Современные лабораторные методы и алгоритмы диагностики сифилиса

Авторы:
  • Н. В. Фриго
    ГБУЗ «Московский научно-практический центр дерматовенерологии и косметологии» Департамента здравоохранения Москвы, Москва, Россия, 119071
  • О. В. Жукова
    ГБУЗ «Московский научно-практический центр дерматовенерологии и косметологии» Департамента здравоохранения Москвы, Москва, Россия, 119071
  • Н. А. Сапожникова
    ГБУЗ «Московский научно-практический центр дерматовенерологии и косметологии» Департамента здравоохранения Москвы, Москва, Россия, 119071
Журнал: Клиническая дерматология и венерология. 2015;14(6): 56-61
Просмотрено: 38907 Скачано: 2358

Сифилис — системное инфекционное заболевание, вызываемое бледной трепонемой (Treponema pallidum, subspecies pallidum), остается общемировой проблемой здравоохранения.

В Москве в последние годы отмечена стойкая тенденция к снижению заболеваемости сифилисом. В 2013 г. уровень заболеваемости сифилисом составил 20,4 на 100 000 населения. Однако эпидемиологическая ситуация продолжает оставаться напряженной: в структуре сифилиса преобладают скрытые формы, растет число поздних форм инфекции, что диктует необходимость усиления эпидемиологического контроля над распространением заболевания и широкого применения врачами-дерматовенерологами современных высокочувствительных и специфичных методов лабораторной диагностики сифилиса [1].

Все лабораторные методы диагностики сифилиса подразделяются на прямые, позволяющие выявлять возбудителя или его генетический материал непосредственно в очагах поражения, и непрямые — для выявления антител к возбудителю сифилиса в сыворотке крови (серологическая диагностика).

При назначении пациенту лабораторного обследования по поводу сифилиса не следует забывать о том, что абсолютным критерием постановки диагноза является непосредственное выявление возбудителя заболевания — бледной трепонемы (T. pallidum) или его генетического материала [2].

T. pallidum в образцах, полученных из райц-серума сифилидов или инфицированных лимфоузлов при раннем сифилисе, можно обнаружить с помощью следующих прямых методов исследования:

• микроскопия в темном поле микроскопа, или темнопольная микроскопия (ТПМ);

• прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) (для образцов из поражений в полости рта или из других очагов, где возможна контаминация трепонемами-комменсалами);

• полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Наиболее убедительным доказательством инфицирования сифилисом является прямая визуализация T. pallidum в темном поле зрения [3].

Материалом для темнопольной микроскопии является серозное отделяемое с поверхности эрозии, язвы, мацерированной или экскориированной, эрозированной папулы или бляшки, иногда — содержимое пунктата лимфоузла. При исследовании в темном поле бледная спирохета выглядит в виде нежной подвижной спирали, слабо светящейся серебристым блеском. Исследование в темном поле микроскопа позволяет изучать T. pallidum в живом виде, а также дифференцировать ее от других трепонем как по морфологическим признакам, так и по характерным особенностям движения, что позволяет поставить диагноз даже без учета данных серологических тестов.

Вторым методом выявления возбудителя сифилиса в очагах поражения является метод ПИФ. В результате взаимодействия моноклональных антител анти-T. pallidum, меченных ФИТЦ, и бледной трепонемы, полученной из очагов поражения и помещенной на предметное стекло, при люминесцентной микроскопии наблюдается специфическое ярко-зеленое свечение. Метод удобен при исследовании материала, полученного со слизистой оболочки полости рта и прямой кишки, при биопсии или аутопсии. За счет использования видоспецифических моноклональных антител метод позволяет дифференцировать патогенную T. pallidum от трепонем-комменсалов [4]. В России данный метод не применяют ввиду отсутствия промышленного производства и сертификации соответствующих ингредиентов, в частности, моноклональных антител к патогенной бледной трепонеме, меченных ФИТЦ.

ПЦР позволяет обнаружить единственную молекулу ДНК возбудителя среди миллионов других молекул. Метод основан на принципе естественной репликации ДНК и заключается в размножении (амплификации) в пробирке определенных участков ДНК возбудителя в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом этапе вновь синтезированные молекулы копируются ферментом ДНК-полимеразой, благодаря чему происходит многократное удвоение специфических фрагментов ДНК [5].

