В настоящее время эндоскопические вмешательства являются операциями выбора в лечении заболеваний органов брюшной полости. Среди них наибольшее распространение получила лапароскопическая холецистэктомия (ЛХЭ) [10, 11, 15], которая, несмотря на все положительные аспекты, имеет и недостатки. В мире ежегодно выполняется более 2,5 млн лапароскопических операций на желчном пузыре и желчевыводящих протоках, что существенно увеличивает число ятрогенных осложнений, одним из которых является желчный перитонит (ЖП) [9]. Так, при ЛХЭ количество осложнений встречается в 1,5 раза чаще, чем при классической холецистэктомии [4], а частота ЖП достигает 0,5% [18], из которых в 12,2% наблюдений он заканчивается летальным исходом [2]. Проблема ЖП становится особенно актуальной на фоне мировой тенденции роста числа больных, страдающих желчнокаменной болезнью (ЖКБ) [13]. В то же время широкое внедрение ЛХЭ нисколько не приблизило решение проблемы, так как число наблюдений ЖКБ продолжает быстро расти [8], что существенно влияет на увеличение частоты ятрогенного ЖП.

Современное лечение перитонита включает радикальное устранение причины заболевания, санацию и дренирование брюшной полости, однако одной из причин накапливающегося неудовлетворения полученными результатами считают развивающийся синдром эндогенной интоксикации, на фоне которого в организме происходят метаболические и функциональные расстройства практически всех органов и тканей. Одновременно стали появляться статьи, в которых ставится вопрос, почему в течение первых 5 лет после перенесенного в молодом возрасте перитонита у 35% пациентов внезапно возникают различные сердечно-сосудистые заболевания, от осложнений которых 65% пациентов умирают в течение 10 лет [23]. Сегодня можно твердо заявить, что причиной дисметаболических процессов является эндотелиальная дисфункция (ЭД), сопровождающаяся дисбалансом медиаторов, обеспечивающих оптимальное течение всех эндотелийзависимых процессов [14, 27].

Согласно современным взглядам, главной причиной эндогенной интоксикации при перитоните является кишечная недостаточность, на фоне которой наблюдаются изменение количества и качества внутрипросветной микрофлоры, транслокация токсинов и микроорганизмов в кровоток и в просвет брюшной полости [22]. Поэтому одним из эффективных методов лечения перитонита служит кишечный диализ [19], который направлен на снижение внутрипросветного давления, санацию и удаление токсичных продуктов [3]. В этом отношении включение натрия гипохлорита (НГХ) в комплексную терапию ЖП представляет большой интерес.

Цель исследования - повысить эффективность лечения эндотелиальной дисфункции при экспериментальном желчном перитоните.

Эксперименты выполнены на 50 беспородных собаках-самцах массой 14,7±1,2 кг. В 1-ю (интактную) группу для определения лабораторных показателей нормы включено 50 собак, из которых 5 выводили из опыта для забора биоптатов; во 2-ю (контрольную) группу вошло 45 оставшихся животных, у которых создавали модель 24-часового ЖП [20]. Суть модели заключалась в том, что предварительно на наружной поверхности заднего бедра собаки создавали очаг деструкции мягких тканей путем подкожного введения 10% раствора CaCl2 из расчета 0,25 мл/кг. Через 48 ч после создания очага деструкции в брюшную полость троекратно вводили аптечную желчь через каждые 8 ч из расчета 1,5 мл/кг. Летальность фиксировали через каждые 12 ч после создания модели - «трехдневный критерий летальности» [5]. Во 2-й группе после создания модели 24-часового ЖП из опыта выводили еще 5 собак для забора биоптатов. 40 оставшихся животных с 24-часовым ЖП с соблюдением принципа рандомизации [7] и в соответствии с поставленными задачами были разделены на 3-ю группу (сравнения) и 4-ю (опытную) группу, в которые входило по 20 животных.

Комплексное лечение животных с ЖП проводили по следующей схеме: выполняли лапаротомию и интраоперационную санацию брюшной полости раствором фурацилина. Далее в брюшную полость заливали 250 мл 0,04% раствора НГХ в качестве антимикробного средства и ушивали края раны. Сразу после санации животным 3-й и 4-й групп проводили однократно кишечный диализ с использованием двухпросветного назоинтестинального зонда. При этом животным 3-й группы кишечный диализ выполняли с применением сбалансированного по химусу солевого корригирующего раствора [21], в то время как животным 4-й группы кишечный диализ проводили с использованием 0,06% раствора НГХ. Лечебный эффект в обоих случаях достигался за счет активной аспирации и дезинтоксикации содержимого начальных отделов тонкой кишки, создания благоприятных условий для нормального функционирования слизистой и сохранения ее структурной целостности. Одновременно животным 3-й группы проводили внутривенную инфузию 0,9% раствора NaCl в качестве средства дезинтоксикации, а животным 4-й группы - внутривенную инфузию 0,04% раствора НГХ в качестве средства окислительной детоксикации. Манипуляцию повторили через 12 ч после санации брюшной полости. Объем вводимых растворов составлял ¹/10 ОЦК [24]. НГХ получали путем электролиза 0,9% раствора NaCl в аппарате ЭДО-4 (Москва). Концентрацию раствора НГХ определяли методом йодометрического титрования.

