Введение
Образование спаек после проведения внутриполостных операций является серьезной проблемой, которая снижает качество жизни пациентов и несет в себе высокий риск повторных операций. Спайки обнаруживаются в 93% случаев после открытых операций на брюшной полости [1], также спаечный процесс является одним из наиболее частых осложнений после проведения лапароскопических операций [2]. Спаечный процесс, возникающий после хирургической коррекции аневризмы аорты, приводит к таким серьезным последствиям, как обструкция кишечника, сдавление крупных сосудов, удлинение времени операции [3, 4, 5]. Согласно данным литературы, уровень смертности от разрыва брюшного отдела аорты составляет 65% у мужчин и 31% у женщин в возрасте 65 лет и старше [6]. Примерно в 60% случаев спаечный процесс усложняет повторный доступ, приводя к интраоперационному кровотечению и травматизации органов брюшной полости [7, 8], при этом частота повторных операций после реконструкции аневризмы брюшного отдела аорты составляет около 10% [3].
Для ушивания брюшной стенки, наложения сосудистых анастомозов применяют хирургический шовный материал, который как инородное тело усиливает воспалительную реакцию на травму [9]. Воспалительная реакция, возникающая в результате хирургического вмешательства, и местная реакция тканей на внедрение чужеродного материала в виде шовных нитей тесно переплетаются между собой и провоцируют процесс образования спаек. В результате хирургической травмы происходит повышение сосудистой проницаемости, экссудация фибриногена и перитонеальной жидкости, набухание мезотелиальных клеток и отделение их от основной мембраны [10, 11]. После расщепления фибриногена до фибрина образуется фибриновый слой [10]. При физиологических условиях эндогенная фибринолитическая активность мезотелиальных клеток разрушает отложения фибрина, однако после травмы брюшной стенки мезотелиальные клетки повреждаются, что приводит к уменьшению их фибринолитической способности и, как следствие, накоплению фибрина [12]. Далее в зону фибринозного экссудата и шовного материала происходит миграция нейтрофилов, Т-лимфоцитов, макрофагов и фибробластов [13], которые выделяют большое количество цитокинов и факторов роста (интерлейкины-1, 2, 6, 8, TNF-α, интерферон-γ). Цитокины стимулируют внедрение в матрицу фибрина мезотелиальных клеток и фибробластов, фибробласты синтезируют коллаген, который и завершает формирование спаек, не способных к фибринолизу [14, 15].
Для снижения негативного влияния хирургического шовного материала на воспалительную реакцию и процесс образования спаек нами разработана методика антитромботической и антипролиферативной модификации хирургической нити [16]. В связи с чем целью настоящего исследования явиляется экспериментальная оценка влияния модифицированного и немодифицированного хирургического шовного материала на процесс формирования спаек в брюшной полости.
Материал и методы
Экспериментальные животные
Исследования in vivo проводили на крысах-самцах субпопуляции Wistar, по 5 животных в каждой группе. Все хирургические манипуляции лабораторным животным проводили под ингаляционным наркозом изофлюраном в условиях чистой операционной согласно Межгосударственному стандарту, Руководству по содержанию и уходу за лабораторными животными, с соблюдением Правил содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами ГОСТ 33216–2014, а также с соблюдением правил оборудования помещений и организации процедур ГОСТ 33215–2014.
Экспериментальная модель
В стерильных условиях экспериментальным животным был выполнен разрез по средней линии живота, после чего левую париетальную сторону брюшины прошивали модифицированным и немодифицированным шовным материалом. Модифицированный шовный материал на основе полипропилена PROLENE 3,0 (Ethicon, США) был покрыт слоем полигидроксибутирата/оксивалерата, синтезированного в ИБФМ РАН (г. Пущино, Московская область) и слоем нефракционированного гепарина («Белмедпрепараты», Беларусь). Далее всем животным послойно ушивали брюшную стенку не рассасывающимся полиэфирным шовным материалом Лавсан 4,0 («Линтекс», Россия). Срок имплантации шовного материала составил 14 суток. С целью исключения влияния травмы на процесс образования спаек группе животных травмировали брюшную стенку (скарификатором до появления крови) без имплантации шовного материала.
По окончании срока эксперимента все животные были подвергнуты эвтаназии парами углекислого газа. Далее была проведена визуальная оценка спаечного процесса в брюшной полости, а затем забирали комплексы «брюшина-шовный материал-спайка» для последующей микроскопической оценки интенсивности спаечного процесса. Удаленные комплексы «брюшина-шовный материал-спайка» помещали в раствор параформальдегида 4%, приготовленного на 0,1 М фосфатном буфере.
Макроскопическое описание эксплантированных образцов
Выраженность спаечного процесса определяли по оценочной шкале от 0 до 4 баллов [1, 17, 18]. Оценочная шкала включает такие критерии, как строение спаек, количество сращений, а также их распространенность по площади (таблица).