Источниками обнаружения генетического материала возбудителя при постановке ПЦР у больных сифилисом могут являться: райц-серум (тканевая жидкость) генитальных язв, биопсийный материал кожных сифилидов, спинномозговая жидкость, амниотическая жидкость, плацента, периферическая кровь и семенная жидкость. Наиболее адекватным для исследования является райц-серум генитальных язв.

Чувствительность и специфичность метода ПЦР при исследовании райц-серума сифилидов при первичном сифилисе достигает 94,7—98,6%, при вторичном 80—98,6% и более выражена по сравнению с темнопольной микроскопией [6].

Широкое применение при обследовании на сифилис получили непрямые, серологические методы исследования, принцип которых заключается в выявлении в сыворотке или плазме крови или спинномозговой жидкости пациентов антител, ассоциированных с сифилитической инфекцией.

Первой серологической реакцией для диагностики сифилиса была реакция связывания комплемента, предложенная в 1906 г. Вассерманом, Нейсcером и Бруком [7]. Однако в настоящее время этот метод, ставший в свое время революционным и положивший начало серологической диагностике сифилиса, считается морально устаревшим: он длительно выполняется, субъективно интерпретируется, часто дает ложноотрицательные и ложноположительные результаты и не подлежит стандартизации.

Современные серологические тесты, применяемые для диагностики сифилиса, подразделяются на две большие группы: нетрепонемные (НТТ) и трепонемные (ТТ).

В НТТ на сифилис используется антиген нетрепонемного происхождения — кардиолипин-холестерол-лецитиновый комплекс [8, 9].

Основными видами НТТ, рекомендуемыми к применению на территории России, в настоящее время являются:

— РМП — реакция микропреципитации с плазмой и инактивированной сывороткой;

— RPR — тест быстрых плазменных реагинов (Rapid Plasma Reagins), или быстрый, или ускоренный плазмареагиновый тест;

— VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) — тест исследовательской лаборатории венерических заболеваний.

Могут быть также использованы следующие их аналоги при условии, если тест-система имеет разрешение к медицинскому применению на территории Российской Федерации:

TRUST — тест с толуидиновым красным и непрогретой сывороткой (Toluidin Red Unheated Serum Test);

RST — тест на скрининг реагинов (Reagin Screen Test);

USR — тест на реагины с непрогретой сывороткой (Unheated Serum Reagins) [10, 11].

Показаниями к применению НТТ на сифилис являются:

• проведение скрининга населения на сифилис;

• контроль эффективности терапии (по титру антител в парных сыворотках, полученных до и после лечения);

• определение активности инфекции (по высоте титра антител).

НТТ просты в исполнении, недороги, не требуют специального оборудования и длительного времени; при этом реакции являются высоко чувствительными и специфичными.

Чувствительность РМП варьирует в зависимости от стадии заболевания: от 81% при первичном сифилисе до 94—99% при вторичном и скрытых формах сифилиса. Чувствительность зарубежных тестов варьирует от 59 до 100%, специфичность — от 93 до 99%.

После адекватного специфического лечения сифилиса содержание антител к возбудителю сифилиса, выявляемых в НТТ, постепенно снижается, тесты из резко положительных становятся слабоположительными, а затем отрицательными. В связи с этим НТТ используют для оценки эффективности лечения.

Ограничениями применения НТТ являются ранние стадии сифилиса (период инкубации, начало первичного периода), так как данные реакции становятся позитивными лишь спустя 2—3 нед после появления твердого шанкра, и поздние стадии (поздний скрытый и третичный сифилис, сифилис с поражением внутренних органов и нервной системы), так как лабильные преципитины первыми элиминируются из организма при длительном течении сифилитической инфекции. К числу недостатков НТТ следует отнести также субъективный визуальный учет, хотя в настоящее время разработаны системы для видеоцифровой регистрации результатов с их переводом в цифровые данные.

Следует иметь в виду, что антитела, определяемые в НТТ на сифилис, могут выявляться при ряде острых и хронических инфекционных и соматических заболеваний, которые сопровождаются гибелью клеток и разрушением тканей, что может стать причиной ложноположительных результатов НТТ, которые встречаются при скрининге населения на сифилис в 1—3% случаев [12].

В ТТ применяется антиген трепонемного происхождения — патогенная бледная трепонема, рекомбинантные белки, полученные генно-инженерным способом или пептиды, полученные путем искусственного химического синтеза.

