На сегодняшний день, несмотря на непроходящий интерес исследователей, проблему патогенеза стенозирования носослезного протока нельзя считать решенной. Существующие теории лишь частично объясняют причины, приводящие к развитию этого состояния. В последнее время принято считать, что причинами, определяющими патогенез стенозирования носослезного протока, являются вазоконстрикция, отек на фоне воспаления и, как следствие, переход процесса в хроническое состояние с последующим развитием фиброплазии слизистой оболочки и подслизистых структур носослезного протока [1].

Очевидно, развитие стенозирования носослезного протока происходит не одномоментно, а последовательно усиливается. Клинически это проявляется нарастанием выраженности слезотечения, появлением слизистого, а затем гнойного отделяемого. J. Lee и соавт. [2] показали, что по мере развития заболевания нарастает супрастенотическая эктазия носослезного протока. Патоморфологическое описание этого процесса неполно, а данные одних исследователей часто входят в противоречие с результатами, полученными другими авторами [3, 4].

В настоящей работе был проведен морфологический анализ биоптатов носослезного протока пациентов с дакриостенозом, полученных на различных стадиях заболевания, определенных на основании клинической картины.

Цель исследования — патоморфологическое описание процесса стенозирования носослезного протока на разных стадиях процесса.

Материал и методы

Исследование проведено на базе отделения патологии слезного аппарата ФГБНУ «НИИ глазных болезней им. М.М. Краснова» после получения одобрения локального комитета по биомедицинской этике. Во всех случаях получено согласие пациентов на лечение, а также на участие в исследовании. Методология исследования соответствовала нормам Хельсинкской декларации 1964 г. с учетом более поздних дополнений, а также другим нормам международного и национального права.

В исследование вошли 50 пациентов с дакриостенозом (40 женщин и 10 мужчин) в возрасте от 39 до 72 лет (средний — 56±9 лет). Всем пациентам проведено клиническое обследование, а также КТ с контрастированием слезоотводящих путей, по данным которой подтверждали факт наличия облитерации слезоотводящих путей, ее локализацию, а также биометрические параметры слезного мешка и носослезного протока, отдельно отмечая наличие супрастенотической эктазии как признак длительности течения патологического процесса, а также его выраженность. По результатам КТ, а также данным клинического обследования все случаи были отнесены к одной из условных стадий процесса: к 1-й стадии — 11 случаев, когда у пациентов имелось слезотечение, выраженность которого соответствовала 1—2 баллам по шкале Munk, отсутствовали отделяемое из слезоотводящих путей и супрастенотическая эктазия носослезного протока; ко 2-й стадии — 18 случаев, когда у пациентов имелись слезотечение, составившее 1—2 балла по шкале Munk, периодическое отделяемое из слезоотводящих путей и супрастенотическая эктазия носослезного протока; к 3-й стадии — 21 случай, выраженность слезотечения >2 баллов по шкале Munk, периодическое или постоянное отделяемое из слезоотводящих путей, которое беспокоило пациента более 36 мес, а также супрастенотическая эктазия носослезного протока. Критерием включения в исследование было наличие проходимости слезоотводящих путей той или иной степени. В случае присутствия у пациента признаков, характерных для двух условных стадий процесса, его из исследования исключали.

Материал для исследования (фрагменты стенки носослезного протока размером до 0,5×0,8 мм) получен во время эндоназальной эндоскопической дакриоцисториностомии, выполняемой у пациентов со стенозом носослезного протока. Полученный материал фиксировали в течение 24 ч в 10% растворе нейтрального формалина (pH 7,0±0,2) и заливали в парафин. Гистологические срезы толщиной 3—4 мкм готовили на ротационном микротоме НМ34Е («Thermo Scientific Microm», США), окрашивали гематоксилином и эозином в автомате для окрашивания срезов HMS 70 («Thermo Scientific Microm», США). Гистологические и иммуногистохимические (ИГХ) срезы анализировали с помощью микроскопа Leica DM 2500, фотосъемку осуществляли камерой Leica DFC320 с последующей обработкой изображений в программе Leica Application Suite.

При морфологическом анализе оценивали состояние поверхностного эпителия слизистой оболочки носослезного протока, наличие, характер и состав инфильтратов собственной пластинки слизистой оболочки, степень выраженности склероза субэпителиальной ткани.

