Пропротеиновая конвертаза субтилизин/кексин 9-го типа (PCSK9) относится к семейству пропротеиновых конвертаз сериновых протеиназ и была открыта в 2003 г. [1]. Единственным идентифицированным в настоящее время субстратом PCSK9 является его собственный продомен [2]. Огромный интерес к данному белку связан с одной из его основных физиологических функций — регуляцией липидного обмена путем протеолиза белка — рецептора частиц липопротеидов низкой плотности (ЛНП) [3]. Показано, что мутации в гене PCSK9 являются одной из причин семейной гиперхолестеринемии (СГХС) — доминантно наследуемого заболевания, при котором нарушается рецептор-опосредованное связывание ЛНП с клеткой, что приводит к накоплению частиц липопротеидов в плазме крови [4]. Создание новых поколений биологических препаратов, снижающих содержание липидов в крови, таких как полностью гуманизированные моноклональные антитела (МкАТ) к PCSK9, блокирующие его связывание с рецептором ЛНП, а также антисмысловые олигонуклеотиды [5], ингибирующие синтез PCSK9, открыло новую эру в лечении больных СГХС, позволяя снизить концентрацию холестерина (ХС) ЛНП на 50—70% [6]. Концентрация PCSK9 в плазме крови человека колеблется в широком интервале и зависит от множества различных физиологических условий [7].
Неожиданным было обнаруженное влияние на уровень липопротеида (а) [Лп (а)] терапевтических препаратов, воздействующих на PCSK9 [8, 9], поскольку ранее показано, что клиренс Лп (а) практически не регулируется рецептором ЛНП [10, 11]. Остается открытым вопрос относительно возможных механизмов воздействия ингибиторов PCSK9 на уровень Лп (а).
Частица Лп (а) представляет собой сложный надмолекулярный комплекс, в состав которого входят подобная ЛНП, содержащая апоВ-100 частица и молекула уникального для семейства липопротеидов апобелка (а) [апо (а)], молекулярная масса которого варьирует от 300 до 800 кДа.
Цель работы — изучить связь концентрации Лп (а) и PCSK9 у ранее не получавших терапию статинами пациентов с впервые выявленной тяжелой гиперхолестеринемией (ГХС), без клинических проявлений ишемической болезни сердца (ИБС) и гемодинамически значимых поражений сонных артерий в зависимости от фенотипа апо (а).
Материал и методы
В исследование включили 133 мужчин и женщин в возрасте от 18 до 75 лет (средний возраст 52±11 лет) с впервые выявленной тяжелой ГХС: с уровнями общего ХС (ОХС) 7,5 ммоль/л и/или ХС ЛНП 4,9 ммоль/л, ранее не получавших терапию статинами.
В исследование не включали лиц с диагнозом ИБС и/или документированным инфарктом миокарда в анамнезе, с гемодинамически значимыми поражениями сонных артерий, декомпенсированным сахарным диабетом, гипотиреозом, почечной или печеночной недостаточностью, острым коронарным синдромом, а также перенесших эндоваскулярные или хирургические вмешательства в течение последних 6 мес.
У всех пациентов определяли показатели липидного состава крови ферментативным методом. Содержание Х.С. ЛНП рассчитывали по формуле Фридвальда: ХС ЛНП = ОХС – ХС ЛВП – ТГ/2,2 (ммоль/л). Уровень Х.С. ЛНП, корригированный по концентрации Х.С. Лп (а) (ХС ЛНПкорр.) рассчитывали по формуле Фридвальда в модификации Далена: ХС ЛНПкорр. = ХС ЛНП – Х.С. Лп (а), где Х.С. Лп (а)=Лп (а) · 0,33/38,7 ммоль/л [12]. Титр IgG и IgM аутоантител (аутоАТ) к ЛНП и Лп (а), а также к их окисленным в присутствии двухвалентной меди производным, определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа в соответствии с описанным ранее, с использованием в качестве проявляющих, коммерческие антитела (АТ) козы против иммуноглобулинов G и M человека («Sigma Aldrich», США) [13]. Для определения концентрации PCSK9 использовали коммерческий набор Ouantikine ELISA Human Proprotein Convertase 9/PCSK9 Immunoassay («R&D System», США).
Концентрацию Лп (а) в сыворотке определяли методом иммуноферментного анализа с использованием моноспецифических поликлональных АТ барана к Лп (а) человека [14]. Все результаты иммуноферментных анализов фиксировали с использованием микропланшетного спектрофотометра Multiscan Go («Thermo Sсientific», Финляндия). Фенотипирование апо (а) проводили методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующим иммуноблоттингом с использованием моноспецифических поликлональных АТ к Лп (а). К группе с низкомолекулярным фенотипом (НМФ) апо (а) относили пациентов, имеющих хотя бы одну изоформу апо (а) с молекулярной массой 580 кДа и менее, а с высокомолекулярным фенотипом (ВМФ) — пациентов с изоформами апо (а) более 580 кДа. В образцах с концентрацией Лп (а) менее 10 мг/дл (предел чувствительности иммуноблоттинга) фенотип апо (а) не определяли, а пациентов выделяли в отдельную группу с так называемым недетектируемым (НДФ), или «нулевым», фенотипом.
