Введение

Врачебный арсенал лекарственных ферментных препаратов поддерживается в том числе и терапевтическим использованием гиалуронидазы. Длительное медицинское применение этого фермента (свыше 60 лет) обоснованно выявило его достоинства и недостатки [1]. Нативный биокатализатор показал довольно быструю деградацию и инактивацию в организме, его обычным побочным действием оказались аллергические реакции (в большинстве случаев локальные, с нечастым проявлением системных эффектов). Отмеченное положение способствовало необходимости преодоления и устранения обнаруженных слабых сторон ферментного препарата для его эффективного использования в практическом здравоохранении. Бычья тестикулярная гиалуронидаза [2, 3] исторически заняла доминирующее положение в фарминдустрии, чему способствовала относительная недороговизна препарата, рентабельность его получения на отечественных предприятиях и производствах других стран, простота наружного и подкожного введения. Сложившаяся ситуация обусловила развитие подходов к укреплению структуры биокатализатора. Новые направления исследований медицины сосудов ассоциировались с изучением метаболизма углеводов [4, 5], в котором заметна значимость гиалуронидазы и эффективность приемов вычислительной биохимии. Благодаря последним можно выявить молекулярные ферментные центры/позиции для целенаправленного воздействия на глобулу биокатализатора гликозаминогликановыми (ГАГ) лигандами [6, 7] для разработки (на основе получаемых в итоге белковых производных) терапевтических средств нового поколения. Впервые осуществленное нами такое пионерное вычислительное исследование позволило обобщить полученные эффекты теоретически изученных взаимодействий фермента с ГАГ-лигандами и представить основные положения настоящего обзорного сообщения для обоснования экспериментальных приемов дальнейшего получения модифицированных форм гиалуронидазы. Актуальным выступает регуляция состояния эндотелиального гликокаликса, поддерживающего функцию двойного защитного слоя сосудистой стенки [8]. В современном арсенале врача главным образом преобладают только средства заместительной терапии (как сулодексид — смесь из высокоочищенных ГАГ, состоящая на 80% из высокоподвижного гепарина и на 20% из дерматансульфата [9]). Нацеленность терапии на сохранение функционирования сосудистой стенки [10—12], подтверждение данными клинических изучений полезности ГАГ для восстановления нормальной эндотелиальной функции [11] подчеркивают важность получения интересных и продуктивных результатов вычислительного исследования, пригодных для последовательного обоснования формулируемого здесь перехода от уже использованных нами теоретических методов изучения к последующим экспериментальным, с целью разработки новых препаратов гиалуронидазы для устранения сосудистых поражений (эффективно продемонстрированное ранее in vivo при ишемии конечностей крыс [13]).

Применяемые подходы теоретического изучения

Выполнение нами ранее расчетного изучения докинга гиалуронидазы с тримерами хондроитинсульфата (ХС) и тетрамерами гепарина (ГП) [14], тримерами хондроитина (ХН) [15] обосновало проведение завершающего аспекта вычислительного рассмотрения динамики взаимодействия белка с тримерами гиалуронана (ГН). Для этого расчетно/виртуально в ячейке с водой размещали построенную нами 3D-модель гиалуронидазы (размеры ячейки были в два раза больше молекулярных размеров этого фермента) [16] с тремя тримерами ГН, а затем вводили тример ХС. Оказалось, что тримеры ГН занимают свои позиции по 3 центрам связывания на глобуле гиалуронидазы при 310 К (рис. 1). Аминокислотные остатки (а.о.) 1-го ферментного центра связывания, доступные для контакта с лигандом, — К446, К447, К430, 2-го центра — K187, K198, R246, D249, L250, W252, E184, I188, E194, P153, T154, 3-го — R59, R63, R64. Расчетную регистрацию осуществляли, размещая низкомолекулярный (короткоцепочечный) ГАГ-лиганд в различных положениях вокруг макромолекулы гиалуронидазы на расстоянии половины ее поперечного размера. Выполненные расчеты молекулярной динамики при 310К проводили с применением программ NAMD с VMD версии 2.18, а для построения рисунков использовали программу UCSF Chimera [14, 15].