Для ИГХ-исследования были использованы коммерческие антитела, указанные в таблице.

Антитела, использованные для ИГХ-реакций

Срезы для ИГХ-исследования готовили толщиной 4 мкм, наносили на высокоадгезивные стекла, высушивали в течение 2 ч при температуре 58 °C, затем 18 ч при температуре 37 °C. Антигенную активность восстанавливали на водяной бане WB-4MS («Bio San», Латвия) в растворах Target Retrieval Solution pH 9,0 («Dak», Дания), Target Retrieval Solution pH 6 («Dako», Дания). Дальнейшие операции с препаратами проводили во влажной камере Slide Master («BioOptika», Италия). Инактивацию эндогенной пероксидазной активности осуществляли с помощью инкубирования с блокирующим раствором («Dako», Дания) в течение 15 мин. Проводили инкубацию с первичными антителами при температуре 4—8 °C в течение 18 ч. Далее следовала инкубация со вторичными антителами системы детекции REAL En Vision Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse («Dako», Дания) в течение 30 мин при комнатной температуре с последующей двукратной инкубацией с диаминбензидином в хромогенном растворе в течение 3 мин при комнатной температуре. После каждого этапа обработки антителами срезы промывали в фосфатном солевом буфере (Cell Marque). На последнем этапе препараты докрашивали гематоксилином Майера («Dako», Дания) и заключали в синтетическую смолу («Thermo Shandon Limited», США). Также были проведены реакции при положительных и отрицательных контролях.

Результаты

1-я стадия стенозирования носослезного протока

Во всех препаратах сохранялась целостность многорядного реснитчатого эпителия носослезного протока, однако плотность бокаловидных клеток в зоне стеноза и прилежащих областях была снижена, или они отсутствовали.

В собственной пластинке в зоне стеноза количество серомуцинозных желез было очень мало (рис. 1). В прилежащих областях по периферии концевых отделов желез и в субэпителиальной зоне наблюдали умеренно выраженную лимфоидно-плазмоцитарную инфильтрацию с включениями единичных сегментоядерных нейтрофилов и эозинофилов, интенсивность которой была обратно пропорциональна степени фиброза собственной пластинки.

Рис. 1. Фрагмент стенки носослезного протока у пациента с 1-й стадией стенозирования; зона стеноза.

Эпителий многорядный. В собственной пластинке зона фиброза, по периферии концевых отделов желез умеренно выраженная лимфоидно-плазмоцитарная инфильтрация. Окраска гематоксилином и эозином.

При ИГХ-исследовании выявлено, что клеточные элементы в инфильтратах представлены не только CD68+ тканевыми макрофагами, но и лимфоцитами, среди которых выявлены CD20+ (B-клетки) и CD3+ (T-клетки) (рис. 2). Среди лимфоцитов количественно преобладали B-клетки. Макрофаги и T-клетки были представлены в равных количествах. Все популяции инфильтрата расположены равномерно в субэпителиальном слое и подлежащих структурах.

Рис. 2. Характеристика клеточного состава инфильтрата при 1-й стадии заболевания; зона, прилежащая к области стеноза.

B-лимфоциты (CD20+) преобладают над T-лимфоцитами (CD3+). Количество CD3+ и CD68+ сопоставимо. Расположение всех субпопуляций диффузное. Иммуногистохимическая реакция.

2-я стадия стенозирования носослезного протока

Для препаратов, полученных у пациентов со 2-й стадией дакриостеноза, были характерны более значительные изменения эпителиального слоя в зоне стеноза: он терял многорядное строение, подвергаясь плоскоклеточной метаплазии. Базальная мембрана при этом значительно утолщалась (рис. 3).

Рис. 3. Фрагмент стенки носослезного протока у пациента со 2-й стадией заболевания; зона стенозирования.

Плоскоклеточная метаплазия эпителия, утолщение базальной мембраны, фиброз собственной пластинки. Умеренная лимфоидно-плазмоцитарная инфильтрация вокруг терминальных отделов желез. Окраска гематоксилином и эозином.

При ИГХ-исследовании в зонах фибротизации наблюдали лишь отдельные клетки крови: примерно в равном количестве T-, B-лимфоциты и моноциты. T-клетки обнаруживали преимущественно в субэпителиальной зоне, B-клетки — глубже, моноциты располагались по всем слоям равномерно.

