Ткани, фиксированные в формалине и залитые в парафин (formalin-fixed paraffin-embedded tissue, FFPE), являются ценным биологическим материалом не только в диагностической, но и в научной работе, поскольку обеспечивают возможность ретроспективного изучения патологических процессов [1]. Кроме того, данный способ обработки биоматериала является недорогим и доступным для применения в большинстве патоморфологических лабораторий. Однако, несмотря на широкое распространение молекулярно-генетических анализов, исследование ДНК и РНК, выделенных из FFPE-блоков, имеет ряд ограничений. Так, одной из ключевых проблем является сохранность макромолекул, выделяемых из парафиновых блоков. Еще на этапе фиксации ткани формалином возникают внутри- и межмолекулярные метиленовые сшивки между аминокислотами (как свободными, так и в составе белков), нуклеиновыми кислотами, а также между аминокислотами и нуклеиновыми кислотами [2]. Возникающие химические модификации способствуют фрагментации нуклеиновых кислот при выделении ДНК и ингибируют процесс амплификации при проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) [3]. Скорость образования данных соединений зависит от концентрации и pH фиксирующего раствора, а также времени фиксации. Так, показано, что скорость деградации ДНК увеличивается с ростом концентрации формальдегида [4]. Фиксация образцов при низком pH или в присутствии муравьиной кислоты снижает эффективность дальнейшей амплификации нуклеиновых кислот: по сравнению с нейтральным забуференным формалином ткани, зафиксированные в растворе формальдегида при pH 3,0, имели большее количество искусственных мутаций [5]. Что касается времени фиксации, было показано, что средний размер фрагментов выделенной ДНК, фиксированных в забуференном формалине, уменьшается при продолжительной фиксации; фиксация образцов в течение 3—6 ч позволяет выделять большее количество высокомолекулярной ДНК [5]. Изучалось влияние и других факторов на деградацию нуклеиновых кислот в парафиновых блоках. Показано, что хранение FFPE-блоков при температуре −20 °C способствует большей сохранности нуклеиновых кислот даже при многократном замораживании и оттаивании образцов [6]. Таким образом, проблема сохранности макромолекул в FFPE-блоках является многофакторной и требует соблюдения строгих методологических подходов при выделении ДНК и РНК [7—9].

Важным аспектом является выбор оптимального метода анализа ДНК архивных FFPE-образцов. Одним из наиболее распространенных подходов является спектрофотометрия, которая является простой и быстрой в использовании, однако она определяет общую концентрацию ДНК в образце без учета белковых примесей, завышая количество функциональной (амплифицируемой) ДНК [10]. Флуориметрический метод обладает большей специфичностью, но также не отражает способность ДНК к амплификации. Количественная ПЦР в режиме реального времени позволяет напрямую измерить концентрацию амплифицируемых копий ДНК, что обеспечивает более надежную оценку пригодности образцов для дальнейшего молекулярно-генетического анализа. На сегодняшний день существуют более высокочувствительные методы, адаптированные для работы с крайне низкими концентрациями ДНК или при ее выраженной фрагментации, такие как цифровая ПЦР и секвенирование следующего поколения (next generation sequencing, NGS), однако их внедрение в клиническую практику ограничено из-за высокой стоимости оборудования и сложной интерпретации данных.

В литературе имеются противоречивые данные о сохранности нуклеиновых кислот в зависимости от сроков хранения парафиновых блоков. Так, в работе T. Watanabe и соавт. проанализирована концентрация выделенной ДНК 46 архивных FFPE-блоков, полученных при хирургическом удалении карцином легкого, толстой кишки и урогенитального тракта, хранившихся от 4 до 6 лет, спектрофотометрическим методом [11]. Ранее из данных блоков уже проводили выделение ДНК, после повторного выделения в идентичных условиях было показано уменьшение концентрации ДНК на 53% в образцах после хранения. Кроме того, при проведении количественной ПЦР доля амплифицируемой фракции ДНК составила 11% от исходного количества. Напротив, в работе A.C. Nechifor-Boilă и соавт. [7] продемонстрирована сохранность ДНК, выделенной из FFPE-блоков, с течением времени. Авторы проанализировали 83 FFPE-блока образцов рака щитовидной железы и почки, хранившихся от 2 до 8 лет, спектрофотометрическим методом. Значимых различий между образцами, хранившимися 2—3 года и 7—8 лет по концентрации выделенной ДНК, не выявлено (p=0,196). Необходимо отметить, что в литературе имеются единичные работы, посвященные изучению концентрации выделенной ДНК в зависимости от сроков хранения парафиновых блоков рака шейки матки, что стало целью настоящего исследования.