В работе определяли лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ) [16]; концентрацию эндотелина-1 (Et-1) и фактор Виллебранда (vWF) в плазме крови методом иммуноферментного анализа (ИФА) на анализаторе StatFax с набором реактивов «Biomedica Group» и «Axis» (США) соответственно; уровень метаболитов оксида азота (NO) [12]; количество циркулирующих эндотелиальных клеток [26] и содержание десквамированных эндотелиоцитов (ДЭ), которые считали в двух сетках камеры Горяева методом фазово-контрастной микроскопии, а результат умножали на 10⁴/л. Для оценки состояния местных защитных реакций изучали цитокины плазмы крови (IL-4, IL-8, INF) методом твердофазного ИФА [17] и лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию (ЛТА) [6]. Исследования проводили до, после создания модели 24-часового ЖП, на 1, 3, 7 и 10-е сутки. Все эксперименты выполняли с соблюдением требований XI Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (1964), в соответствии с Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (1985) и Правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ №267 от 19.06.03).

Материалы исследований обрабатывали с помощью пакета прикладных программ Microsoft Excel и Statistica 6,0 для Windows. Для оценки достоверности межгрупповых различий применяли непараметрический критерий Манна-Уитни, а для изучения взаимосвязей между показателями - метод корреляционного анализа по Спирмену. Полученные результаты представляли в виде среднего арифметического значения и стандартной ошибки среднего М±m. Для всех проведенных анализов различия считали достоверными при двустороннем уровне значимости р<0,05.

Информативным и широко используемым критерием оценки степени эндотоксикоза является ЛИИ. При исследовании данного показателя у животных с 24-часовым ЖП наблюдался достоверный рост его уровня до 21,0±2,9 усл.ед. против 3,5±0,4 усл.ед. у животных интактной группы (p<0,05), что является отражением развития эндогенной интоксикации и недостаточности иммунитета. Комплексная терапия животных с ЖП в исследуемых группах сопровождалась общей достоверной тенденцией снижения показателей ЛИИ (p<0,05) и ее нормализацией на 7-е сутки (p>0,05) с одной лишь разницей, что детоксицирующий эффект был более выраженным в 4-й группе.

В связи с тем, что причиной ЭД является эндогенная интоксикация, возникла необходимость оценки степени выраженности цитокининовой активности.

У животных с 24-часовым ЖП обнаружено достоверное повышение уровня IL-8 до 86,4±8,9 пкг/мл против 30±2,8 пкг/мл у интактных животных (p<0,001), INF до 63,8±6,2 пкг/мл против 22,7±6,0 пкг/мл (р<0,05) и несущественное увеличение концентрации IL-4 до 44,1±4,7 пкг/мл против 34,3±2,5 пкг/мл (р>0,05) соответственно. Полученные результаты свидетельствуют, что в процессе развития ЖП наблюдается гиперцитокинемия за счет как провоспалительных (IL-8), так и противовоспалительных (IL-4) цитокинов, которая направлена на реализацию их длиннодистантных эффектов с целью обеспечения связи между различными органами и системами. В процессе проводимого лечения в 3-й группе начиная с 1-х суток отмечалось достоверное снижение уровня IL-8 до 61,0±5,1 пкг/мл против 86,4±8,9 пкг/мл у животных с 24-часовым ЖП (р<0,05), в то время как у животных 4-й группы данный показатель, напротив, повышался до 91,0±6,3 пкг/мл и был достоверно значим по сравнению с таковым у животных с 24-часовым ЖП (р<0,05). В последующие сроки как в 3-й, так и в 4-й группах показатели IL-8 снижались, но по-прежнему превышали исходные (р<0,05) и только к 7-м суткам приходили к исходным значениям (р>0,05). Аналогичную картину мы наблюдали при комплексном лечении животных с ЖП в 3-й и 4-й группах со стороны показателя INF с той лишь разницей, что на 1-е и 3-и сутки уровень INF был достоверно выше исходных величин (р<0,05) соответственно в группе сравнения в 2,4 и в 1,5 раза, в опытной группе в 3 и в 2,1 раза. На фоне проводимого лечения изменение показателей IL-4 в исследуемых группах имело различную динамику. Так, в группе сравнения отмечалось некоторое снижение IL-4 до 40,3±4,1 пкг/мл против 44,1±4,7 пкг/мл у животных с 24-часовым ЖП, в опытной группе, наоборот, наблюдалось повышение его уровня до 47,5±6,2 пкг/мл. В обоих случаях эти изменения были недостоверными (р>0,05). К 3-м суткам показатели IL-4 в исследуемых группах уже не отличались от исходных (р>0,05). Полученные результаты могут свидетельствовать о разнонаправленности действия комплексного лечения ЖП на цитокининовую активность в исследуемых группах. Подобный эффект в опытной группе можно объяснить стимулирующим действием НГХ на синтез цитокинов, который направлен на сохранение единства в реализации взаимосвязей между различными органами и системами.