Статистическую обработку полученных данных выполняли с использованием пакета MedCalc версия 15.8. Результаты представляли в виде среднего значения ± стандартное отклонение для параметров, имеющих нормальное распределение, или медианы с указанием интерквартильного интервала [25-й процентиль; 75-й процентиль] для параметров, имеющих распределение, отличное от нормального. Для определения нормальности распределения данных использовали критерий Колмогорова—Смирнова. При сравнении количественных показателей двух групп использовали параметрический критерий t Стьюдента и непараметрический критерий Манна—Уитни. Для оценки частотных данных между группами применяли точный критерий Фишера. При проведении однофакторного корреляционного анализа использовали коэффициент ранговой корреляции по Спирмену, при многофакторном анализе — множественный регрессионный анализ или логистический анализ.
Результаты
Пациенты были разделены на 3 подгруппы в соответствии с определенным фенотипом апо (а). Группы не различались по возрасту, полу, наличию артериальной гипертонии, курению, индексу массы тела (ИМТ), наследственному анамнезу СГХС и липидному составу крови. Статистически значимые различия наблюдались только по наличию сахарного диабета (табл. 1).
Уровень PCSK9 не различался в подгруппах пациентов с ВМФ или НМФ апо (а), в отличие от концентрации Лп (а) (рис. 1).
Мы обнаружили тенденцию к более высокому титру АТ к окисленным Лп (а) [окЛп (а)] в подгруппе пациентов с НМФ апо (а) по сравнению с пациентами с ВМФ и НДФ. Для А.Т. другой специфичности различий между подгруппами не наблюдалось (табл. 2).
В общей группе пациентов концентрация PCSK9 коррелировала только с полом и возрастом (табл. 3).
Однако при проведении корреляционного анализа внутри каждой подгруппы пациентов выявлена достоверная взаимосвязь концентраций Лп (а) и PCSK9 только у пациентов с НМФ апо (а) (рис. 2).
По данным многофакторного регрессионного анализа с введением в модель пола, возраста, уровня ОХС и фенотипа апо (а), в общей группе пациентов независимыми предикторами уровня PCSK9 были концентрация Лп (а) в плазме (r=0,224; p=0,01) и пол пациентов (r=0,176; p=0,04). В отдельных группах с различными фенотипами апо (а) только у пациентов с НМФ апо (а) концентрация Лп (а) (r=0,527; p=0,0001) была связана с уровнем циркулирующего PCSK9 (табл. 3).
Уровень аутоАТ к ЛНП и Лп (а), а также к их окисленным модификациям, не был связан с концентрацией PCSK9 и не различался в подгруппах пациентов с различным фенотипом апо (а).
Обсуждение
Положительная взаимосвязь уровней циркулирующих в крови PCSK9, ХС ЛНП и ОХС выявлена несколькими исследователями [15, 16]. Однако уровень PCSK9 колеблется в очень широком диапазоне и только на 7% объясняет вариабельность уровня ХС ЛНП [7, 16].
Результаты клинических испытаний препаратов гуманизированных АТ против PCSK9 выявили достоверное изменение в концентрации не только ХС ЛНП, но и Лп (а) в сыворотке крови пациентов [8, 9]. Механизм такого влияния препаратов МкАТ к PCSK9 на концентрацию Лп (а) непонятен, поскольку участие рецептора ЛНП в клиренсе Лп (а) не выявлено в большинстве исследований как in vitro, так и in vivo [10, 11]. Кроме того, препараты МкАТ к PCSK9 вызывают снижение концентрации Лп (а) на 20% у пациентов с гомозиготной СГХС с дефектом рецепторов ЛНП [17].
В нашей работе показано, что концентрация PCSK9 не связана с концентрацией Лп (а) в общей группе пациентов с впервые выявленной тяжелой гиперлипидемией, как и с другими липидными показателями и уровнем аутоАТ к содержащим апоВ-100 липопротеидам и их окисленным модификациям. Не обнаружено достоверных различий по уровню PCSK9 и у пациентов с различным фенотипом апо (а). Однако мы обнаружили, что у пациентов с НМФ апо (а) уровень PCSK9 статистически значимо ассоциировался с концентрацией Лп (а). Подобные результаты получены в недавнем исследовании, показавшем достоверную взаимосвязь (r=0,50; p<0,0001) концентрации Лп (а) в плазме крови и уровня PCSK9 после поправки на пол и возраст у 39 пациентов с гиперЛп (а)-липопротеидемией (концентрация Лп (а) 39—320 мг/дл). Большинство пациентов, вошедших в исследование, имели НМФ апо (а) — среднее количество повторов крингла КIV2, определяющих размер молекулы апо (а), составило 11±5 [18], что соответствует апо (а) молекулярной массой менее 460 кДа.
