Гипотеза о том, что рост солидных опухолей и возникновение метастазов зависят от образования новых кровеносных сосудов, была выдвинута J. Folkman более 25 лет назад и в настоящее время в значительной степени подтверждена открытиями в области молекулярных и клеточных процессов, касающихся регуляции пролиферации, миграции и взаимодействия клеток, образующих сосуды [6, 7, 13, 15, 16].

Одним из основных типов клеток, формирующих кровеносные сосуды, являются клетки эндотелия, выстилающие внутреннюю поверхность капилляров, артерий и вен [5, 17]. С образования капилляроподобных трубок, стенки которых состоят из эндотелиальных клеток, начинается формирование кровеносной системы при эмбриональном развитии. Далее вокруг капилляров собираются другие клетки мезодермального происхождения, такие как перициты, которые по мере укрупнения сосудов замещаются полностью дифференцированными гладкомышечными клетками, образующими стенки крупных сосудов. Вследствие этого исследование процессов, регулирующих пролиферацию, миграцию и взаимодействие именно этих типов клеток, в первую очередь необходимо для понимания механизмов ангиогенеза.

По гистологической классификации ВОЗ опухоли из элементов костного мозга (саркома Юинга и злокачественная лимфома кости, PNET - primitive neyroektodermal tumor) составляют 30-35% всех первичных злокачественных опухолей костей [1, 8, 9].

Саркома Юинга нуждается в дальнейшем изучении, так как обладает определенными особенностями клинического течения [3, 4] и требует гистологической верификации [10, 12] для выбора адекватного специфического лечения [2, 11, 14].

Цель нашего исследования - анализ клинико-статистических признаков и иммуногистохимические исследования ангиогенеза при саркоме Юинга.

В работе проведен анализ результатов обследования 68 больных саркомой Юинга, находившихся на лечении в городском онкологическом диспансере им. А.Т. Аббасова, НИИ травматологии и ортопедии, Травматологической и ортопедической клинической больнице и онкологической клинике АМУ (Баку) с 1998 по 2007 г.

Мужчин было 43 (63,24%), женщин - 25 (36,76%). Наиболее часто опухоль локализовалась в бедренной кости - 24 (35,29%) наблюдения, в большеберцовой кости - 8 (11,76%), в малоберцовой кости - 7 (10,29%), в тазовых костях - 10 (14,71%), в плечевой кости - 9 (13,24%), в лучевой кости - 3 (4,41%), в ребрах - 3 (4,25%), в лопатке - 2 (2,94%), в локтевой кости - 1 (1,47%), в ключице - 1 (1,47%).

Саркому Юинга более часто диагностировали у больных в возрасте от 4 до 37 лет. Так, в возрасте от 1 года до 10 лет было 4 (5,88%) больных, от 11 до 20 лет - 49 (72,06%), от 21 года до 30 лет - 12 (17,65%), от 31 года до 40 лет - 3 (4,41%) больных.

По данным анамнеза больных саркомой Юинга, начало заболевания характеризуется нарушением общего состояния, повышением температуры тела до 38-39 °С, появлением боли в пораженном отделе кости. Затем возникают припухлость и местные признаки воспалительного процесса. Через 1-2 нед припухлость исчезает, признаки воспаления стихают, температура нормализуется, уменьшаются или полностью стихают боли. Ремиссии и рецидивы могут чередоваться несколько раз, потом наступает обострение с резким прогрессированием процесса.

Лишь у небольшой группы больных клиническое течение соответствует классическому описанию Ewing [2]. В наших наблюдениях только у 20 (29,41%) больных отмечено острое начало заболевания. У большинства заболевание начиналось среди полного здоровья, без видимой причины или через какой-то промежуток времени после травмы.

Травма в анамнезе отмечена у 25 (36,76%) наблюдавшихся нами больных. Клинические проявления заболевания возникли в различные промежутки времени - от нескольких дней до 2 лет.

У большинства больных клинические признаки заболевания отмечались в течение первых 3 мес после повреждения, непосредственно после травмы или вскоре после нее.

В большинстве наблюдений заболевание начиналось медленно, постепенно появлялись легкие, скоропреходящие боли в пораженном отделе кости со значительными промежутками между приступами. С течением времени болевые атаки учащались, продолжительность их увеличивалась, затем боль становилась постоянной. Такое течение заболевания отмечено у 52 (76,47%) из 68 больных.

Для решения поставленных задач во всех наблюдениях использовали клинические, рентгенологические, цитологические, гистологические, гистохимические, иммуногистохимические и статистические методы исследования.

При цитологическом и гистохимическом исследованиях дифференциальную диагностику проводили со злокачественной лимфомой кости, в отличие от которой клетки саркомы Юинга характеризуются меньшим полиморфизмом и обычно значительно более низким количеством атипичных фигур митоза, а также отсутствием аргирофильных ретикулиновых волокон.