В зонах, более удаленных от стенозированной области, эпителий был практически интактен — многорядный, с большим количеством бокаловидных клеток, воспалительный инфильтрат в этих зонах состоял из клеток в том же соотношении и локализовался так же, как у пациентов с 1-й стадией дакриостеноза, т.е. равномерно по всем вовлеченным слоям (рис. 4).

Рис. 4. Характеристика клеточного состава инфильтрата при 2-й стадии заболевания; зона, прилежащая к области стеноза.

B-лимфоциты (CD20+) преобладают над T-лимфоцитами (CD3+). Количество CD3+ и CD68+ сопоставимо. Расположение диффузное. Иммуногистохимическая реакция.

3-я стадия стенозирования носослезного протока

В большинстве биоптатов, полученных у пациентов с 3-й стадией дакриостеноза, фрагменты стенки носослезного протока были представлены плотной волокнистой соединительной тканью в стадии выраженного диффузного фиброза, покрытой многорядным реснитчатым эпителием с выраженными атрофическими изменениями, участками плоскоклеточной метаплазии или пролиферации базального слоя, определялись зоны тотальной десквамации, бокаловидные клетки отсутствовали. Серозные железы в собственной пластинке были единичными. Кровеносные сосуды полнокровны, дилатированы, стенки их значительно утолщены. Степень сохранности эпителиального слоя и уровень фибротизации различны, однако изменения в стенке сосудов (значительное утолщение артериол, дилатация венул) наблюдались во всех случаях. Лейкоцитарная инфильтрация непосредственно в зонах с выраженным фиброзом отсутствовала (рис. 5).

Рис. 5. Фрагмент стенки носослезного протока пациента с 3-й стадией заболевания; зона стенозирования.

Плоскоклеточная метаплазия эпителия, зона тотальной десквамации. Фибротизация собственной пластинки. Утолщение стенок артериол, пропотевание эритроцитов в ткань. Окраска гематоксилином и эозином.

В зонах, прилежащих к области стеноза, там, где плотность фибротизации собственной пластинки была ниже, наблюдалась значительная диффузная субэпителиальная лимфоидно-плазмоцитарная инфильтрация (рис. 6). B- и T-лимфоциты были представлены в равном соотношении. При этом первые располагались в глубоких слоях, в то время как вторые — не только в глубоких, но и в поверхностных слоях. Моноциты CD68+ были равномерно расположены.

Рис. 6. Характеристика клеточного состава инфильтрата при 3-й стадии заболевания; зона, прилежащая к области стеноза.

Пролиферация базального слоя эпителия, утолщение базальной мембраны. Лейкоцитарный инфильтрат представлен моноцитами (CD68+) и лимфоцитами. Количество CD3+ и CD20+ сопоставимо. Расположение B-лимфоцитов (CD20+) преимущественно в собственной пластинке, T-лимфоцитов (CD3+) и моноцитов диффузное.

В препаратах при всех стадиях заболевания соотношение субпопуляций T-клеток (индекс CD4/CD8) было на уровне 1,2—2, т.е. с преобладанием T-хелперов над T-киллерами.

Обсуждение

Исследование J. Linberg и соавт. [5], включавшее патогистологическое изучение биоптатов, полученных при дакриоцисториностомии, позволило выделить три патоморфологические стадии процесса: стадию раннего воспаления, переходную, а также стадию фибропластических изменений. Аналогичные стадии были выделены и другими авторами [6, 7]. В отличие от предыдущих работ мы провели клинико-морфологические параллели течения процесса стенозирования носослезного протока благодаря сопоставлению полученных данных гистологического и ИГХ-исследования с клиническими особенностями течения заболевания, учитывая характер, выраженность и продолжительность жалоб, а также биометрические показатели носослезного протока, определенные по данным КТ слезоотводящих путей. Результаты исследования показали, что различные патоморфологические стадии характеризуются соответствующими изменениями клинической картины дакриостеноза.

Изучение биоптатов, полученных у 50 пациентов со стенозом носослезного протока, позволило установить, что при разной длительности течения заболевания есть характерные особенности в составе воспалительного инфильтрата, расположении клеток по слоям ткани, а также в строении выстилающего носослезный проток эпителия.

