Диагностика первичного миелофиброза и эссенциальной тромбоцитемии имеет критериальный характер, и согласно 5-му изданию Классификации ВОЗ опухолей гемопоэтической и лимфоидной тканей гистологическое исследование трепанобиоптатов костного мозга служит «большим» диагностическим критерием [1].

Чувствительность гистологического метода исследования в диагностике этой группы болезней варьирует от 32,5 до 75%, специфичность — 92—98% в зависимости от заболевания [2].

Несмотря на возросшую роль гистологического исследования в постановке диагноза, данные литературы свидетельствуют о недостаточной воспроизводимости результатов оценки изменений в трепанобиоптатах костного мозга. Дифференциальная диагностика миелопролиферативных новообразований вызывает трудности даже у опытных специалистов — совпадение диагностического мнения 3 экспертов при интегральной оценке патоморфологических изменений в биоптатах костного мозга отмечается лишь в ¹/₂ случаев [3]. О субоптимальной воспроизводимости диагнозов в группе Ph-негативных миелопролиферативных новообразований свидетельствует публикация U. Gianelli и соавт. [4]. При микроскопическом исследовании биопсий костного мозга больных эссенциальной тромбоцитемией и первичным миелофиброзом мнение 3 из 4 участников исследования совпало в 89% случаев первичного миелофиброза и лишь в 59% — эссенциальной тромбоцитемии.

Объективные сложности патоморфологической дифференциальной диагностики первичного миелофиброза и эссенциальной тромбоцитемии связаны с большим количеством субъективных и трудноразличимых признаков. Некоторые из этих признаков, например изменения мегакариоцитарного ростка, имеют комплексный характер (рис. 1) [5, 6]. Отсутствие ранжирования дифференциальных патоморфологических аномалий по значимости приводит к тому, что разные специалисты могут не только по-разному интерпретировать отдельные изменения, но и придавать их комбинациям различный вес [7].

Рис. 1. Гистотопографические и морфологические аномалии мегакариоцитарного ростка.

а — первичный миелофиброз: мегакариоциты с гиполобулярными облаковидными ядрами сгруппированы в тесно сомкнутые группы; б — эссенциальная тромбоцитемия: мегакариоциты с гиперлобулярными ядрами типа рогов оленя формируют разреженные скопления. Окраска гематоксилином и эозином, ×200.

Отсутствие стандартизации гистологического исследования костного мозга у больных миелопролиферативными новообразованиями, субъективизм интерпретации частоты встречаемости и степени выраженности изменений того или иного признака приводят к необходимости поиска дополнительных, более объективных патоморфологических признаков, не зависящих от индивидуальных особенностей исследователя, что и определило цель этой работы.

Цель исследования — в диагностических трепанобиоптатах костного мозга больных первичным миелофиброзом и эссенциальной тромбоцитемией оценить и сопоставить морфометрические и гистотопографические показатели мегакариоцитарного ростка в микропрепаратах, окрашенных гематоксилином и эозином или антителами к CD42b. Далее были проанализированы размеры CD42b-позитивных мегакариоцитов, а также их количество в 1 мм² площади среза, изучены возможности дифференциальной оценки этих показателей в качестве дополнительного диагностического критерия.

Материал и методы

В патолого-анатомическом отделении клинической молекулярной морфологии СЗГМУ им. И.И. Мечникова Минздрава России были отобраны для исследования 108 трепанобиоптатов костного мозга больных первичным миелофиброзом (n=53) и эссенциальной тромбоцитемией (n=55) с мутацией JAK2 или CALR. У всех пациентов, включенных в исследование, выполняли молекулярно-генетическое исследование: JAK2V617F-статус оценивали с помощью метода полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, мутацию гена CALR определяли, используя метод прямого секвенирования по Сэнгеру, на автоматической капиллярной системе MegaBACE 1000 DNA Analysis System («Amersham Biosciences», Великобритания).