Согласно данным М.М. Абакумова и соавт. [1], мишенью флогогенных цитокинов в крови является эндотелий [28]. Исследование маркеров ЭД у животных с 24-часовым ЖП позволило выявить рост количества ДЭ в крови до (10,4±0,7)·10⁴/л против (3,2±0,2)·10⁴/л в интактной группе (р<0,001), уровня Et-1 до 482,0±83,0 пмоль/л против 311,0±60,0 пмоль/л (р<0,05) и vWF до 1,84±0,1 МЕ/мл против 1,39±0,09 МЕ/мл (р<0,05) соответственно, что указывает на развитие метаболических и функциональных расстройств. При проведении корреляционного анализа у животных с ЖП установлено наличие достоверной прямой корреляционной связи между количеством ДЭ, уровнем Et-1 и концентрацией vWF. Эти данные подтверждают наличие ЭД у животных с ЖП на фоне эндогенной интоксикации.

В ходе проводимого лечения в 3-й группе в течение 3 сут наблюдалось достоверное снижение количества ДЭ и уровня Et-1 относительно таковых о животных с 24-часовым ЖП (р<0,05), в то время как у животных 4-й группы данные показатели, напротив, достоверно повышались (р<0,05). В обоих случаях в указанные сроки рассматриваемые показатели оставались достоверно высокими относительно исходных данных (р<0,05). Подобная реакция организма в виде роста концентрации Еt-1 у животных опытной группы подтверждает наличие ЭД при ЖП и объясняет этот факт как регулятор процесса неоангиогенеза сосудов в ответ на повреждение эндотелия. Подобное объяснение находит подтверждение в работе Н.Н. Петрищева [19], который указывает, что Et-1 образуется под действием многих факторов (адреналина, тромбина, ангиотензина, вазопрессина) и секретируется внутрь сосудистой стенки, где расположены специфические высокоаффинные рецепторы. На основании этого можно сделать вывод, что Et-1 играет определенную роль в модуляции сосудистой резистентности, хотя значение его в патогенезе ЖП пока не совсем ясно.

Несколько иная картина наблюдалась со стороны функциональной активности vWF, уровень которого у животных группы сравнения в 1-е сутки проявлял тенденцию к росту относительно такового у животных с 24-часовым ЖП (р>0,05), но при этом оставался достоверно значимым по сравнению с исходным уровнем (р<0,05). Начиная с 3-х суток и далее функциональная активность vWF в группе сравнения достоверно не отличалась от исходных данных (р<0,05). В опытной группе на фоне проводимого лечения вплоть до 3-х суток отмечался дальнейший достоверный рост функциональной активности vWF, достигавшей 2,40±0,1 МЕ/мл против 2,40±0,1 МЕ/мл у животных с 24-часовым ЖП (р<0,05). И только к 10-м суткам показатели vWF в опытной группе уже не отличались от исходных (р>0,05). Данные результаты, полученные в опытной группе, по-видимому, можно объяснить стимулирующим действием НГХ на функциональную активность vWF, которому отводится роль реологического клея, своеобразного моста, соединения рецепторов тромбоцитарной мембраны с субэндотелиальными структурами поврежденной стенки сосуда. Таким образом, наблюдаемый рост функциональной активности vWF в опытной группе, возможно, связан с опосредованным действием НГХ через vWF с участием гликопротеиновых рецепторов IIb/IIIa тромбоцитов, в то время как рост маркеров ЭД - с прямым окислительным воздействием НГХ на эндотелиоциты.