Обнаружено, что в условной 1-й стадии патологического процесса эпителий в зоне стеноза сохранен, количество бокаловидных клеток снижено, при этом инфильтрат в месте стеноза идентичен по своему составу таковому в прилежащих к этой зоне областях. Количество B-лимфоцитов преобладало над количеством T-лимфоцитов и тканевых макрофагов. В условной 2-й стадии патологического процесса эпителий непосредственно в зоне стеноза терял свое многорядное строение и подвергался метаплазии, базальная мембрана утолщалась. В воспалительном инфильтрате в зоне стеноза выявляли немногочисленные клетки, в равных долях представленные B-лимфоцитами, T-лимфоцитами и тканевыми макрофагами. Были обнаружены различия в пространственном распределении лейкоцитов: на фоне диффузного расположения тканевых макрофагов отмечали преимущественно поверхностное распространение T-клеток и более глубокое расположение B-клеток. Инфильтрат в прилежащих к зоне стеноза областях, как и при 1-й стадии процесса, был равномерно распределен по слоям. В условной 3-й стадии патологического процесса обнаружена выраженная метаплазия или десквамация эпителия, базальный слой был гипертрофирован. Выявляли утолщение артериол и дилатацию венул. В области стеноза воспалительный инфильтрат отсутствовал, а в прилежащих к нему зонах отмечали равные доли B- и T-клеток, которые преобладали над тканевыми макрофагами. Также в 3-й стадии процесса сохранялась пространственная вариабельность расположения клеточных компонентов инфильтрата: на фоне диффузного расположения T-клеток и тканевых макрофагов отмечали наличие B-клеток преимущественно в собственной пластинке.

Обнаруженное в проведенном исследовании соотношение лейкоцитов соответствует таковому в лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми оболочками (MALT) слезоотводящих путей как в норме, так и при воспалении, что было описано ранее [8—11]. Было показано, что при длительном течении процесса относительное количество T-клеток в инфильтрате значимо увеличивается и становится сравнимым с таковым B-клеток, которые исходно преобладали в инфильтрате. Вероятно, это происходит за счет накопления клеток памяти при постоянной антигенной стимуляции.

Зоны стенозирования на всех стадиях обеднены серомуциновыми железами. Кроме того, на 2-й и 3-й стадиях в них прогрессивно снижается количество воспалительных клеток и нарастает объем плотной волокнистой соединительной ткани.

Там же, где процесс фибротизации менее выражен, в зонах, прилежащих к зоне стеноза, ИГХ-картина воспалительного инфильтрата повторяет предыдущую стадию процесса в зоне стеноза.

Интересной, на наш взгляд, является некоторая сегрегация субпопуляций лейкоцитов по слоям в зависимости от стадии: так, после диффузного расположения клеточных элементов на 1-й стадии на 2-й (в зоне стеноза) и 3-й (в прилежащих областях) стадиях обнаружен «отход» антигенпродуцирующих клеток в более глубокие слои.

Маркером течения заболевания косвенно могут служить и наблюдаемые изменения эпителиальной выстилки. Прогрессивная потеря бокаловидных клеток, а затем и правильного многорядного строения, вероятно, ассоциирована с длительным нарушением функционирования этого отдела слезоотводящих путей, застоем содержимого, а также с изменением микробиоты.

Заключение

Результатами настоящего исследования показано, что дакриостеноз — это прогрессивно текущий патологический процесс, связанный с прогредиентным развитием хронического воспаления в слезоотводящих путях. Сопоставление данных, полученных при патоморфологическом исследовании, с клинической картиной заболевания имеет несомненное практическое значение, поскольку дает возможность оценить активность воспалительного процесса на основе принятого к настоящему времени в клинической дакриологии обследования пациента. Понимание патоморфологического процесса, происходящего у пациента в конкретной стадии дакриостеноза, позволяет проводить патогенетически обоснованное лечение с назначением медикаментозных средств, а также определить возможную тактику хирургического лечения.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Е.Л. Атькова

Сбор и обработка материала: А.Ф. Астраханцев, А.М. Суббот, В.Д. Ярцев

Статистическая обработка данных: А.М. Суббот, В.Д. Ярцев

Написание текста: В.Д. Ярцев

Редактирование: Е.Л. Атькова, А.Ф. Астраханцев, А.М. Суббот

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.