Материал и методы

Объектом исследования являлись образцы архивных парафиновых блоков операционного материала от 68 пациенток с верифицированным раком шейки матки, включая эндоцервикальную аденокарциному (n=46) и аденоплоскоклеточный рак (n=22) (рис. 1). В исследование включали образцы парафиновых блоков с суммарной площадью поверхности среза 0,5—1,5 см². В процессе работы 6 образцов, содержащие недостаточное количество ткани в парафиновых блоках для проведения дальнейших анализов, были исключены из исследования.

Рис. 1. Блок-схема отбора образцов.

Все образцы фиксировали в одной лаборатории в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 24 ч с последующей однотипной гистологической проводкой и заливкой в парафин. Все этапы преаналитической обработки образцов были стандартизированы в соответствии с Приказом Минздрава РФ от 14.04.25 № 207н «Об утверждении Правил проведения патолого-анатомических исследований и унифицированных форм медицинской документации, используемых при проведении прижизненных патолого-анатомических исследований», что минимизировало вариабельность на начальных этапах. Парафиновые блоки хранились при комнатной температуре. Препараты, окрашенные гематоксилином и эозином, изучали под световым микроскопом Leica DM4000B (компонент интерактивной микроскопической системы (441-2010), приобретенной по Программе развития МГУ, ID 9351706). С каждого образца было получено по 2 среза толщиной 10 мкм, которые помещали в микроцентрифужные пробирки Eppendorf объемом 1,5 мл стерильным пинцетом.

Выделение ДНК из парафиновых блоков проводилось методом фенол-хлороформной экстракции с использованием коммерческого набора для выделения ДНК (ООО «БиоЛинк», Россия) согласно инструкции производителя. Образцы выделенной ДНК хранили при –20 °C. Оценка количества выделенной ДНК гена HER/neu проводилась in vitro методом ПЦР в режиме реального времени с использованием коммерческого набора Real-time-PCR-HER2/neu (ООО «БиоЛинк», Россия). Образцы выделенной ДНК тестировали на амплификаторе «CFX96» (BioRad, США) в объеме 25 мкл по следующему протоколу: 1 цикл — 95 °C 3 мин; 45 циклов — 95 °C 10 с, 60 °C 30 с. Реакционная смесь содержала буфер для Taq ДНК полимеразы по 0,5 мМ дезоксинуклеозидтрифосфатов dATP, dGTP, dTTP, dCTP (ООО «Биосан», Россия), 5 мМ MgCl₂, по 0,5 мкМ прямого и обратного праймеров (ООО «БиоЛинк», Россия), TaqMan зонд (ООО «ДНК синтез», Россия), 1ед. акт. Taq ДНК-полимеразы (ООО «БиоЛинк», Россия) и 2 мкл ДНК матрицы. Продукты ПЦР гена HER/neu идентифицировали в 5’-экзонуклеазной реакции с помощью зонда, меченного флуорофором ROX. Количество ДНК оценивали по величине Ct, соответствующей количеству циклов ПЦР, при которых кривая флюоресценции пересекает заданный уровень фона. Значения Ct образцов сравнивали с таковыми Ct ДНК стандартов, приготовленных с использованием ДНК плаценты человека с известной концентрацией. Концентрацию ДНК плаценты человека определяли по оптической плотности при 260 нм на спектрофотометре Nanodrop (ThermoFischer, США). Пороговым значением концентрации выделенной ДНК считали 0,2 нг/мкл.

Статистическая обработка и визуализация данных выполнены на языке программирования Python при помощи библиотек pandas, scipy, seaborn, matplotlib, statsmodels. Для проверки данных на нормальность распределения использовался тест Шапиро—Уилка. Все показатели имели ненормальное распределение и были представлены в виде медианы и 25-го и 75-го процентилей. Для проверки на гомогенность дисперсий использовался тест Левена, для анализа межгрупповых различий — непараметрический тест Краскела—Уоллиса. При проведении множественных сравнений использовался критерий Манна—Уитни с поправкой Бонферрони.

Результаты

Оценка количества выделенной ДНК

Используя калибровочную кривую, полученную при серийных разведениях стандартов ДНК с концентрациями 0,2, 2 и 20 нг/мкл, рассчитывали количество амплифицируемой ДНК для каждого образца (рис. 2, а, б).