Объектом исследования служили срезы трепанобиопсий костного мозга, окрашенные гематоксилином и эозином, а также антителами к CD42b (клон EP409). Гистологические препараты переводили в цифровой формат с помощью сканирующего микроскопа Pannoramic 250 Flash III («3DHISTECH», Венгрия). В отсканированных гистологических препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, в программе SlideViewer выделяли все мегакариоциты на срезе, вычисляли их количество в 1 мм² площади среза миелоидной ткани, а также проводили морфометрическую оценку средней величины площади и периметра 100 случайно выбранных мегакариоцитов. В оцифрованных гистологических препаратах, окрашенных антителами к CD42b, выделяли 10 полей зрения площадью 0,1 мм² каждое с визуально наибольшей плотностью расположения мегакариоцитов. В отобранных полях зрения вручную обводили все CD42b-позитивные мегакариоциты, подсчитывали их количество. Параметрами сравнения служили средние значения периметра и площади мегакариоцитов в сечении, а также среднее количество мегакариоцитов в одном поле зрения. Для описания связи характеристик маркированных антителами к CD42b мегакариоцитов и заболевания (первичный миелофиброз или эссенциальная тромбоцитемия) использовали логистический регрессионный анализ.

Статистическую обработку данных проводили с использованием непараметрических методов статистики — критерия Краскела—Уоллиса. Данные приведены в виде среднего значения, стандартного отклонения, а также минимального и максимального значений.

Результаты исследования

Выполненное ручное морфометрическое исследование мегакариоцитов в гистологических препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, а также антителами к CD42b, продемонстрировало в группах сравнения статистически значимые различия средних значений (стандартное отклонение — СО) количества мегакариоцитов в 1 мм² площади среза и величины периметра мегакариоцитов (СО), данные приведены в табл. 1.

Таблица 1. Количественные и структурные характеристики мегакариоцитов в срезах костного мозга, окрашенных гистологическими красителями или антителами к CD42b

Примечание. Для сравнения независимых выборок применен критерий Краскела—Уоллиса.

Для выявления связи между характеристиками мегакариоцитарного ростка, маркированного антителами к CD42b, и диагнозом был использован метод логистической регрессии, в котором зависимая переменная принимает значение 0 («эссенциальная тромбоцитемия») или 1 («первичный миелофиброз»). Характеристики переменных, включенных в модель логистической регрессии: количество мегакариоцитов в 1 мм² площади среза — отношение шансов 1,245 (95% ДИ 1,137—1,389; p<0,0001), площадь мегакариоцита — отношение шансов 1,119 (95% ДИ 1,018—1,250; p=0,8935), периметр мегакариоцита — отношение шансов 0,999 (95% ДИ 0,990—1,008; p=0,0296). Значимость модели логистической регрессии с включением отобранных параметров равна χ²=46,767, p=0,001, Nagelkerke R²=46,9%.

Как видно из табл. 2, точность модели логистической регрессии с включенными независимыми переменными составляет 76,85%.

Таблица 2. Процент корректных предсказаний диагноза на основе переменных, включенных в модель логистической регрессии

Общая оценка согласия модели и реальных данных оценивалась с использованием теста согласия Хосмера—Лемешова (χ²=2,164, число степеней свободы=8, p=0,9755).

Для демонстрации зависимости количества верно классифицированных диагнозов одного заболевания от количества неверно классифицированных диагнозов другого заболевания был проведен ROC-анализ (рис. 2). Площадь под ROC-кривой составила 0,84 (95% ДИ 0,7782—0,9199); p<0,0001.

Рис. 2. Кривая ошибок (операционная характеристика приемника) для оценки эффективности модели логистической регрессии.

Вычисление оптимального порогового значения количества мегакариоцитов в 1 мм² площади среза, а также средней площади и периметра мегакариоцитов проводили с помощью следующей формулы: [(1 — чувствительность)+(1 — специфичность)]. Графически это выглядит как сочетание чувствительности и специфичности, наиболее близко расположенное к точке (0; 1) кривой ошибок каждого исследованного показателя на диаграмме [8].

