое время спустя с последующим назначением противогрибковых лаков на основе аморолфина.

Проведенное исследование позволило выявить разнообразные механизмы действия 1% нафтифина гидрохлорида на строение колоний и клеток гиф дерматомицета T. rubrum — самого частого возбудителя онихомикоза. Его результаты могут стимулировать дальнейшие исследования с целью разработки новых направлений в терапии онихомикоза.

Благодарность

Выражаем глубокую признательность научному сотруднику НИЛ молекулярно-генетической микробиологии Д.М. Лавникевич за видовую идентификацию изолята гриба.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.А. Степанова, Н.В. Васильева, К.И. Разнатовский

Сбор и обработка материала — А.А. Степанова, Ю.Л. Авдеенко, Г.А. Чилина, А.О. Томашева, З. Аль Каиси

Написание текста — А.А. Степанова, Л.П. Котрехова, В.Г. Корнишева, Ю.Л. Авдеенко

Редактирование — А.А. Степанова, Л.П. Котрехова, К.И. Разнатовский

Authors’ contributions:

The concept and design of the study — A.A. Stepanova, N.V. Vasilyeva, K.I. Raznatovsky

Collecting and interpreting the data — A.A. Stepanova, Yu.L. Avdeenko, G.A. Chilina, A.O. Tomasheva, Z. Al Kaisi

Drafting the manuscript — A.A. Stepanova, L.P. Kotrekhova, V.G. Kornisheva, Yu.L. Avdeenko

Revising the manuscript — A.A. Stepanova, L.P. Kotrekhova, K.I. Raznatovsky

Материал подготовлен при участии компании "Сандоз".

Material prepared with the participation of Sandoz.