Рис. 2. Кривые флюоресценции ДНК стандартов с концентрациями 0,2, 2, 20 нг/мкл и образцов выделенной ДНК в количественной ПЦР.

а — кривая флюоресценции образца выделенной ДНК с концентрацией 1 нг/мкл; б — кривая флюоресценции образца выделенной ДНК с концентрацией 10 нг/мг

Согласно полученным результатам, количество образцов с концентрацией выделенной ДНК, превышающей пороговое значение (более 0,2 нг/мкл), составило 23/62 (37,1%). Количество образцов с концентрацией ДНК, достигающей порогового уровня (2 нг/мкл и менее), составило 39/62 (62,9%). При сравнении медианных значений концентрации выделенной ДНК в группе эндоцервикальных аденокарцином (n=43) и в группе аденоплоскоклеточных раков (n=19) значимых различий не выявлено (p=0,812013).

Анализ зависимости количества выделенной ДНК от сроков хранения парафиновых блоков

Для сравнительного анализа все образцы были разделены на группы в зависимости от сроков хранения парафиновых блоков: от 0 до 5 лет (1-я группа), от 5 до 8 лет (2-я группа), от 8 до 10 лет (3-я группа). Медиана концентрации ДНК, выделенной из FFPE-блоков, для 1-й группы (0—5 лет) составила 10,00 нг/мкл (2,70—10.00), для 2-й группы (5—8 лет) — 0,20 нг/мкл (0,20—0,40), для 3-й группы (8—10 лет) — 0,20 нг/мкл (0,20—0,20) (рис. 3).

Рис. 3. Распределение концентрации ДНК в зависимости от сроков хранения парафиновых блоков.

При сравнении концентрации выделенной ДНК в 1-й (0—5 лет) и во 2-й группах (5—8 лет), а также в 1-й (0—5 лет) и 3-й группах (8—10 лет) выявлены статистически значимые различия: концентрация ДНК с увеличением срока хранения снижается в 50 раз (p=0,019631 и p=0,000003 соответственно). При сравнении концентрации выделенной ДНК во 2-й (5—8 лет) и 3-й группах (8—10 лет) статистически значимых различий не обнаружено (p=0,820232) (см. таблицу).

Значения концентраций ДНК в исследуемых группах и сроки хранения парафиновых блоков (n=62)

Исследование динамики концентрации выделенной ДНК со временем

Для исследования динамики концентрации ДНК парафиновых блоков со временем 2-я (5—8 лет) и 3-я группы (8—10 лет) были объединены ввиду отсутствия между ними статистической значимости. В группе образцов со сроком хранения 0—5 лет (n=11) медиана концентрации составила 10,0 нг/мкл (2,70—10,00), в группе образцов со сроком хранения более 5 лет (n=51) медиана концентрации составила 0,20 нг/мкл (0,20—0,30) (рис. 4).

Рис. 4. Распределение концентрации ДНК парафиновых блоков в группах со сроками хранения 0—5 и более 5 лет.

Таким образом, при сравнении медианных значений с использованием критерия Манна—Уитни снижение концентрации ДНК с течением времени составило 9,80 нг/мкл (98%) (p<0,01).