Рассчитаны оптимальные дифференциальные пороговые значения средних величин площади и периметра CD42b-позитивных мегакариоцитов, а также их количество в 1 мм² площади среза, позволяющие разграничить первичный миелофиброз и эссенциальную тромбоцитемию, — 566 мкм² (p=0,0098), 92 мкм (p=0,0017) и 170 мегакариоцитов в 1 мм² площади среза соответственно (<0,0001).

Превышение пороговых значений количества мегакариоцитов в 1 мм² площади среза, а также их размеров достоверно чаще наблюдали в гистологических препаратах костного мозга больных первичным миелофиброзом. Пороговые значения количества мегакариоцитов в одном поле зрения при увеличении в 400 раз приведены в табл. 3.

Обсуждение

Для поиска дополнительных морфологических дифференциально-диагностических критериев первичного миелофиброза и эссенциальной тромбоцитемии было выполнено иммуногистохимическое исследование с антителами к CD42b (клон EP409). Результаты исследования подтверждают данные J. Thiele и R. Fischer [9] о том, что применение иммуногистохимического метода кратно увеличивает количество обнаруженных мегакариоцитов. Полученные статистически значимые различия средней величины периметра мегакариоцитов в срезах, окрашенных гистологическими красителями или антителами к CD42b, не могут считаться клинически значимыми, так как столь малая разница значений показателя неразличима человеческим глазом.

Основная задача анализа гистологических препаратов костного мозга, окрашенных антителами к CD42b, заключалась в поиске морфологических признаков, подходящих для дифференциальной диагностики. С этой целью была построена модель логистической регрессии, точность которой достигла 76,85%. Площадь под кривой ошибок (операционная характеристика приемника) равна 0,84 (95% ДИ 0,7782—0,9199), свидетельствует об очень хорошем качестве модели согласно экспертной шкале AUC (см. рис. 2) [10, 11]. Анализ ROC-кривой позволил рассчитать пороговые значения размеров мегакариоцитов, а также их количество в поле зрения, позволяющие дифференцировать первичный миелофиброз и эссенциальную тромбоцитемию.

Визуальная оценка врачом-патологоанатомом размеров мегакариоцитов, экспрессирующих CD42b, в гистологическом препарате не может рассматриваться в качестве воспроизводимого диагностического признака в практической работе, так как трудоемка и требует наличия окулярной морфометрической сетки или окулярной измерительной линейки. В связи с этим представляет интерес количественный подсчет CD42b-позитивных мегакариоцитов в участках их наибольших скоплений, так как этот критерий достаточно понятен и прост в интерпретации (рис. 3).

Рис. 3. Кластеры мегакариоцитов маркированы антителами к CD42b, ×300.

а — эссенциальная тромбоцитемия; б — первичный миелофиброз.

В табл. 3 представлены пороговые значения количества CD42b-позитивных мегакариоцитов в одном поле зрения при увеличении в 400 раз у больных первичным миелофиброзом и эссенциальной тромбоцитемией. Например, при диаметре поля зрения микроскопа 0,55 мм и увеличении в 400 раз обнаружение в наиболее информативных участках миелоидной ткани более 40 мегакариоцитов в одном поле зрения свидетельствует в пользу первичного миелофиброза.

Таблица 3. Пороговые значения количества CD42b-позитивных мегакариоцитов в одном поле зрения при увеличении в 400 раз у больных первичным миелофиброзом и эссенциальной тромбоцитемией

Заключение

Выявленные статистически значимые различия количества мегакариоцитов в 1 мм² площади среза, а также средней величины периметра мегакариоцитов позволили вычислить дифференциальные пороговые значения характеристик мегакариоцитарного ростка миелоидной ткани в диагностических трепанобиоптатах костного мозга у больных первичным миелофиброзом и эссенциальной тромбоцитемией. В качестве дополнительного патоморфологического дифференциально-диагностического признака предложен подсчет количества CD42b-позитивных мегакариоцитов в одном поле зрения при увеличении в 400 раз.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Асауленко З.П., Криволапов Ю.А.

Сбор и обработка материала — Асауленко З.П., Криволапов Ю.А.

Написание текста — Асауленко З.П., Криволапов Ю.А.

Редактирование — Криволапов Ю.А

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.