Оценка в биоптатах немелкоклеточных карцином легкого экспрессии PD-L1 с применением алгоритма нейросетевого анализа

Один из методов лечения немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) — использование ингибиторов иммунных контрольных точек (ИКТ) PD-1 и PD-L1.

Поскольку ИКТ эффективны только у 15—25% пациентов с прогрессирующим НМРЛ, необходима оценка экспрессии PD-L1 для выбора пациентов, которые потенциально могут ответить на эту терапию [1]. Иммуногистохимическая оценка экспрессии PD-L1 была использована в большинстве клинических исследований, определяющих эффективность ингибиторов контрольных точек [2].

В большинстве систем оценки PD-L1 используется непрерывная переменная, выраженная в процентах окрашенных клеток в определенной клеточной популяции [3]. Патологу необходимо учитывать наличие экспрессии в разных типах клеток (опухолевых или иммунных), а также использованный клон антитела для тестирования. Каждый из этих параметров имеет значение и влияет на воспроизводимость результатов теста. Кроме того, оценка PD-L1 в архивном материале через несколько лет не отражает характер взаимодействия опухоли и иммунной системы на момент лечения.

Исследование Keynote-042 показало, что преимущество от назначения пембролизумаба в 1-й линии получают пациенты с экспрессией PD-L1 выше 50% в опухолевых клетках при использовании клона антитела 22С3.

Вариабельность количественного определения PD-L1 между различными исследователями, которые оценивали одни и те же микропрепараты, возможно, связана с трудностью распознавания слабой или неполной мембранной окраски [4]. Это может способствовать неточной стратификации пациентов и неправильной интерпретации влияния экспрессии PD-L1 на клинический исход. Субъективные решения количественной оценки экспрессии могут привести к радикально различающейся терапевтической стратификации.

Цифровой анализ изображений и алгоритмы нейросетевого анализа дают большую точность, воспроизводимость, стандартизацию критериев и результатов включения в исследование [5].

В исследовании на основании собственного опыта работы с алгоритмом выполнен анализ согласия количественной оценки экспрессии PD-L1 в опухолевых клетках с помощью нейросети в биоптатах немелкоклеточных карцином легкого.

Изучены 96 биоптатов легких у пациентов с диагнозом НМРЛ без клинически значимых мутаций в генах EGFR, ALK, ROS1, MET, определенных методом ПЦР.

Распределение гистологических подтипов рака в биоптатах было следующее: 24% (n=23) аденокарциномы, 76% (n=73) плоскоклеточных карцином.

Иммуногистохимическое окрашивание с антителом к PD-L1 (клон 22C3 pharmDx, Dako) проведено с применением автоматического стейнера Dako Autostainer Link 48 (система визуализации Envision FLEX) в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем [6]. В качестве позитивного контроля использована ткань миндалины. После окраски микропрепараты изучал врач-патологоанатом, имеющий сертификат для оценки экспрессии PD-L1 в опухолевых клетках с помощью клона 22C3. После этого гистологические микропрепараты оцифрованы с помощью сканирующего микроскопа (сканера) Panoramic Flash 250 (3D Histech) с объективом х 20, полученные цифровые копии микропрепаратов проанализированы, для этого использовали программное обеспечение QuPath и модуль нейросетевого анализа Artificial Neural Network (ANN_MLP) (рис. 1).

Рис. 1. Модуль нейросетевого анализа Artificial Neural Network программного обеспечения QuPath.

Обучение расчетного модуля осуществляли с помощью режима Train pixel classifier путем создания врачом-патологоанатомом не менее 3 аннотаций (рис. 2) для опухолевой ткани (Tumor) и стромы (Stroma). Зоны артефактов обозначали категорией Ignore и не учитывали в анализе. Полученный алгоритм загружали в проект и проводили подсчет опухолевых клеток (TC) на модуле Positive Cell Detection с использованием режима Score compartment — Cytoplasm DAB OD-mean (возможен для мембранного окрашивания) с настройками по умолчанию на всей площади скана для опухоли.

Рис. 2. Пример работы алгоритма нейросетевого анализа с категориями Tumor (красный), Stroma (зеленый) и Ignore (серый).

Мануальную разметку на оцифрованной копии гистологического микропрепарата осуществлял эксперт в режиме аннотаций в программе QuPath по категориям Tumor и Stroma, затем анализировали площадь категорий в каждом случае.

Статус PD-L1 определяли как положительный, когда при оценке визуальным методом 1% и более опухолевых клеток имели мембранное окрашивание.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программного обеспечения R Studio версия 3.3, с применением пакетов IRR, функции вычисления коэффициента Agree и Maxwell’s RE coefficient для анализа воспроизводимости количественной оценки между патологом и программным обеспечением. Комплектация компьютера для анализа включала двухъядерный процессор Intel i3, 2,8 GHz, 8 Гб оперативной памяти DDR2.

