Ишемическая болезнь сердца (ИБС) является одним из наиболее частых сопутствующих заболеваний у пациентов с аневризмами грудного отдела аорты (АГА) и встречается у 10—30% таких больных [1—8]. Согласно рекомендациям ACCF/AHA, преимущество коронарной реваскуляризации до или во время реконструкции аорты, а также рутинное использование коронароангиографии все еще остаются спорными, особенно у пациентов со стабильным течением ИБС [9].
Однако ИБС является доказанным фактором риска смертности в раннем послеоперационном периоде у пациентов с хронической диссекцией АГА [4, 5, 7]. При открытой реконструкции аорты без предшествующего или одновременного коронарного вмешательства по поводу ИБС риск периоперационного инфаркта миокарда (ИМ), сердечной недостаточности вследствие недостаточной интраоперационной защиты миокарда или ишемии миокарда, а также фатальных аритмий существенно возрастает [6—8].
Тем не менее, в клинической практике тактика ведения пациентов с хронической диссекцией АГА и ИБС значительно варьирует от расширенных показаний для предоперационной диагностики ИБС до активного оперативного лечения вне зависимости от исходной клинической значимости коронарного атеросклероза. Поэтому вопрос об этапности лечения ИБС у таких пациентов является важным. Благодаря постоянному совершенствованию хирургической техники при одновременном вмешательстве на аорте и коронарных артериях мы видим все большее количество успешных результатов таких операций у пациентов со стабильной ИБС вне зависимости от длительности анамнеза хронической диссекции. При этом у пациентов с нестабильной стенокардией лучшие исходы демонстрирует проведение чрескожного коронарного вмешательства перед оперативным лечением АГА. По данным ряда исследований такая стратегия не ассоциирована с повышением риска острой диссекции аневризмы и кровотечений в послеоперационном периоде [10—13].
На практике большие затруднения вызывает возможность проведения субмаксимального нагрузочного теста для оценки клинической значимости коронарного атеросклероза у пациентов с хронической диссекцией АГА, поскольку имеется риск острой диссекции.
Возможности использования биомаркеров-кандидатов осложненного течения ИБС у пациентов с АГА представляются крайне интересными с точки зрения выработки оптимального алгоритма их предоперационного анализа.
Анализ экспрессии микроРНК у пациентов с различными сердечно-сосудистыми заболеваниями (ССЗ) является одним из популярных направлений в течение последних 15 лет. Такие «нуклеотидные ключи» представляют собой группу малых (длиной до 25 нуклеотидов) одноцепочечных молекул РНК, которые обычно связываются с 3’-НТО участком их мРНК-мишени. Это приводит к ингибированию трансляции и/или деградации мРНК [20, 23]. В конечном итоге мишенью является тот или иной ген, задействованный в биохимической последовательности множественных физиологических процессов.
На сегодняшний день доказано, что в организме человека экспрессируются более 200 видов микроРНК, при этом часть из них (около 200 вариантов) стабильно обнаруживаются во внеклеточных фракциях различных биологических жидкостей (кровь, моча, слюна и спинномозговая жидкость). Во множестве работ показано, что циркулирующие внеклеточные микроРНК обладают высокой стабильностью в плазме крови, что делает достаточно удобными их выявление и анализ экспрессии. Профили внеклеточных циркулирующих микроРНК в плазме и сыворотке являются биомаркерами ряда заболеваний человека, включая онкологические заболевания, сахарный диабет и ССЗ [15, 17—27].
В частности, имеется большое количество публикаций о возможностях использования экспрессии этих «нуклеотидных ключей» для оценки выраженности атеросклероза. Поэтому исследование этих биомаркеров у пациентов с АГА и ИБС также представляется очень перспективным [14—16, 23].
Таким образом, целью нашего исследования явился анализ комплекса стабильных циркулирующих микроРНК как возможных диагностически значимых биомаркеров-кандидатов у пациентов с различными клиническими проявлениями ИБС.
Материал и методы
В исследование были включены пациенты Клинического центра Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (Университетская клиническая больница №1). Информированное добровольное согласие было получено от каждого участника. Включение пациентов осуществляли с января 2018 по февраль 2020 г.