В настоящее время установлено, что тромбоциты способствуют миграции лимфоцитов и их фиксации на поврежденной поверхности эндотелия сосудов, обеспечивая реализацию иммунных реакций и создание адекватных условий для неоангиогенеза и репарации тканей [6]. Так, при изучении ЛТА у животных с 24-часовым ЖП выявлено достоверное снижение ее уровня до 12,4±0,7% против 18,3±0,9% у интактных животных (р<0,05), что указывает на уменьшение количества лимфоцитов, способных присоединять к себе тромбоциты, и нарушение иммунной реакции. При проведении корреляционного анализа установлена сильная прямая связь между содержанием ДЭ, с одной стороны, и уровнем Еt-1 и vWF (r=0,72, p<0,001 и r=0,80, p<0,001) - с другой, а также обратная сильная отрицательная связь между ДЭ и ЛТА (r= –0,78, p<0,01), что подтверждает их высокую специфичность как маркеров ЭД и роль этих маркеров в патогенезе ЖП.

На фоне проводимого лечения изменения ЛТА в исследуемых группах имели разную направленность. Так, если в группе сравнения уровень ЛТА продолжал снижаться, достигая минимальных величин на 3-и сутки, - 10,4±0,5% (р<0,05), то в опытной группе, наоборот, начиная с 1-х суток наблюдался постепенный его рост, и уже на 3-и сутки он достигал 17,7±0,7% и достоверно не отличался от значений у животных интактной группы (р>0,05). Полученные результаты указывают, что комплексное лечение животных с ЖП в опытной группе с использованием как экстра-, так и интракорпорального применения НГХ приводит к увеличению количества мигрирующих лимфоцитов, способных к адгезии с тромбоцитами, что обеспечивает реализацию иммунных реакций и создает адекватные условия для неоангиогенеза и репарации эндотелия сосудов за счет высокого уровня цитокинов в крови. Подобный механизм приводит к стабилизации проницаемости сосудистой стенки и отграничению очага поражения.

Из всех факторов, синтезируемых эндотелием, роль модератора основных функций эндотелия принадлежит NO, который является нестабильной молекулой и обладает свойствами сильного оксиданта [14, 23, 25]. Так, у животных с 24-часовым ЖП отмечается достоверный рост содержания NO в плазме до 5,2±0,2 мкмоль/л против 4,3±0,2 мкмоль/л у животных интактной группы (р<0,05). Очевидно, что в этом определенную роль играет активация фагоцитарной активности нейтрофилов и макрофагов, вызывающих экспрессию индуцированной NO-синтазы (eNOS), эффект которой направлен на поддержание баланса структурных и функциональных нарушений в организме.

На фоне проводимого лечения изменения показателя NO у животных исследуемых групп имели также разную направленность. Если в 3-й группе сравнения показатели NO продолжали снижаться относительно таковых у животных с 24-часовым ЖП, достигая минимальных значений на 3-и сутки, - 3,3±0,1 мкМ/л (р<0,05), то в опытной группе, наоборот, начиная с 1-х суток они повышались, достигая к 3-м суткам максимальных величин - 7,0±0,4 мкМ/л (р<0,05). Обнаруженное снижение генерации NO у животных группы сравнения, по-видимому, обусловлено как недостаточной его продукцией, так и чрезмерной инактивацией. Причиной первой может быть нарушение экспрессии/транскрипции эндотелиальной eNOS вследствие накопления в крови животных эндогенного ингибитора NO - ADMA и модифицированных липопротеидов низкой плотности, уменьшения доступности запасов L-аргинина для eNOS вследствие снижения синтеза, причиной второй - развитие оксидативного стресса. В то же время выявленная гиперпродукция NO в плазме животных опытной группы, по-видимому, происходит как реакция на повреждение эндотелия сосудистой стенки и усиление секреторной активности эндотелия, способствующей синтезу тромбоцитами серотонина, АДФ, тромбина, блокированию окисления липопротеинов низкой плотности, подавлению адгезии моноцитов и тромбоцитов к сосудистой стенке. Кроме того, NO ингибирует экспрессию провоспалительных генов сосудистой стенки, в частности транскрипционного фактора NFkB. Все это указывает на то, что NO влияет не только на выраженность воспаления, но и на его исход, отражая процессы, происходящие в очаге воспаления и непосредственно в эндотелии сосудов.

Таким образом, полученные результаты убедительно свидетельствуют о том, что в ранние сроки развития желчного перитонита в организме животных на фоне эндогенной интоксикации происходят метаболические и функциональные расстройства, причиной которых является эндотелиальная дисфункция с нарушением синтеза таких биологически активных веществ, как эндотелин-1, фактор Виллебранда, оксид азота IL-8, IL-4 и др. Обнаруженное нарушение продукции изучаемых маркеров эндотелиальной дисфункции при желчном перитоните свидетельствует о возможности рассмотрения нового направления в совершенствовании диагностики при этом заболевании. Выявленная при сравнительном анализе в большинстве случаев разнонаправленность влияния применяемых методов лечения на функциональное состояние эндотелия позволяет предположить, что течение желчного перитонита в зависимости от его патогенеза в исследуемых группах различно и требует дальнейшего детального изучения.