Для иммуногистохимического исследования использовали материал, замороженный в жидком азоте, из которого изготавливали криостатные срезы с последующей фиксацией в ацетоне, а также материал парафиновых блоков, фиксированных в 10% формалине. Исследования проводили с использованием ферментных иммунных комплексов. Использовали реактивы фирмы DАКО (France): CD 31, Endothelial Cell, clone JC 70A, isotype: Lg GI, kappa 0,2/l ml).

Полученные данные подвергнуты статистической обработке непараметрическими методами с использованием χ²-критерия Пирсона.

Собственные наблюдения и данные литературы убедили нас в том, что по клиническим проявлениям можно выделить две группы поражений опухолью Юинга. Первая, более многочисленная, по клиническому течению более благоприятна. Опухоль сравнительно длительное время остается в пределах одной кости и дает поздние метастазы в лимфатические узлы и легкие. Метастазы в других костях могут выявляться лишь в терминальной фазе заболевания (43 наблюдения - 63,23%). Во второй группе саркома, вызывая быстрое и обширное разрушение кости, бурно метастазирует в другие отделы скелета. Из локального поражения в течение первых месяцев заболевание превращается в генерализованное.

Продолжительность клинических симптомов с момента их появления до первого обращения больного к врачу, по нашим данным, колеблется от нескольких дней до 3 мес.

Как и при других злокачественных новообразованиях скелета, с наибольшим постоянством при саркоме Юинга повторяется характерная триада симптомов: боль в пораженном отделе скелета, припухлость, нарушение функции.

Боль является доминирующим симптомом заболевания и в большинстве наблюдений болевые ощущения возникали раньше видимых на рентгенограмме изменений кости. Отмечалась широкая вариабельность интенсивности боли - от резкой стреляющей до незначительной тупой, появляющейся при физической нагрузке и проходящей в покое. Как и при большинстве сарком костей, интенсивность боли увеличивалась в ночное время. По данным наших исследований, боль при саркоме Юинга никогда не доходила до острой «скелетной» боли, характерной для остеосаркомы.

Другим постоянным симптомом заболевания являлась припухлость. В наших наблюдениях она определялась у 55 (80,88%) больных, как первый признак заболевания - у 28 (41,17%). Размеры припухлости были различны - от небольшой локализованной до обширной деформации пораженной конечности.

Общая реакция организма на заболевание проявляется в виде подъема температуры тела, изменений со стороны крови, иногда отмечается снижение массы тела, в терминальных стадиях - истощение.

Температура тела в различные периоды болезни повышалась у 36 (52,94%) больных, однако мы не отметили непосредственной связи между степенью злокачественности опухоли и температурной реакцией.

Гистологические исследования. Макроскопически ткань опухоли белого цвета, мягкая, обычно с многочисленными участками некроза и обширными очагами кровоизлияний от темно-красного до бурого цвета в зависимости от давности геморрагии. Опухоль обычно вызывает возникновение тромбозов и сдавливает кровеносные сосуды, что в свою очередь приводит к значительным нарушениям кровообращения как в самой опухоли, так и в прилежащих участках кости и окружающих мягких тканях.

Характер периостальной реакции при саркоме Юинга позволяет определить скорость роста опухоли. Наличие слоистого периостоза свидетельствует об относительно медленном росте новообразования. При большой скорости роста саркомы Юинга опухоль проникает через периваскулярные пространства питающих кость артерий. Нарушение кровоснабжения с ухудшением питания при саркоме Юинга сравнительно быстро ведет к дегенеративно-некротическим изменениям в кости, лизису и разрушению ее на значительном протяжении и замещению опухолевой тканью. При данном заболевании некрозы составили примерно 10-15% общей массы опухоли.

Микроскопические исследования. Во-первых, обращает на себя внимание преобладание в опухоли клеточной массы при почти незаметном стромальном компоненте. Во-вторых, клетки саркомы Юинга отличаются сравнительно мелкими размерами, округлой формой и мономорфностью.

При малых увеличениях микроскопа опухолевая ткань состоит действительно из мономорфных мелких клеток с округлым или несколько овальным ядром и узким ободком светлой цитоплазмы без четких границ. Нередко клетки расположены компактно и образуют сплошные поля. В других участках среди клеточных скоплений можно видеть тонкостенные (выстланные эндотелием) сосудистые каналы, построенные по капиллярному типу, вблизи них нередко встречаются массивные кровоизлияния. В очагах некроза жизнеспособная опухолевая ткань сохраняется в виде клеточных периваскулярных муфт.