Согласно данным разных исследователей, почти 40% PCSK9 может быть связано с ЛНП [19, 20]. Значительное снижение уровня PCSK9, связанного с ЛНП, отмечено и после проведения процедур афереза ЛНП у пациентов с ГХС с использованием каскадной плазмофильтрации или сорбции на колонках с декстран-сульфатом [21, 22].
Комплекс PCSK9 с Лп (а) недавно обнаружен в плазме крови пациентов с повышенной концентрацией Лп (а), при этом PCSK9 был связан с частицами Лп (а) в большей степени, чем с ЛНП. Одно из возможных объяснений, высказанных авторами, — это более продолжительное время полужизни Лп (а) по сравнению с ЛНП [18]. Таким образом, избирательность во взаимосвязи концентрации PCSK9 и Лп (а) может объясняться преимущественным образованием комплекса PCSK9 и Лп (а) с апо (а) с меньшей молекулярной массой, во-первых, за счет более продолжительной циркуляции Лп (а) с НМ апо (а) [23], а во-вторых, возможной большей стерической доступностью ЛНП-подобной частицы, которая, по-видимому, участвует в образовании комплекса с PCSK9 [18].
Преимущественное образование такого комплекса Лп (а) и PCSK9 в активной форме может приводить к более высокому риску возникновения атеросклероза и развития ИБС у пациентов с НМФ апо (а), вне зависимости от концентрации Лп (а) [24—26].
Заключение
Впервые показано, что наличие НМФ апо (а) определяло взаимосвязь концентраций Лп (а) и PCSK9 в сыворотке крови у пациентов с тяжелой ГХС. Полученные результаты свидетельствуют о возможном различии в катаболизме и свойствах частиц Лп (а) в зависимости от фенотипа апо (а). Дальнейшее изучение взаимосвязи Лп (а) и PCSK9, а также механизмов влияния терапевтических препаратов — ингибиторов PCSK9 на уровень Лп (а) является, по нашему мнению, одним из перспективных направлений как фундаментальных, так и клинических исследований.
Работа выполнена при поддержке IAS/Pfizer Independent Grant for Learning & Change, AstraZeneca (SSCRES0179), ООО «Амджен».
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Сведения об авторах
Афанасьева Ольга Ильинична — д.б.н., в.н.с. лаб. проблем атеросклероза Института экспериментальной кардиологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии» Минздрава РФ, Москва, Россия. Адрес для переписки: 121552 Москва, ул. 3-я Черепковская 15а, Институт экспериментальной кардиологии ФГБУ «НМИЦ кардиологии» МЗ РФ, тел. +7(495) 414-67-32. E-mail: afanasieva.cardio@yandex.ru
Разова Оксана Андреевна — н.с. лаб. проблем атеросклероза Института экспериментальной кардиологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии» Минздрава РФ, Москва, Россия. Адрес для переписки: 121552 Москва, 3-я Черепковская 15а, Институт экспериментальной кардиологии ФГБУ «НМИЦ кардиологии» МЗ РФ, тел. +7(495) 414-67-32. E-mail: oarazova@yandex.ru
Уткина Елена Анатольевна — к.х.н., с.н.с. лаб. проблем атеросклероза института экспериментальной кардиологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии» Минздрава РФ, Москва, Россия. Адрес для переписки: 121552 Москва, ул. 3-я Черепковская 15а, Институт экспериментальной кардиологии ФГБУ «НМИЦ кардиологии» МЗ РФ, тел. +7(495) 414-67-32. E-mail: utkelena@yandex.ru
Афанасьева Марина Ильинична — н.с. лаб. проблем атеросклероза института экспериментальной кардиологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии» Минздрава РФ, Москва, Россия. Адрес для переписки: 121552 Москва, 3-я Черепковская 15а, Институт экспериментальной кардиологии ФГБУ «НМИЦ кардиологии» МЗ РФ, тел. +7(495) 414-67-23.
Клесарева Елена Александровна — к.т.н., н.с. лаб. проблем атеросклероза института экспериментальной кардиологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии» Минздрава РФ, Москва, Россия. Адрес для переписки: 121552 Москва, 3-я Черепковская 15а, Институт экспериментальной кардиологии ФГБУ «НМИЦ кардиологии» МЗ РФ, тел. +7(495) 414-67-23. E-mail: hea@mail.ru
Попова Анна Борисовна — аспирант отдела проблем атеросклероза института клинической кардиологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии» Минздрава РФ, Москва, Россия. Адрес для переписки: 121552 Москва, ул. 3-я Черепковская 15а, Институт клинической кардиологии ФГБУ «НМИЦ кардиологии» МЗ РФ, тел. +7(495) 414-60-67. E-mail: anna.b.popova@gmail.com
Ежов Марат Владиславович — д.м.н., в.н.с. отдела атеросклероза института клинической кардиологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии» Минздрава РФ, Москва, Россия. Адрес для переписки: 121552 Москва, ул. 3-я Черепковская 15а, Институт клинической кардиологии ФГБУ «НМИЦ кардиологии» МЗ РФ, тел. +7(495) 414-60-67. E-mail: marat_ezhov@mail.ru