В исследование были включены 33 пациента: 13 больных с АГА без ИБС, 5 пациентов с АГА и стабильной ИБС, 15 пациентов с АГА и признаками нестабильной ИБС (впервые возникшая или прогрессирующая стенокардия). Контрольную группу составили 17 человек без признаков атеросклеротического поражения коронарных артерий по данным МСКТ коронарных артерий с контрастированием. Протокол исследования был одобрен этическим комитетом университета.
У всех участников исследования фиксировали антропометрические и клинические данные, данные стандартной ЭКГ покоя и трансторакальной эхокардиографии (Эхо-КГ). Показатели регистрировали путем сбора анамнеза, физикального осмотра пациента. Регистрацию ЭКГ выполняли стандартным неавтоматизированным 12-канальным электрокардиографом Shiller. Трансторакальную Эхо-КГ проводили штатные специалисты клиники на УЗИ-аппаратах экспертного уровня по стандартным протоколам с измерением всех основных показателей. Лабораторный контроль показателей общего и биохимического анализов крови также выполнен межклинической лабораторией.
Количественное определение микроРНК с использованием РТ-ПЦР
После подписания информированного согласия на участие в исследовании были взяты образцы венозной крови в стандартную вакуумную пробирку с раствором ЭДТА объемом 6 мл. Образцы плазмы были получены с помощью двухэтапного центрифугирования пробирок с кровью при ускорении 2130 g в течение 10 мин при комнатной температуре с отбором верхних двух третей плазмы после каждого этапа центрифугирования. Образцы плазмы были заморожены и хранились при –20 °C до выделения микроРНК. Перед выделением микроРНК образцы плазмы были разморожены и центрифугировались при 16 000 g в течение 15 мин. МикроРНК была выделена из 300 мкл плазмы с помощью набора Nucleo Spin miRNA Plasma (Macherey-Nagel, Германия) и хранилась при –80 °C до синтеза комплементарной ДНК (кДНК). Образцы плазмы с визуально детектируемым гемолизом были исключены из исследования.
Степень гемолиза анализировали путем наноспектрофотометрии с определением пика оксигемоглобина на длине волны 414 нм и референсного пика на длине волны 385 нм. Так как избыточный гемолиз может влиять на профиль циркулирующих микроРНК, в исследование включали только те образцы плазмы, в которых значение HS не превышало 0,25. Синтез кДНК был проведен с помощью набора реагентов Taq Man Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Детекцию микроРНК производили с помощью количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с флуоресцентными зондами типа Taq Man с использованием реагентов Taq Man Advanced MiRNA Assays (Thermo Fisher Scientific, США) для всех участников исследования в однократной повторности для каждого образца. Критериями для выбора кандидатных микроРНК являлись следующие параметры: 1) микроРНК является специфичной для мРНК генов, вовлеченных в метаболические пути патогенеза сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ); 2) уровень экспрессии микроРНК в плазме ассоциирован с ССЗ по данным литературы; 3) микроРНК детектируется в плазме с помощью выбранной ПЦР-методики со средними величинами Ct не более 35 циклов.
Мы определяли уровни 12 циркулирующих микроРНК: miR-21-5p, 23a-3p, 29b-3p, 92a-3p, 126-5p, 143-3p, 145-5p, 146a-5p, 150-5p, 181b-5p, 223-3p и 451a.
В дальнейшем все образцы микроРНК были использованы для анализа (n=50).
Статистический анализ
Статистический анализ проводили с использованием программы Prism 9 (GraphPad, США). В связи с небольшим размером групп (менее 20 пациентов) тест на нормальность распределения полученных данных не проводили.
Различия в клинических характеристиках пациентов с АГА, АГА и различными формами ИБС и пациентов контрольной группы анализировали с помощью теста Крускалла—Уоллиса с поправкой на множественное сравнение, а также использовали критерий c2 для качественных переменных. Корреляционный анализ проводили с использованием коэффициента корреляции Спирмена. Диагностические значения оценивали с помощью ROC анализа. Площадь под кривой ROC (AUC) считали критическим диагностическим индексом. Все тесты были двусторонними. Значение p<0,05 считали значимым для всех анализов.
Результаты
Клинические характеристики пациентов, включенных в исследование, представлены в табл. 1.