Рис. 1. Начальное/стартовое состояние расчетного наблюдения, когда 3 гексамера ГН занимают свои позиции по центрам связывания на глобуле гиалуронидазы при 310 К (указанная величина температуры задается/поддерживается здесь и далее).

1-й центр связывания (1) расположен внизу справа на рисунке (аминокислотные остатки /а.о./ фермента, доступные для контакта с лигандом — К446, К447, К430). 2-й центр связывания (2) показан внизу слева (а.о. — K187, K198, R246, D249, L250, W252, E184, I188, E194, P153, T154), а 3-й (3) — в середине сверху (а.о. — R59, R63, R64). Катионы Na⁺ обозначены синими, а анионы Cl^- — белыми шариками. Отмеченные центры связывания ранее иллюстративно уже были представлены и здесь обозначены стрелками (1—3) [14, 15].

Выбор ГАГ-лигандов выполняли в базе данных Pubchem.ncbi.nlm.nih.gov [14, 15]. Были отобраны на основе использованных ранее агентов тример (гексасахарид) ГН, тример (гексасахарид) ХС [14]. Длина выбранных ГАГ-молекулярных лигандов в вытянутом состоянии соответствует поперечному размеру молекулы бычьей тестикулярной гиалуронидазы.

Конкурентные взаимодействия с гиалуронидазой тримеров ГН и ХС

Качественно следует заметить, что тример ХС и ГН занимают все те же 6 центров связывания на молекулярной поверхности фермента, определенные нами ранее [14]. Доминирующую роль в рассматриваемых взаимодействиях играют электростатические силы. Движителем передвижения лиганда (приложенным к его центру масс) становится величина градиента электрического потенциала фермента.

При введении в систему (3D-модель гиалуронидазы с тримерами ГН) тримера ХС он располагается над зоной активного центра биокатализатора (рис. 2). Гексамеры (гексасахаридные производные) ГН пока удерживаются по 3 центрам связывания на молекулярной поверхности фермента.

Рис. 2. Гексамер ХС располагается над входом в зону активного центра гиалуронидазы (сверху по центру молекулы), как представлено на 1,0 нс динамики.

Справа гексамер ГН.

С ростом времени расчетного наблюдения тример ХС приближается к третьему центру связывания тримера ГН на молекулярной поверхности биокатализатора (рис. 3).

Рис. 3. Гексамер ХС приближается к 3-му центру связывания на молекуле гиалуронидазы (обозначено стрелкой), а гексамер ГН отходит от этого третьего места связывания.

Момент времени расчетного наблюдения 2,0 нс.

Во время всей динамики взаимодействий движения молекулы гиалуронидазы ограничены/запрещены, тогда как вода, соли и ГАГ-производные свободны (таковы выбранные в изучении начальные условия и этапы связывания). На рис. 1—3 вода не показана, а на рис. 4, а она представлена. Заметим, что рис. 4 — это визуализация одного и того же состояния, когда вода (рис. 4, б) демонстрируется полностью прозрачной, поэтому ее не видно. То же самое относится к рис. 1—3. На 5,2 нс взаимодействия представлено (см. рис. 4) как гексамер ХС полностью вытесняет гексамер ГН с 3-го центра связывания на гиалуронидазы (при 310 К). Следует отметить, что при дальнейшем расчетном наблюдении на 6,0 нс достигается получение изображения весьма сходного (почти ничем не отличающегося от вида рис. 4) для момента 5,2 нс.

Рис. 4. Гексамер ХС полностью вытеснил (обозначено стрелками) гексамеры ГН с третьего центра связывания на молекуле гиалуронидазы (сверху справа), как показано на 5,2 нс расчетного наблюдения (при 310 К) в водном окружении (а) и без его иллюстративного представления (б).

В течение всего взаимодействия молекуле гиалуронидазы движения запрещены, тогда как вода, соли и полисахариды свободны.

