Роль полиморфного варианта гена фактора некроза опухоли-α в развитии атопического дерматита в популяции Узбекистана

Атопический дерматит (АтД) — одна из актуальных проблем современной медицины. Широкое распространение этого дерматоза среди различных возрастных групп населения, хроническое течение, увеличение рецидивирующих и осложненных форм заболевания ставят АтД в один ряд с другими глобальными медико-социальными проблемами [1—5].

Анализ литературы [2, 6—12] показывает, что причинами широкой распространенности аллергических заболеваний, в том числе и АтД, могут быть климатические особенности региона и этнические особенности генофонда населения, в частности по генам подверженности заболеванию. Результаты исследований зарубежных и отечественных ученых показали, что в развитии различных мультифакториальных заболеваний, таких как аллергические (ринит, бронхиальная астма, АтД), ассоциированы некоторые полиморфные варианты генов RANTES, TNF-α, GSTT1, GSTM1,CTLA4 [1, 4, 6, 8—10, 13—15].

В последние годы был проведен ряд исследований, посвященных изучению ассоциативной связи полиморфизма 308G/A гена фактора некроза опухоли-α TNF-α с развитием атопии в различных популяциях. Проведенные метаанализы показывают наличие межэтнических различий: в некоторых популяциях установлена связь по данному маркеру с развитием заболевания, хотя в других исследованиях ассоциации не установлено [11—16].

Таким образом, полученные на сегодняшний день результаты исследования ассоциации полиморфизма 308G/A гена TNF-α с атопией противоречивы и не позволяют точно определить степень его значимости в формировании АтД.

Цель работы — оценить патогенетическую значимость генотипических вариантов полиморфизма 308G>A гена TNF-α (rs1800629) в формировании АтД у больных, проживающих в Узбекистане.

Объектом и предметом исследования стали больные АтД, образцы ДНК больных и здоровых доноров, ген TNF-α(6р21.3), нуклеотидная замена G>A в позиции –308.

В исследование были включены 30 пациентов (19 женщин и 11 мужчин) с АтД в возрасте от 4 до 50 лет, наблюдавшихся на базе клиники Республиканского специализированного научно-практического медицинского центра дерматологии и венерологии Минздрава Республики Узбекистан. Диагноз у всех больных подтвержден результатами клинического обследования и лабораторными исследованиями.

Молекулярно-генетическое обследование биоматериалов (ДНК) выполняли на базе отдела молекулярной медицины и клеточных технологий НИИ гематологии и переливания крови Минздрава Республики Узбекистан.

При проведении генетических исследований в качестве контрольной группы использовали образцы ДНК (n=35) условно здоровых доноров (без каких-либо признаков атопических заболеваний) из банка ДНК данного отдела.

Образцы ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови в соответствии с модифицированной методикой. Концентрацию и чистоту выделенной ДНК оценивали при измерении оптической плотности ДНК-содержащих растворов при длине волны 260 и 280 нм против ТЕ на спектрофотометре NanoDrop 2000 (США). Генотипирование полиморфизма 308G>A гена TNF-α осуществляли путем стандартной полимеразной цепной реакции (ПЦР) на программируемых термоциклерах СG-1−96 Corbett Research (Австралия) и 2720 Applied Biosystems (США) с использованием тест-систем MedLab (Россия), согласно инструкции производителя. Олигонуклеотидные праймеры, необходимые для проведения ПЦР этих фрагментов, подобраны с использованием программы Oligo v.6.31 («Molecular Biology Insights Inc.», США). Структура олигонуклеотидных праймеров представлена ниже:

F: 5’-AATAGGTTTTGAGGGCCATG-3’

R: 5’-ATCTGGAGGAAGCGGTAGTG-3’

Статистическая обработка. Оценку отклонения распределений генотипов изученных полиморфизмов ДНК от канонического распределения Харди—Вайнберга (РХВ) проводили с помощью компьютерной программы анализа генетических данных GenePop (Genetics of Population). Частоту вариантов аллелей и генотипов (f) вычисляли по формуле: f = n/2N иf = n/N,где n — встречаемость варианта (аллель или генотип), N — объем выборки.

Оценку частоты аллелей рассчитывали по формуле: p=(2N|+N2)/2N,q=(2N3+N2)/2N,где р — частота аллеля A, q — частота аллеля а, N — общий объем выборки N=N|+N2+N3 (N|, N2, N3 — численности особей с генотипами АА, Аа и аа соответственно).

Для расчета коэффициента отношения шансов (ОШ) с 95% доверительным интервалом (ДИ), χ² и р-значения использовали пакет статистических программ OpenEpi 2009, Version 2.3.

Относительное отклонение ожидаемой гетерозиготности от наблюдаемой (D) рассчитывали по формуле: D=(hobs—hexp)/hexp,где hobsи hexp — ожидаемая и наблюдаемая гетерозиготность соответственно.

Прогностическая эффективность (AUC-классификатор) изученных нами генетических маркеров определялась стандартной формулой: AUC =(Se+ Sp)/2, где Se и Sp — чувствительность и специфичность генетического маркера соответственно. Если показатель AUC<0.5, то маркер — случайный классификатор; AUC=0,5—0,6 — плохой; AUC=0,6—0,7 — средний; AUC=0,7—0,8 — хороший; AUC>0,8 — отличный классификатор (D. Hosmer, S. Lemeshow и соавт., 2000 г.).