Таблица 1. Исходные характеристики пациентов, включенных в исследование
| Параметр | Пациенты с АГА и стабильной стенокардией (n=5) | Пациенты с АГА и нестабильной стенокардией (n=15) | Пациенты с АГА без ИБС (n=13) | Контрольная группа (n=17) | p-критерий |
| Возраст, годы | 61,4±7,8 | 61,9±10,0 | 56,5±14,9 | 65,9±10,9 | 0,42 |
| Мужчины, n (%) | 2 (40) | 11 (73) | 8 (62) | 4 (24) | 0,03 |
| ИМТ, кг/м2 | 31,2±6,6 | 26,8±3,8 | 26,6±5,2 | 28,4±4,1 | 0,29 |
| Курение, n (%) | 2 (40) | 5 (33) | 4 (31) | 1 (6) | 0,19 |
| ФП, n (%) | 2 (40) | 6 (40) | 1 (8) | 7 (41) | 0,19 |
| АГ, n (%) | 5 (100) | 13 (87) | 10 (77) | 15 (88) | 0,59 |
| Наличие атеросклеротического поражения коронарных артерий, n (%) | 5 (100) | 15 (100) | 0 (0) | 0 (0) | <0,001 |
| ФВ ЛЖ, % | 59,6±6,3 | 61,0±7,6 | 62,4±10,9 | 60,2±8,4 | 0,04 |
| Размер аневризмы грудной аорты по данным Эхо-КГ, мм | 58,1±12,9 | 54,2±10,0 | 61,3±14,4 | — | — |
| Размер аневризмы грудной аорты по данным КТ, мм | 59,0±7,8 | 57,5±13,8 | 63,7±16,4 | — | — |
| Общий холестерин, ммоль/л | 4,1±1,4 | 4,7±1,1 | 4,7±1,3 | 5,7±1,5 | 0,08 |
| ЛПНП, ммоль/л | 2,3±1,1 | 2,9±1,0 | 2,8±1,2 | 3,6±1,5 | 0,15 |
| ТГ, ммоль/л | 1,4±0,8 | 1,6±0,9 | 1,8±1,2 | 1,4±0,5 | 0,95 |
| Глюкоза, ммоль/л | 5,5±0,8 | 5,4±0,9 | 5,7±0,9 | 5,2±0,7 | 0,22 |
| Сывороточный креатинин, мкмоль/л | 112,9±29,5 | 105,2±23,8 | 108,9±16,7 | 86,5±13,1 | 0,005 |
| Терапия статинами, n (%) | 1 (20) | 8 (53) | 4 (31) | 7 (41) | 0,19 |
| Терапия бета-блокаторами, n (%) | 4 (80) | 14 (93) | 11 (87) | 8 (47) | 0,006 |
Примечание. ИМТ — индекс массы тела, ФП — фибрилляция предсердий, АГ — артериальная гипертензия, ФВ ЛЖ — фракция выброса левого желудочка, КТ — компьютерная томография, ЛПНП — липопротеиды низкой плотности, ТГ — триглицериды. Количественные данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, качественные характеристики — число пациентов (процент пациентов в группе). Уровень p<0,05 считали статистически значимым.
Анализ ассоциаций уровней микроРНК проводили при разделении пациентов на 4 группы: по наличию АГА, внутри группы с аневризматическим расширением аорты по наличию признаков стабильной и нестабильной стенокардии. Контрольную группу составили пациенты без АГА и с интактными коронарными артериями. Мы также провели сравнение пациентов различных экспериментальных групп по клиническим критериям (факторы риска ССЗ, клинико-демографические показатели).
Пациенты из четырех групп значимо не различались по возрасту, индексу массы тела, показателям липидного обмена, концентрации глюкозы в сыворотке крови. Также группы не различались по наличию артериальной гипертензии (АГ), случаям фибрилляции предсердий и распространенности терапии статинами. Мы получили статистические различия по показателям атеросклеротического поражения коронарных артерий, что обусловлено дизайном исследования, по количеству пациентов мужского пола в группах, фракции выброса левого желудочка, концентрации сывороточного креатинина. Также в контрольной группе существенно меньше пациентов получали β-адреноблокаторы в схеме терапии.