Различие аффинности ГАГ-лигандов к центрам связывания гиалуронидазы

Эффективность взаимодействия гиалуронидазы с ГАГ-лигандами демонстрирует, что тетрамер ГП занимает все те же ранее определенные шесть мест связывания на молекулярной поверхности биокатализатора [14, 17, 18]. К ней он присоединяется существенно быстрее, чем тример ХС, а тот эффективнее, чем тример ГН. Тримеры ГН проявляли пониженную аффинность к гиалуронидазе в сравнении с эффектами тримеров ХС. Такое соотношение эффектов наблюдаемого присоединения разных ГАГ-лигандов к ферменту объясняется, вероятно, невысокой действенностью связывания с гиалуронидазой тримеров ГН (в сравнении с другими лигандами) как и недостаточным количеством центров их связывания на белковой молекуле. Для полимерных форм ГН и ХС, ассоциирующихся с большим набором контактных центров с биокатализатором, уже давно установлена [2, 3] более быстрая деполимеризации ГН по отношению к ХС, подтвержденная и позднее [19]. В этом случае (из-за разницы использованных методов определения активности фермента) важно подчеркнуть именно саму тенденцию, а не ее количественное выражение. Следует заметить, что конечным продуктом (с самым короткоцепочечным составом) субстратной деструкции ГН с помощью гиалуронидазы человека оказывается его октасахарид (тетрамер), а для бычьей тестикулярной гиалуронидазы — гексасахарид (тример) ГН [16]. Отметим также обнаруженную нами наглядную демонстрацию эффекта стабилизации гиалуронидазы, когда в присутствии лигандов хондроитина (тримеры ХН) повышается температура денатурации нативного фермента (на 10—15 °C), а в их отсутствии наблюдается сужение входа в активный центр биокатализатора и происходит снижение/потеря его ферментативной активности (310 К/37 °C) [15]. Предупреждению гепаринового ингибирования биокатализатора служит и присоединение по 4—5 связывающим центрам на глобуле гиалуронидазы тримерных лигандов ХС, подтверждая (благодаря их воздействию) укрепление активной структуры фермента [14]. Достижение последнего (стабилизации структурной организации биокатализатора) возможно также в результате использования методов биологического синтеза для получения модифицированных генно-инженерных производных гиалуронидазы. Названный подход продемонстрировал свою продуктивность в разработке рекомбинантной проурокиназы (пуролазы с модифицирующей заменой первых 24 аминокислотных остатков N-концевого рецептор-связывающего домена по сравнению с природной формой белка), эффективно вошедшей в клиническую практику тромболитической терапии [20].

Важность центров присоединения ГАГ-лигандов на молекулярной поверхности гиалуронидазы (для изменения ее ферментативной активности) подчеркивает их регуляторную функцию и актуальность исследования закономерностей отмеченного взаимодействия с разным видом лигандов [17] и для разных патологий [13, 18, 21].

Заключение

Обобщающее рассмотрение последовательно собранных нами теоретических данных взаимодействия 3D-модели бычьей тестикулярной гиалуронидазы с ГАГ- лигандами указывает на перспективность их использования для экспериментальной стабилизации фермента. Такие эффекты расчетно достижимы благодаря электростатическому нековалентному модифицированию биокатализатора тримерами ХН и ХС [14, 15]. Вычислительные результаты свидетельствуют и о продуктивности ковалентной модификации (после бензохиноновой активации ГАГ-лигандов) гиалуронидазы по одному (тримером ХС) или нескольким связывающим центрам (тримерами ХС или ХН) биокатализатора [17—19]. Предпочтительность выбора эффективного модификатора, конкретного ГАГ-лиганда, может определить будущее экспериментальное исследование указанных производных гиалуронидазы с отмеченными ГАГ-лигандами. Заметные перспективы связаны с получением генно-инженерных производных новых форм гиалуронидазы.

Финансовая поддержка

Настоящее исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства здравоохранения Российской Федерации (тема Госзадания 121031300189-3).

Соблюдение этических норм

Настоящий обзор не содержит описания выполненных авторами исследований с участием людей или использованием животных в качестве объектов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.