Основными ТТ, рекомендуемыми к применению на территории России, в настоящее время являются:

ИФА — иммуноферментный анализ (ELISA — Enzymelynced immunosorbent assay, EIA – Enzyme immunoassay);

РПГА — реакция пассивной гемагглютинации (ТРНА, TPPA — Treponema pallidum hemagglutination assay, Treponema pallidum partiсle agglutination assay);

РИФ — реакция иммунофлюоресценции (FTA Fluorescent treponemal antibody);

Иммуноблоттинг (Immunoblotting);

ИХЛ — иммунохемилюминесценция (СLIA — Chemiluminescence Immunoassay);

Простые быстрые тесты у постели больного — ПБТ (РОС — point of care tests);

РИБТ (РИТ) — реакция иммобилизации бледных трепонем (TPI — Treponema pallidum immobilization test) [13, 14].

Показаниями к применению ТТ являются:

• подтверждение положительных результатов НТТ;

• дополнительное подтверждение в случае расхождения результатов скринингового ТТ и последующего НТТ;

• скрининг населения на сифилис (ИФА, РПГА, простые быстрые тесты).

К числу несомненных достоинств ТТ относится их высокая чувствительность и особенно специфичность, возможность подтверждения (верификация) результатов НТТ.

Часть ТТ (ИФА, ИХЛ, иммуноблоттинг) может быть автоматизирована и выполняться на анализаторах с получением объективного отчета в электронном виде. Для РПГА имеется возможность видеоцифровой регистрации результатов.

ТТ могут быть использованы для подтверждения клинического диагноза сифилиса на ранних стадиях инфекции, когда НТТ еще отрицательны, но есть клинические, эпидемиологические или анамнестические подозрения на сифилис. Однако чувствительность при первичном сифилисе этих тестов в совокупности недостаточна (76—86%) в основном за счет РИБТ, которая становится позитивной, начиная со второй половины первичного периода сифилиса.

Ранние стадии сифилиса (начало первичного периода сифилиса, период инкубации) могут быть диагностированы при использовании IgM-тестов, которые выявляют ранние трепонемоспецифические IgM, первыми появляющимися в организме больного сифилисом в ответ на внедрение возбудителя (варианты РИФ-абс IgM, ИФА-IgM, ИХЛ-IgM, IgM-иммуноблоттинга) [15—19].

Трепонемные методы хорошо выявляют вторичный и скрытый сифилис (чувствительность составляет 98—100%) [20].

ТТ могут быть использованы для установления ретроспективного диагноза сифилиса, а также для распознавания ложноположительных результатов НТТ.

С использованием ряда ТТ (ИФА, РПГА, ИХЛ, ПБТ) можно проводить скрининг отдельных категорий населения на сифилис (доноры, беременные, больные офтальмологических, психоневрологических, кардиологических стационаров, ВИЧ-инфицированные).

ТТ не могут быть использованы для контроля эффективности лечения, так как длительно остаются положительными после окончания лечения сифилиса (в особенности РИБТ, РПГА). Они сложнее в техническом отношении, чем НТТ, что несколько ограничивает их применение.

В настоящее время существуют два основных подхода к проведению скрининга и обследования больных на сифилис: первый подход характеризуется началом обследования с назначения НТТ, второй — когда обследование начинается с ТТ.

В соответствии с первым алгоритмом, первичное обследование пациента с подозрением на сифилис проводится с помощью НТТ — РМП или ее модификации (качественная, полуколичественная) (рис. 1). При отрицательном результате НТТ делается вывод о том, что «антитела к возбудителю сифилиса не выявлены». Исследование может быть сделано повторно через 2—3 нед по эпидемическим показаниям (в случае подозрения на заражение сифилисом).

Рис. 1. Традиционный алгоритм серологического скрининга на сифилис (из лекции Фриго Н.В. на цикле усовершенствования врачей, РМАПО, 2012).

При положительном результате НТТ ставится любой подтверждающий ТТ. В случае положительного результата тестирования делается вывод о том, что у пациента «антитела к возбудителю сифилиса выявлены» и имеется сифилис в настоящем или сифилис, перенесенный в прошлом. При отрицательном значении ТТ делается вывод о ложноположительных результатах НТТ.

Контрольное обследование после лечения проводится с помощью РМП или ее модификации в полуколичественном варианте. По снижению ее титра судят об эффективности терапии

Заключительное обследование проводят не ранее чем через 1 год. Ставится та же специфическая реакция, что и при первичном обследовании. Наличие ее положительных результатов не является препятствием для снятия пациента с учета [13].