Корреляция уровней микроРНК с различными клиническими проявлениями ИБС у пациентов с АГА
Профиль экспрессии циркулирующих микроРНК у пациентов экспериментальных групп и пациентов контрольной группы
Из 12 потенциальных циркулирующих микроРНК экспрессия трех вариантов (23a-3p, 146-5p и 150-5p) достоверно различалась между пациентами с АГА и нестабильной стенокардией и остальными группами. Мы не обнаружили эксклюзивных микроРНК для пациентов с АГА и клиническими признаками стабильной стенокардии. Экспрессия трех микроРНК была достоверно выше у пациентов экспериментальной группы в сравнении с контрольной группой: микроРНК 23a-3p в 3 раза (p=0,0094), микроРНК 146-5p в 3 раза (p=0,0123), микроРНК 150-5p в 12 раз (p=0,0096) (рис. 1).
Рис. 1. Сравнение экспрессии микроРНК у пациентов с АГА без ИБС и с различными формами ИБС (непараметрический тест сравнения множественных групп Крускалла—Уоллиса с поправкой на множественное тестирование Данна).
* — p<0,05, ** — p<0,01.
Корреляционный анализ
Мы провели корреляционный анализ для оценки возможного диагностического потенциала выбранных микроРНК. Оценивали корреляцию экспрессий трех микроРНК у пациентов с АГА и нестабильной стенокардией в сравнении с их уровнями у пациентов контрольной группы. Было выявлено, что уровни экспрессии всех трех микроРНК сильно коррелированы между собой у пациентов экспериментальной группы (микроРНК 23a-3p и микроРНК 146-5p: r=0,8036, p=0,0005; микроРНК 23a-3p и микроРНК 150-5p: r=0,9231, p<0,0001; микроРНК 146-5p и микроРНК 150-5p: r=0,7527, p=0,0042). Данные, полученные для всех корреляционных пар, были статистически значимыми (рис. 2, а—в).
Рис. 2. Результаты корреляционного анализа (непараметрический критерий Спирмена) для дифференциально экспрессированных микроРНК.
а—в — для пациентов с АГА и нестабильной стенокардией; г—е — для пациентов контрольной группы. Точка на графике соответствует абсолютной экспрессии микроРНК.
Для пациентов контрольной группы средняя корреляция наблюдалась только для пары микроРНК 146-5p и микроРНК 150-5p (микроРНК 23a-3p и микроРНК 146-5p: r=0,3971, p=0,1156; микроРНК 23a-3p и микроРНК 150-5p: r=0,3882, p=0,1382; микроРНК 146-5p и микроРНК 150-5p: r=0,6532, p=0,0136). Данный коэффициент корреляции также был статистически значимым (рис. 2 г—е).
Оценка диагностического потенциала циркулирующих микроРНК с помощью ROC анализа
По данным ROC кривых, полученных для микроРНК 23a-3p, 146a-5p и 150-5p, следует предположить, что каждая из микроРНК может стать потенциальным биомаркером для диагностики нестабильной стенокардии у пациентов с аневризмой грудной аорты с AUC 0,8235, 0,7961 и 0,8353, соответственно (рис. 3). Параметры моделей указаны в табл. 2.
Рис. 3. ROC кривые для микроРНК 23a-3p, 146a-5p и 150-5p и их комбинаций.
Комбинация I — микроРНК 23a-3p, 146a-5p и 150-5p; комбинация II — микроРНК 23a-3p и 146a-5p, комбинация III — микроРНК 23a-3p и 150-5p.