При большом увеличении микроскопа клетки опухоли выглядят более разнообразными. Ядра клеток варьируют в размерах от 0,5 до 3 диаметров нормального эритроцита. Количество хроматина, определяющего интенсивность окраски ядра, бывает также различным в разных клетках. Но почти всегда хроматин имеет тонкую структуру и равномерно распределен по ядру. В большинстве случаев нуклеолы ядер опухолевых клеток мелкие или даже отсутствуют, но иногда они выделяются очень четко. Ядра обычно овальные, иногда круглые, и хотя они могут варьировать в размерах, очертания их обычно четкие. Размеры клеток в 2-3 раза превышают размеры ядра. Цитоплазма обычно светлая, прозрачная, но иногда окрашивается эозином и напоминает цитоплазму макрофага. Часть опухолевых клеток концентрируется вокруг мелких (капиллярного типа) сосудов, образуя в продольном сечении неправильной формы тяжи, а в поперечном - структуры псевдорозеток. Волокнистых элементов стромы в ткани опухоли выявить почти не удается. Аргирофильный каркас представлен только в сосудах и на очень небольшом протяжении в периваскулярных зонах.

Гистохимические исследования. После фиксации в спирте при воздействии реактива Шиффа (РАS-реакция) и контрольном исследовании содержания амилазы в клетках опухоли Юинга всегда удается обнаружить значительное содержание гликогена. pas-позитивный внутриклеточный гликоген обнаружен во всех 68 наблюдениях саркомы Юинга, обычно в периферических отделах опухоли. При импрегнации серебром сеть из аргирофильных ретикулиновых волокон не выявлялась.

Иммуногистохимическое исследование ангиогенеза. Установлено, что иммуноглобулин CD-31 вырабатывается эндотелиоцитами, а также периваскулярными элементами сосудов. CD-31 определяется в клеточной оболочке и цитоплазме этих клеток.

Среди эндотелиальных клеток выраженная позитивность (+++) идентифицирована у 39 больных (57,1±10,8% клеток), положительная реакция (++) - у 23 больных (33,3±10,3% клеток), постоянная негативность (–) - у 6 больных (9,5±6,4% клеток).

Для изучения ангиогенеза нами произведен подсчет сосудов, эндотелиальные клетки которых экспрессируют CD-31. Установлено, что количество сосудов на срезах в интактной ткани составляет 2,15±0,84%, в срезах ткани при саркоме Юинга - 11,38±1,58%, т.е. по сравнению с интактной тканью количество сосудов, экспрессирующих CD-31, при саркоме Юинга увеличивается более чем в 5 раз (p<0,001).

Иммуногистохимическое исследование ангиогенеза при саркоме Юинга в зависимости от лимфоидной инфильтрации опухоли. При иммуногистохимическом исследовании ангиогенеза при саркоме Юинга в 16 (23,5%) случаях обнаружена низкая степень лимфоидной инфильтрации опухоли при умеренной васкуляризации. В 51 (75%) случае отмечена высокая экспрессия CD-31 и низкая степень лимфоидной инфильтрации. Лишь в 1 (1,5%) случае выявлена постоянная негативность CD-31 и высокая степень лимфоидной инфильтрации. Таким образом, обнаружена обратно пропорциональная корреляционная зависимость между лимфоидной инфильтрацией патологического очага и экспрессией CD-31 позитивных клеток (r=0,394; p<0,001; χ²=29,19).

Иммуногистохимическое исследование ангиогенеза при саркоме Юинга в зависимости от спонтанной некротизации опухоли. При исследовании в 15 (22%) из 68 случаев выявлена низкая степень спонтанной некротизации опухоли. В 51 (75%) случае обнаружена высокая степень экспрессии CD-31 эндотелиальными элементами. Лишь в 2 (3%) случаях экспрессия CD-31 отсутствовала.

Таким образом, установлена достоверная обратная корреляция (r=0,21) между спонтанной некротизацией ткани и экспрессией стромальными элементами CD-31 (χ²=14,61; р<0,01).

Анализируя изученные данные, можно утверждать, что активность секреции CD-31 эндотелиальными элементами прямо коррелирует с интенсивностью васкуляризации опухоли (r=0,322; p<0,01). Другими словами, продукция CD-31 увеличивается в случаях высокой васкуляризации опухоли.

Полученные данные еще раз подтверждают прогностическую значимость увеличения количества сосудов при саркоме Юинга, в эндотелиальных клетках которых экспрессируется CD-31.

Резюмируя изложенное выше, можно утверждать, что активность экспрессии эндотелиальными элементами CD-31 статистически достоверно коррелирует с опухолевым процессом при саркоме Юинга и обратно пропорциональна его выраженности (r=0,429; р<0,001; χ²=32,3). Показатели лимфоидной инфильтрации патологического очага обратно пропорциональны экспрессии CD-31 позитивных клеток (r=0,394; р<0,001; χ²=29,19). Между экспрессией CD-31 эндотелиальными клетками и спонтанной некротизацией ткани при саркоме Юинга выявлена статистически достоверная обратно пропорциональная зависимость (r=0,21; р<0,01; χ²=14,61). Обнаружена достоверная прямая корреляционная связь между ангиогенезом опухолевой ткани и количеством CD-31 (r=0,226; р<0,01; χ²=15,81).

Таким образом, указанные иммуногистохимические особенности ангиогенеза при саркоме Юинга должны быть приняты во внимание при проведении лечебных мероприятий.