Приведенный алгоритм получил название «традиционного», в отличие от «реверсионного» алгоритма, активно используемого в настоящее время за рубежом и в России.

Традиционный алгоритм скрининга на сифилис имеет свои преимущества и недостатки. Несомненным преимуществом является то, что он выявляет активную инфекцию. Однако данный алгоритм дает высокий процент ложноположительных результатов, нуждается в подтверждении ТТ и может пропустить ранний первичный сифилис или пролеченную инфекцию.

В отличие от традиционного, реверсионный алгоритм скрининга начинается с использования ТТ (обычно ИФА, например, в США; Европе также используют ИХЛ). Термин «реверсионный» начал использоваться применительно к данному алгоритму в начале XXI века [21—23]. Родоначальниками данного алгоритма стали английские ученые Эгглстоун и Тернер. В несколько упрощенном виде в настоящее время данный алгоритм выглядит следующим образом (рис. 2).

Рис. 2. Реверсионный алгоритм серологического скрининга на сифилис (из лекции Фриго Н.В. на цикле усовершенствования врачей, РМАПО, 2012).

При получении отрицательного результата ТТ (например, ИФА) делается вывод о том, что у человека «антитела к возбудителю сифилиса не выявлены». Повторное исследование с использованием ТТ может быть проведено по эпидемиологическим показаниям (при подозрении на возможность заражения сифилисом) через 2—3 нед.

При положительном результате ТТ следует постановка НТТ с определением титра антител.

Если НТТ дает отрицательный результат, проводится дополнительное тестирование с использованием второго чувствительного и специфичного (подтверждающего) ТТ (например, РПГА).

При отрицательном результате дополнительного подтверждающего теста (РПГА–) делается вывод о том, что человек не болен сифилисом; при этом положительный результат скринингового ТТ (первый) расценивается как ложноположительный.

При положительном результате (РПГА+) делается вывод о том, что у человека имеется сифилис в настоящем или был перенесен в прошлом.

Можно привести ряд аргументов в пользу использования реверсионного алгоритма:

• возможность автоматизации ТТ;

• высокая производительность (до 180 тестов в час);

• отсутствие или сведение до минимума ручных манипуляций (безопасность персонала и высокое качество исследований);

• низкая себестоимость при больших объемах тестирования (поток);

• отсутствие ложнонегативных реакций и феномена прозоны (высокая чувствительность);

• объективные результаты;

• возможность детекции IgM антител — потенциальная возможность диагностики раннего сифилиса.

Главным преимуществом реверсионного алгоритма является то, что он выявляет ранний или пролеченный сифилис, что может быть пропущено при традиционном скрининге. Вместе с тем он также имеет ряд недостатков: реверсионный алгоритм нуждается в постановке НТТ для подтверждения активной инфекции и контроля эффективности терапии, может давать ложноположительные результаты (из-за недостаточно высокой специфичности тестов), не позволяет дифференцировать активную и пролеченную инфекцию (и это его основной недостаток!).

Проблемы возникают чаще всего при наличии положительного результата ТТ и отрицательного результата НТТ. Тактика в этом случае должна быть следующей.

• При несовпадении результатов скринингового ТТ и НТТ (ТТ+, НТТ–) необходима постановка дополнительного подтверждающего ТТ.

• Подтверждающий Т.Т. должен иметь чувствительность не ниже, а специфичность — выше, чем скрининговый ТТ.

• В качестве дополнительного подтверждающего теста в этих случаях может быть рекомендована РПГА (РИФабс не рекомендуется ввиду более низкой аналитической чувствительности в сравнении с другими ТТ) [24].

• Результаты скрининга следует анализировать с учетом клинической картины заболевания и анамнестических данных пациентов (в частности, полноты и качества проведенного специфического лечения по поводу ранее перенесенного сифилиса).

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о том, что в распоряжении дерматовенерологов и врачей других специальностей в настоящее время имеется большой арсенал как прямых, так и непрямых лабораторных методов исследования для диагностики сифилиса. Рациональное использование имеющихся технологий и алгоритмов диагностики позволяет осуществлять эпидемиологический надзор и контроль над распространением сифилиса на территории города Москвы и других субъектов Российской Федерации.

Конфликт интересов отсутствует.