Таблица 2. Параметры статистических моделей, полученных с помощью ROC-анализа
| Характеристики ROC анализа | микроРНК | |||||
| miRNA 23-3p | miRNA 146a-5p | miRNA 150-5p | Комбо I | Комбо II | Комбо III | |
| Площадь под кривой (AUC) | 0,8235 | 0,7961 | 0,8353 | 0,8161 | 0,8150 | 0,8235 |
| Стандартная ошибка | 0,074 | 0,079 | 0,08 | 0,0435 | 0,054 | 0,053 |
| 95% доверительный интервал | 0,68—0,97 | 0,64—0,95 | 0,68—0,99 | 0,73—0,91 | 0,71—0,92 | 0,72—0,93 |
| p-критерий | 0,0018 | 0,0044 | 0,0012 | <0,0001 | <0,0001 | <0,0001 |
Как продемонстрировано на рис. 2, а—в, микроРНК 23a-3p, 146a-5p и 150-5p значимо коррелируют друг с другом, что потенциально может свидетельствовать о возможности их комбинированного использования для диагностики нестабильной стенокардии у пациентов с АГА. Поэтому мы исследовали 3 возможные комбинации микроРНК: комбинация I — микроРНК 23a-3p, 146a-5p и 150-5p; комбинация II — микроРНК 23a-3p и 146a-5p; комбинация III — микроРНК 23a-3p и 150-5p. Данные комбинированного ROC анализа демонстрируют сходные показатели AUC, но меньшую ошибку по сравнению с одиночным использованием биомаркеров. В результате ROC анализа комбинации I (все три микроРНК) мы получили наиболее оптимальную форму ROC кривой без провалов и разрывов с оптимальными показателями точности и стандартной ошибки (AUC=0,8161, стандартная ошибка 0,0435, p<0,001).
Обсуждение
Диагностические возможности различных микроРНК как биомаркеров риска осложненного течения ССЗ в настоящее время широко исследуются [14—27].
В нашем исследовании мы предприняли попытку выявления значимых микроРНК у пациентов с АГА и ИБС, возможных для применения в предоперационной диагностике. Мы обнаружили, что у таких пациентов микроРНК 23a-3p, 146a-5p и 150-5p имеют значимо более высокую экспрессию. Среди них микроРНК 23a-3p и 150-5p обладают схожей диагностической точностью, а оптимальные параметры классификации были достигнуты при совместном использовании потенциальных биомаркеров.
В более ранних исследованиях ССЗ авторы неоднократно предлагали использовать микроРНК в диагностических целях [15—22]. В частности, было обнаружено, что уровень микроРНК-23a повышался у пациентов с атеросклеротическим поражением коронарных артерий [15, 19, 21]. Кроме того, в ряде исследований было показано, что значительная гиперэкспрессия микроРНК-23a и других вариантов микроРНК имеется у пациентов с острой диссекцией грудной аорты (p=0,026) [14, 16, 20].
Например, экспрессия микроРНК-146a, связанной с воспалением и окислительным стрессом (ее мишенями являются гены фактора некроза опухоли, интерлейкина-1, киназы рецептора интерлейкина-1), была заметно повышена среди пациентов с ИБС по сравнению со здоровой популяцией [15]. Кроме того, показана роль микроРНК 146a как независимого предиктора сердечно-сосудистых катастроф у пациентов с ИБС [17, 19].
Предшествующие исследования микроРНК 150a-5p в основном были сконцентрированы на ее влиянии на прогноз и течение сердечной недостаточности. Уровень этой микроРНК является независимым предиктором развития сердечной недостаточности, а также ее прогрессирования за счет активации фиброза, при этом в ряде исследований микроРНК 150a-5p была представлена как возможный биомаркер для пациентов с нестабильной стенокардией [18—27].
Основными ограничениями нашего исследования являются малые размеры выборок и существенно меньшее число участников исследования с АГА и стабильной ИБС. Именно поэтому мы можем сделать лишь осторожные предварительные выводы о диагностической значимости полученных нами результатов. Идентифицированные нами микроРНК демонстрируют сходные корреляционные отношения, а микроРНК 23a-3p и 146a-5p, вероятно, также обладают диагностическим потенциалом в отношении стабильной ИБС (рис. 4).
Рис. 4. Результаты корреляционного (непараметрический критерий Спирмена) и ROC анализа для дифференциально экспрессированных микроРНК у пациентов с АГА и стабильной ИБС.
Точка на графике соответствует абсолютной экспрессии микроРНК.
Заключение
Наши данные позволяют предположить роль циркулирующих микроРНК 23a-3p, 146a-5p и 150-5p как возможных диагностических биомаркеров нестабильной ИБС у пациентов с АГА. Учитывая сильную корреляцию этих биомаркеров между собой, необходимы дальнейшие исследования как их самостоятельного, так и совместного использования. В целом на сегодняшний день можно сказать, что в связи с быстротой и минимальной инвазивностью диагностики микроРНК представляются многообещающими биомаркерами-кандидатами для динамического наблюдения и стратификации риска послеоперационных осложнений у пациентов с АГА.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.