Затем все баллы суммировали, и после подсчета соответственно указанным критериям выраженность спаечного процесса была разделена на 3 степени: первая степень характеризуется незначительным спаечным процессом (от 1 до 4 баллов); второй степени соответствуют умеренные спайки (от 5 до 8 баллов); третья степень характеризуется выраженным адгезивным процессом (выше 8 баллов). Фотосъемку эксплантированных образцов проводили с помощью цифровой камеры Canon G5 (Canon, Япония).
Гистологическое исследование эксплантированных образцов
Для гистологического исследования извлеченные образцы готовили двумя способами: изготовление парафиновых срезов и заключение в эпоксидную смолу. В первом случае образцы окрашивали по методу Ван Гизона, который дает возможность дифференцировать волокна внеклеточного матрикса, а также клетки по морфологическим признакам, окрашивая ядра клеток в черный цвет, коллаген в ярко-красный цвет, а другие тканевые элементы (мышечные волокна, фибрин) в желтый. Второй способ приготовления основан на заключении исследуемых образцов в эпоксидные смолы с окраской материала раствором метиленового синего. При окраске образцов метиленовым синим ядра клеток приобретают сине-фиолетовый цвет, цитоплазма — голубой, коллагеновые волокна окрашиваются в ярко-красный цвет, эластин приобретает синий цвет. Метод фиксирования образцов в эпоксидные смолы позволяет решить проблему различной плотности исследуемых материалов [19], таких как хирургическая нить и ткани брюшины со спайками. Исследование гистологических препаратов проводили при помощи светового микроскопа Axio Imager A1 (Zeiss, Германия).
Статистический анализ
Статистическую обработку полученных данных проводили при помощи программы STATISTICA 6.0 (StatSoft, Inc., США). Характер распределения в выборках оценивали при помощи критерия Колмогорова—Смирнова. Полученные результаты представлены в виде медианы (М), min, max и квартилей (25% и 75%). Статистическую значимость различий между двумя независимыми группами оценивали с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Достоверными считали различия при уровне значимости р<0,05.
Результаты
Макроскопическое описание эксплантированных образцов
Визуальная оценка зоны имплантации шовного материала на внутренней поверхности брюшной стенки выявила существенную разницу между модифицированным и немодифицированным шовным материалом. После прошивания брюшины немодифицированной нитью образовались массивные спайки с признаками выраженной васкуляризации (рис. 1а).
При исследовании зоны брюшины, прошитой модифицированной нитью, был обнаружен спаечный процесс с менее выраженной картиной. Спайки имели рыхлую структуру, без признаков васкуляризации (рис. 1б). Спаечные тяжи легко удалялись без применения скальпеля. Согласно оценочной шкале выраженность спаечного процесса на модифицированный шовный материал не превышала II степени во всей исследуемой группе.
При осмотре брюшной полости после предварительного повреждения брюшной стенки (скарификации) без имплантации шовного материала спаечный процесс отсутствовал во всей исследуемой группе (рис. 1в).
При оценке выраженности спаечного процесса при помощи балльной шкалы были получены следующие результаты: спаечный процесс в брюшной полости без шовного материала составил 0 баллов (min — 0; max — 0; 25% — 0; 75% — 0). Спайки, сформированные после прошивания брюшной стенки модифицированной нитью, были равны 6 баллам (min — 5; max — 8; 25% — 5; 75% — 6). Наиболее высокие показатели были получены при оценке спаечного процесса после имплантации немодифицированного шовного материала, они составили 10 баллов (min — 9; max — 12; 25% — 9; 75% — 12). При сравнении спаечного процесса, спровоцированного модифицированным и немодифицированным шовным материалом, были получены достоверные различия (р<0,05). Также спаечный процесс был достоверно выше (р<0,05) в группах модифицированного и немодифицированного шовного материала по сравнению с контрольной группой без шовного материала (скарификация).
Гистологическое исследование эксплантированных образцов
Дальнейшее гистологическое исследование проводили только в группах с немодифицированным и модифицированным шовным материалом, поскольку в контрольной группе (без шовного материала) спаечный процесс отсутствовал. Гистологическое изучение комплексов «брюшина-шовный материал-спайка» показало отличия между спайками, образованными на модифицированный и немодифицированный шовный материал. При окраске препаратов по Ван-Гизону и метиленовым синим, в образцах с немодифицированным шовным материалом, было обнаружено большое количество воспалительных клеток. Коллагеновые волокна были фрагментированы (рис. 2а
Тканевая реакция на внедрение шовного материала имела некоторое сходство между модифицированным и немодифицированным шовным материалом, так как в обоих случаях присутствовала воспалительная реакция и было отмечено образование соединительнотканной капсулы вокруг нити (рис. 2а, в). Тем не менее при использовании немодифицированного шовного материала капсула была более рыхлой, состоящей из нескольких слоев плотно прилегающих друг к другу клеток, окруженных «рыхлым» слоем, содержащим воспалительные клетки и граничащим с плотной соединительной тканью (рис 2а, б). В образцах, прошитых модифицированным шовным материалом, слой клеток был значительно плотнее и содержал хорошо сформировавшиеся коллагеновые волокна. Слой рыхлой ткани был менее выраженным (рис. 2 В, г).