Список литературы:

  1. Потекаев Н.Н., Фриго Н.В., Алмазова А.А., Лебедева Г.А. Эпидемиология сифилиса в современных условиях. Клиническая дерматология и венерология. 2015;1:22-34.
  2. Larsen SA, Steiner BM, Rudolph AH. Laboratory Diagnosis and Interpretation of Tests for Syphilis. Clin Microbiol Rev 1995 Jan;1-21.
  3. Coles AC. Spirochaeta pallida. Methods of examination and detection, especially by means of the dark-ground illumination. Br Med 1909;1:1117-1120.
  4. Kellogg, DSJr, Mothershed SM. Immunofluorescent detection of Treponema pallidum: a review. JAMA 1969;107:938-941.
  5. Mullis KB. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalysed chain reaction. Meth Enzymol. 1987;155:335.
  6. Centurion-Lara A. Detection of Treponema pallidum by a sensitive reverse transcriptase PCR. J Clin Microbiol. 1997;35;6:1348-1352.
  7. Wassermann A, Neisser A, Brück C. Eine serodiagnostische Reaktion bei Syphilis. Dtsch Med Wochenschr. 1906;32:745-746.
  8. Pangborn MC. Cardiolipin and its application in a chemically purified antigen for the serodiagnosis of syphilis. Proc N Y State Assoc Public Health Lab. 1946;26(1):26-29.
  9. Pangborn MC. A study of the composition of cardiolipin. Fed Proc. 1946;5(1 Pt 2):149.
  10. Дмитриев Г.А., Брагина Е.Е. Современные методы лабораторной диагностики сифилиса. Часть I. Вестник дерматологии. 1996;2:29-33.
  11. Дмитриев Г.А., Брагина Е.Е. Современные методы лабораторной диагностики сифилиса. Часть II. Вестник дерматологии. 1996;3:33-38.
  12. Неспецифические положительные результаты серологических реакций на сифилис. Количественные модификации современных серологических реакций. Методические рекомендации. М. 1990.
  13. Приказ МЗ №87 РФ от 26 марта 2001 г. «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса».
  14. Российское общество дерматовенерологов. Федеральные клинические рекомендации по ведению больных сифилисом. М. 2013.
  15. Ляхов В.Ф., Борисенко К.К., Потекаев Н.С., и др. Динамика трепонемоспецифической иммуноглобулинемии при ранних формах сифилиса. Вестник дерматологии. 1990;8:38-42.
  16. Киселева Г.А., Ткачев В.К., Беднова В.Н., и др. Сравнительное из­учение чувствительности и специфичности трех иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления иммуноглобулинов класса М к возбудителю сифилиса. Вестник дерматологии. 2000;4:6-10.
  17. Эрматова Ф.А. Определение специфических иммуноглобулинов класса М для ранней диагностики сифилиса (клинико-лабораторное исследование): Дис . … канд. мед. наук. М. 2014.
  18. Марданлы С.Г., Арсеньева В.А., Анискова И.Н., Жигаленко А.Р. Оте­чественная тест-система «Лайн-Блот Сифилис-IgM» для определения IgM-антител к Treponema pallidum методом линейного иммуноблоттинга Клиническая дерматология и венерология. 2013;5:35-38.
  19. Гусева С.Н. Использование теста IgM-РИФабс в обследовании беременных на активность сифилитической инфекции. Российкий журнал кожных и венерических болезней. 2004;6:60-63.
  20. Овчинников Н.М., Беднова В.Н., Делекторский В.В. Лабораторная диагностика заболеваний, передающихся половым путем. М. 1987.
  21. Lee K, Park H, Roh EY, Shin S, Park KU, Park MH, Song EY. Characterization of sera with discordant results from reverse sequence screening for syphilis. Biomed Res Int. 2013;2013:269-347.
  22. Binnicker MJ. Which algorithm should be used to screen for syphilis? Curr Opin Infect Dis. 2012 Feb;25(1):79-85.
  23. Castro A, Jost H, Cox D, Fakile Y, Kikkert S, Tun Y, Zaidi A, Park M. A comparison of the analytical level of agreement of nine treponemal assays for syphilis and possible implications for screening algorithm. BMJ Open. 2013 Sep 19;3(9).
  24. Park IU, Chow JM, Bolan G, Stanley M, Shieh J, Schapiro JM. Screening for syphilis with the treponemal immunoassay: analysis of discordant serology results and implications for clinical management. J Infect Dis. 2011 Nov;204(9):1297-1304.