Результаты исследования показали, что в обеих группах наблюдалось преобладание частоты дикого (нормального) аллеля G с одновременным снижением частоты встречаемости функционально неполноценного аллеля А. Распространенность аллелей полиморфизма 308G>A гена TNF-a (rs1800629) в популяционной выборке составила: А — 4,3% (3/70), G – 95,7% (67/70); в группе больных: А — 31,7% (19/60), G — 68,3% (41/60). В распределении генотипов среди обследуемых группы больных наблюдалось увеличение доли гетерозиготного генотипа А/G за счет уменьшения содержания гомозиготного генотипа G/G (63,3% против 36,7%) (см. таблицу). Частота распределения G/G и А/G генотипов в контрольной группе составила 91,4 и 8,6% соответственно. Интересно отметить, что полиморфизм 308G>A гена TNF-α в А/А гомозиготном состоянии ни в группе больных, ни в группе контроля выявлен не был.

Анализ распределения частот генотипов полиморфизма rs1800629 и их соответствие популяционному равновесию РХВ проводили раздельно.

Изучение популяционно-генетической характеристики исследуемого генетического маркера показало, что в группе больных уровень наблюдаемой гетерозиготности (H0=0,63) превышал теоретически ожидаемое значение (Hе=0,43), также обнаружены статистически значимые отклонения частот генотипов от РХВ (χ²=6,4; р=0,011), что может быть связано с предрасположенностью к заболеванию или особенностью генораспределения (гетерогенность) в выборке (D. Nielsen, 1999; J. Feder, 2006).

Как известно, помимо генетической гетерогенности обследованной выборки, возможной причиной отклонения от РХВ может стать методическая ошибка тестирования и детекции данного полиморфизма. По поводу возможной ошибки тестирования необходимо отметить, что во всех случаях с целью ее исключения мы повторяли амплификацию и детекцию ложноположительных результатов (см. рисунок).

В популяционной выборке, как и следовало ожидать, обнаружены статистически недостоверные отклонения частот генотипов от равновесия Харди—Вайнберга (χ²=0,7; р=0,8). Уровень ожидаемой и наблюдаемой гетерозиготности среди больных варьировал от Hе=0,8 до H0=0,86 соответственно.

Как среди образцов, полученных от больных, так и материалов контрольной выборки наблюдаемую гетерозиготность превышает ожидаемая гетерозиготность, о чем свидетельствует и отрицательное значение индекса фиксации Райта (–0,37 и –0,07 соответственно).

Показатели SE и SP данного генетического маркера среди исследованных групп соответствовали 0,63 и 0,91. Вычисленная прогностическая эффективность данного маркера составила AUC=0,77. Эти данные демонстрируют очень хороший уровень показателя по классификатору полиморфизма rs1800629, следовательно, предварительно можно сделать вывод, что генетическая мутация 308G>A является высокоэффективным классификатором для прогнозирования развития АтД и даже может выступать в качестве самостоятельного прогностического маркера.

Для оценки вклада генетического маркера 308G>A гена TNF-α в патогенез АД провели сравнительный анализ частот встречаемости аллелей и генотипов в группе больных АтД и группе здоровых лиц.

Анализ распределения аллелей полиморфного варианта 308G>A гена TNF-α показал, что частоты распределения аллелей в группе больных статистически значимо отличаются от таковых в контрольной группе (см. таблицу). Частота встречаемости мутантного, А и дикого G аллелей в основной и контрольной группах составила 31,7% против 68,3% и 4,3% против 95,7%. Согласно рассчитанному коэффициенту ОШ, носительство функционального неблагоприятного аллеля, А полиморфизма 308G>A гена TNF-α в 10,3 раза достоверно увеличивает риск развития АтД (χ²=17,23; р=0,00003;OШ=10,3; 95% ДИ 1. 2.883, 37.15).

Аналогичная закономерность выявлена и при генотипировании полиморфизма 308G>A гена TNF-α между группой больных и контрольной выборкой. Распределение частот генотипов в группе больных не приблизилось к показателям контрольной группы.

В выборке больных отмечено статистически достоверное увеличение частоты функционально неблагоприятного гетерозиготного генотипа 308*А/G, на долю которого приходилось 63,3% по сравнению с контрольной группой, где частота данного генотипа достигала лишь 8,6%. Согласно коэффициенту ОШ, риск развития АтД в основной группе при наличии данного генотипа достоверно увеличивается в 18,4 раза (χ²=21,64; р<0,05;OШ=18,4; 95% ДИ 4,557—74,49).

Гомозиготный генотип –308G/G достоверно чаще встречался в популяционной выборке (91,4%), тогда как в группе больных АтД частота его составила 36,7% (χ²=21,64, р<0,05). Эти данные доказывают, что данный генотип является генетическим фактором относительной устойчивости к развитию заболевания (OШ=0,054, 95% ДИ 0,01342—0,2194).

Полученные нами результаты анализа 308G>A полиморфизма гена TNF-α позволяют сделать первые выводы о генетических основах формирования АтД. При наличии гетерозиготного генотипа 308А/G (возможно и генотипа 308А/А) риск развития болезни возрастает, т. е. данный полиморфизм является генетическим маркером повышенного риска АтД, тогда как генотип G/G способен выполнять протективную функцию. Полученные данные могут быть использованы при прогнозировании развития АтД и разработке персонализированного подхода к лечению данного заболевания.