Экспрессия PD-L1 показала выраженную меж- и внутриопухолевую гетерогенность. При сравнительном анализе мануальных аннотаций эксперта и выделенных нейросетью зон по категориям опухоль, строма и артефакты алгоритм показал достаточную согласованность с экспертом, коэффициент согласия составил 92%.

Все результаты визуальной или нейросетевой оценки экспрессии белка PD-L1 разделены на группы: 1-я — отсутствие экспрессии, 2-я — низкая экспрессия (от 1 до 49% опухолевых клеток) и 3-я — высокая экспрессия (более 50% опухолевых клеток).

По данным визуальной оценки 42% случаев были отрицательными, 37% отнесены в группу низкой экспрессии, в 21% случаев определена группа высокой экспрессии.

При использовании модуля нейросетевого анализа изображений проанализировано в среднем 190 000 опухолевых клеток в 1 биоптате. В 32% случаев выявлено отсутствие экспрессии, в 49% — низкая экспрессия, в 19% — высокая. При сравнении с визуальным методом анализа 11% случаев были переклассифицированы нейросетью как позитивные, отнесенные во 2-ю группу; 3-я группа визуального анализа практически полностью совпала с 3-й группой нейросетевого анализа (табл. 1).

Таблица 1. Сравнительная характеристика оценки уровня экспрессии PD-L1 по данным визуального и нейросетевого анализа в группах

Коэффициент согласия (Agreement) составил 72% без разделения на группы, однако при подгрупповом визуальном и нейросетевом анализе для 1-й группы — 58%, для 2-й и 3-й групп — 71 и 96% соответственно (табл. 2).

После обучения нейросети скорость получения результата одного биоптата составила в среднем 36±18 мин на компьютере с указанными характеристиками.

Оценка экспрессии PD-L1 вошла в повседневную практику врача-патологоанатома для выбора оптимальной тактики лечения пациента. Все большее распространение получают компьютерные алгоритмы для анализа изображений с целью диагностики, а также количественной оценки предиктивных и прогностических иммуногистохимических биомаркеров.

Выбранный алгоритм нейросетевого анализа продемонстрировал высокий коэффициент согласия для оценки статуса положительной экспрессии PD-L1 во 2-й и 3-й группах. Однако коэффициент согласия в 1-й группе был ниже 0,6, что говорит о недостаточном согласии (см. табл. 2).

Таблица 2. Распределение по группам коэффициентов согласия результатов оценки экспрессии визуальным и нейросетевым методами

Алгоритм оценки нейросетевого анализа экспрессии позволяет определить гораздо больше опухолевых клеток, чем визуальный количественный способ, поскольку исключает строму из анализа. Одна из составляющих нейросетевого анализа — обучение нейросети. Это требует формирования больших объемов структурированных данных, где должны быть представлены категории опухоли, строма, а также артефакты на всей площади цифровой копии препарата. Одно из ограничений нейросетевого метода связано с трудностью распознавания внутриопухолевой лимфоцитарной и гистиоцитарной инфильтрации, которая, возможно, стала причиной более высокой доли позитивных случаев в группе низкой экспрессии в сравнении с визуальным методом.

Вклад врача имеет решающее значение для создания наборов данных, необходимых для обучения нейросети. Скорость анализа будет зависеть от вычислительной мощности компьютера, при которой проводится обработка данных. В другом исследовании мы показали, что скорость количественного анализа зависит также от алгоритмов используемых программных продуктов [7]. Применение мощных рабочих станций или вычислительных облачных платформ по типу Aiforia или HALO AI сократит время нейросетевого анализа до приемлемого в рутинной практике.

Алгоритм нейросетевого анализа модуля QuPath способен выделить на оцифрованной копии гистологического микропрепарата опухоль, строму и артефакты, а также количественно охарактеризовать экспрессию биомаркера PD-L1.

Алгоритм нейросетевого анализа программы QuPath обеспечивает удовлетворительный уровень согласия с визуальным методом оценки для опухолей с высокой экспрессией PD-L1. Это создает предпосылки автоматизации количественной оценки экспрессии, когда патолог сталкивается с необходимостью тестирования предиктивных или прогностических биомаркеров. Необходимо дальнейшее совершенствование алгоритма нейросетевого анализа для повышения воспроизводимости оценки количественной экспрессии на больших объемах данных с клинической валидацией.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — В.А. Кушнарев

Сбор и обработка материала — В.А. Кушнарев, Н.А. Матяшина, В.А. Шапкина, А.С. Артемьева

Статистическая обработка — В.А. Кушнарев

Написание текста — В.А. Кушнарев, Н.А. Матяшина, Е.А. Кушнарева, Ю.А. Криволапов

Редактирование — А.С. Артемьева, Ю.А. Криволапов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.