Обсуждение

Согласно полученным результатам, концентрация ДНК парафиновых блоков рака шейки матки, хранящихся на протяжении 5 лет, снижается в 50 раз (с 10,00 до 0,20 нг/мкл), что соответствует потере 98% ее амплифицируемой фракции. При этом значимых различий по концентрации выделенной ДНК между группами со сроком хранения 5—8 и 8—10 лет не выявлено, т.е. согласно нашим данным, концентрация ДНК в образцах длительного периода хранения (более 5 лет) достигает порогового уровня, который может быть детектирован методом количественной ПЦР в реальном времени. Такое значимое снижение концентрации, вероятно, связано с прогрессирующей фрагментацией ДНК в результате накопления формалин-индуцированных сшивок, что становится особенно критичным при отсутствии контроля температуры в первые несколько лет хранения образцов. Аналогичные данные были получены в вышеупомянутой работе [11], в которой авторы продемонстрировали значимое снижение концентрации ДНК, выделенной из 46 архивных образцов карцином легкого, толстой кишки и урогенитального тракта, хранившихся от 4 до 6 лет, по сравнению с изначальной концентрацией ДНК тех же образцов. Напротив, авторы большинства исследований сообщают о сохранности выделенной ДНК с течением времени. В работе A. Nechifor-Boilă и соавт. [7] не выявлено статистически значимых различий между образцами, хранившимися 2—3 года, 4—6 и 7—8 лет по концентрации выделенной ДНК (p=0,196). В другой работе A. Nechifor-Boilă и соавт. [8] исследовали концентрацию ДНК 212 архивных FFPE-блоков рака щитовидной железы, хранящихся в архиве в течение 10 лет, спектрофотометрическим методом, при этом также не обнаружено статистически значимых различий по концентрациям ДНК среди блоков разных периодов хранения (p=0,374). Исследование S. Begum и соавт. [12], посвященное архивным образцам плоскоклеточного рака полости рта, хранившихся до 11 лет, демонстрирует аналогичные результаты: было проанализировано 40 образцов парафиновых блоков, среднее значение концентрации выделенной ДНК составило для 1-й группы (2006—2008 гг.) 88,76±88,45 нг/мкл, для 2-й группы (2009—2012 гг.) 89,84±147,80 нг/мкл, для 3-й группы (2013—2016 гг.) 77,69±93,48 нг/мкл и для 4-й группы (2017г.) 85,01±161,23 нг/мкл, т.е. согласно полученным результатам, срок хранения не влияет на сохранность ДНК (p=0,996). В работе T.J. Kokkat и соавт. [1] исследовали архивные парафиновые блоки рака легкого, щитовидной и слюнных желез. Было продемонстрировано отсутствие различий в концентрациях ДНК между парафиновыми блоками, хранившимися в идентичных условиях в течение 11—12, 5—7 лет и 1—2 года, в сравнении с образцами, сохраняющимися на протяжении 4—9 мес (p>0,05). В литературе имеются единичные работы, посвященные изучению сохранности ДНК в архивных парафиновых блоках рака шейки матки. Так, в работе S. Nicolás-Párraga и соавт. [9] сравнивали эффективность амплификации ДНК, выделенной из FFPE-блоков в группах, хранившихся на протяжении длительного времени — 15 и 85 лет. В блоках 15-летней давности амплифицировались с одинаковой эффективностью как короткие (длиной 65—134 п.н.), так и длинные фрагменты ДНК, при этом в блоках 85-летней давности наблюдается значительное снижение эффективности амплификации длинных фрагментов ДНК, что подчеркивает необходимость оптимизации условий проведения ПЦР при исследовании ДНК образцов длительного срока хранения.

Таким образом, данные литературы демонстрируют противоречивые результаты — одни авторы сообщают о заметном снижении концентрации выделенной ДНК архивных парафиновых блоков уже через несколько лет. При этом большинство авторов указывают данные о сохранности ДНК с течением длительного времени. Эти несоответствия, вероятно, могут быть обусловлены разными условиями на преаналитическом этапе (условия фиксации и проводки материала, а также хранения парафиновых блоков), различиями в методиках оценки количества и качества ДНК, вариациями условий проведения ПЦР (исследование ампликонов разной длины и др.) [13].

Заключение

Таким образом, для отбора образцов архивных парафиновых блоков рака шейки матки на молекулярно-генетическое исследование необходимо учитывать срок их хранения. Для блоков, хранящихся менее 5 лет, могут быть применены стандартные протоколы выделения и амплификации ДНК, тогда как работа с образцами более длительного срока хранения требует соблюдения ряда критически важных параметров, включая условия преаналитического этапа, температуру хранения парафиновых блоков, оптимизацию условий выделения и амплификации ДНК, а при необходимости использование высокочувствительных методик, рассчитанных на работу с низкими концентрациями матрицы или фрагментированной ДНК (например, цифровая ПЦР или секвенирование следующего поколения). Разработка и внедрение стандартизированных протоколов хранения и экстракции ДНК, а также методик ее последующего анализа являются ключевыми условиями успешного ретроспективного анализа архивных парафиновых блоков.

Работа выполнена за счет гранта Российского научного фонда № 25-25-00636.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Колина А.Д., Олейникова Н.А., Данилова Н.В., Андреева Ю.Ю.

Сбор и обработка материала — Колина А.Д.

Статистическая обработка —Колина А.Д.

Написание текста — Колина А.Д.

Редактирование — Олейникова Н.А., Данилова Н.В, Андреева Ю.Ю.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.