Гистологическое исследование структуры спайки
При гистологическом исследовании структуры спайки, образованной в результате имплантации немодифицированного шовного материала, было обнаружено большое количество сосудов, которые образовывали хорошо сформированную сосудистую сеть (рис. 3а).
Обсуждение
Спаечный процесс в брюшной полости представляет серьезную проблему как для пациентов, так и для хирургов. Проблеме послеоперационных спаек посвящено большое количество работ [1, 15, 17], при этом имеются отдельные исследования, подтверждающие влияние шовного материала на спайкообразование [20].
Проведенное нами исследование подтвердило влияние шовного материала на спаечный процесс в брюшной полости. При макроскопическом осмотре через две недели после имплантации немодифицированного шовного материала были обнаружены массивные спайки с ярко выраженными признаками васкуляризации, что свидетельствует о необратимом процессе спайкообразования [17]. Немодифицированный шовный материал на основе полипропилена значительно увеличил выраженность воспалительной реакции, а следовательно, и выраженность спаечного процесса. Это обусловлено тем, что именно воспалительная реакция является пусковым звеном спайкообразования [21, 22]. Результаты гистологического исследования подтвердили выраженность воспалительной реакции на полипропиленовую нить, о чем свидетельствует наличие в эксплантированных образцах нейтрофилов, которые в большем количестве присутствуют в перилигатурной зоне и первыми реагируют на инородное тело [13]. Наличие фрагментированных коллагеновых волокон также свидетельствует о наличии воспалительного процесса. Возможной причиной разрушения коллагенового волокона могло стать воздействие коллагеназы, синтезируемой воспалительными клетками, обнаруженными на гистологических препаратах с немодифицированным шовным материалом. Фрагментация коллагенового волокна опасна тем, что разрушенное волокно не может полноценно выполнять свои биологические и механические функции за счет своего патологического расположения [23].
Модификация хирургического шовного материала раствором полигидроксибутирата/оксивалерата и гепарина позволила уменьшить выраженность воспалительной реакции и спайкообразования. Спаечный процесс, индуцированный имплантацией модифицированного шовного материала, был менее выраженным. Спайки не имели признаков васкуляризации и захватывали незначительную площадь брюшной полости, которая не превышала 25%. Возможно, это обусловлено тем, что полигидроксибутират/оксивалерат, находящийся в составе покрытия, повысил биосовместимые свойства полипропиленовой нити. Столь высокие биосовместимые свойства полигидроксибутирата/оксивалерата объясняются тем, что составляющие его компоненты физиологически присутствуют в организме человека [24]. Нанесенный слой гепарина также повлиял на выраженность спаечного процесса, так как гепарин помимо антикоагулянтных свойств также обладает противовоспалительными и антипролиферативными свойствами [25]. Антипролиферативная активность гепарина подтверждается некоторыми литературными данными, в которых гепарин использовали в виде аэрозолей, покрывая полипропиленовые сетки, имплантируемые в брюшную полость крыс [26, 27]. Антипролиферативное действие гепарина возможно за счет его ингибирующего воздействия на матриксные металлопротеиназы, включая коллагеназы, вырабатываемые клетками воспаления [28, 29], которые способны оказывать разрушающее воздействие на коллагеновые волокна ткани.
Гистологическая оценка спаек, сформированных после имплантации модифицированного шовного материала, подтвердила антипролиферативную активность гепарина. Спайки, образованные на шовный материал с гепарином, не имели признаков васкуляризации. Это обусловлено тем, что гепарин способен снижать пролиферацию клеток гладкомышечной ткани сосуда, препятствуя формированию сосудистой сети в спайке [30]. Следовательно, применение гепарина для антипролиферативной модификации хирургического шовного материала с целью профилактики послеоперационного спаечного процесса в брюшной полости является перспективным.
Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что немодифицированный шовный материал на основе полипропилена способен усиливать воспалительную реакцию и, как следствие, спайкообразование. Модификация нити раствором полигидроксибутирата/оксивалерата и гепарина уменьшает воспалительную реакцию на шовный материал, а также снижает выраженность спаечного процесса. Возможно, в будущем модификация хирургического шовного материала раствором биополимера и гепарина позволит внести свой вклад в профилактику послеоперационных спаек.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflict of interest.
Сведения об авторах
Акентьева Т.Н. — https://orcid.org/0000-0002-0033-9376
Мухамадияров Р.А. — https://orcid.org/0000-0002-5558-3229
Кривкина Е.О. — https://orcid.org/0000-0002-2500-2147
Лузгарев С.В. — https://orcid.org/0000-0002-7259-9089
Кудрявцева Ю.А. — https://orcid.org/0000-0002-6134-7468
Автор, ответственный за переписку: Акентьева Т.Н. — e-mail: akentyeva@mail.ru