Коган Е.А.

Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова, Москва

Благова О.В.

ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова

Файзуллина Н.М.

ФГБУ "НЦАГиП им. акад. В.И Кулакова" Минздрава России, Москва

Недоступ А.В.

ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова

Сулимов В.А.

Первый МГМУ им. И.М. Сеченова; Московский НИИ педиатрии и детской хирургии

Повышенная экспрессия toll-like-рецепторов 2-го и 9-го типов в миокарде как маркер активного миокардита и возможный предиктор эффективности лечения

Журнал: Архив патологии. 2018;80(1): 11-20

Просмотров : 30

Загрузок : 1

Как цитировать

Коган Е. А., Благова О. В., Файзуллина Н. М., Недоступ А. В., Сулимов В. А. Повышенная экспрессия toll-like-рецепторов 2-го и 9-го типов в миокарде как маркер активного миокардита и возможный предиктор эффективности лечения. Архив патологии. 2018;80(1):11-20. https://doi.org/10.17116/patol201880111-20

Авторы:

Коган Е.А.

Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова, Москва

Все авторы (5)

Миокардит остается одним из наиболее сложных для диагностики и лечения заболеваний в практике кардиолога и терапевта. Несмотря не внедрение новых визуальных методик высокого разрешения, включая МРТ сердца с контрастированием, золотым стандартом диагностики миокардита в клинической практике остается эндомиокардиальная биопсия (ЭМБ) [1]. Европейские эксперты рекомендуют применение далласских критериев, согласно которым миокардит диагностируется при обнаружении 14 инфильтрирующих лимфоцитов на 1 мм2 и более и до 4 макрофагов. Выделяют пограничный (только инфильтрация) и активный миокардит, который характеризуется также выраженным некрозом и дегенерацией кардиомиоцитов (КМЦ).

Вместе с тем за рамками далласских критериев остаются тяжелый паренхиматозный миокардит (без выраженных клеточных реакций), миокардит с преобладанием продуктивного васкулита, иммунокомплексных механизмов (аналог гуморальной реакции отторжения трансплантата), а также миокардит низкой степени гистологической активности, при котором число клеток в инфильтрате может не достигать порога 14. Для повышения чувствительности ЭМБ рекомендовано применение иммуногистохимического (ИГХ) исследования миокарда, направленного в первую очередь на идентификацию в составе инфильтратов CD45-позитивных Т-лимфоцитов (Марбургский консенсус [2]). В диагностике миокардита и определении его прогноза применяется также ИГХ-анализ на CD3-, CD20-, CD68-позитивные клетки, структурные белки КМЦ (титин, десмин, дистрофин, виментин, винкулин), молекулы адгезии (ICAM-1, VCAM-1), IgM и С4d-фрагмент комплемента, TUNEL-тест для оценки апоптоза.

В последние годы этот список дополнили так называемые toll-like рецепторы (прямого перевода на русский язык нет, от немецкого toll — замечательный, классный, эмоциональная реакция первооткрывателя на строение мушек-дрозофилл с мутациями в соответствующем гене). Под toll-like рецепторами (TLR) понимают семейство рецепторов врожденного иммунитета, которые находятся на поверхности иммунокомпетентных клеток (макрофагов, лимфоцитов и др.), активируются под воздействием различных инфекционных агентов и участвуют в патогенезе многих инфекционно-иммунных заболеваний.

На сегодня у человека известно 10 типов TLR, которые посредством белков-адаптеров запускают синтез провоспалительных цитокинов и индукцию генов, ответственных за воспалительный ответ клетки. Генетически детерминированное строение и функция самих TLR таким образом могут определять характер ответа макроорганизма на инфекции (в том числе вирусные) и в какой-то степени отвечать на вечный вопрос больных миокардитом: почему после банального гриппа заболел именно я? Изучение экспрессии TLR при миокардите представляет безусловный интерес как с точки зрения генетической предрасположенности к этому заболеванию, так и с точки зрения его диагностики и, возможно, лечения.

В экспериментальных исследованиях показано, что у TLR9-дефицитных мышей воспалительный ответ в миокарде не развивается [3], в то время как под действием агониста TLR 7-го и 8-го типов ресиквимода формируется картина аутоиммуноопосредованной дилатационной кардиомиопатии (ДКМП), [4]. Можно предполагать, что наибольшую роль в развитии миокардита играют те типы TLR, которые взаимодействуют с вирусными лигандами. Подобные свойства обнаружены у TLR 9-го типа (активируются ДНК-содержащими вирусами), а также 3, 7 и 8-го типов (лигандами являются РНК-содержащие вирусы) [5, 6]. Однако эти типы TLR при миокардите изучены мало, чуть больше сведений накоплено относительно TLR 2-го и 4-го типов.

Наконец, представлялось целесообразным оценить экспрессию маркеров клеточной пролиферации, поскольку имеются сведения об активизации стволовых клеток сердца в рамках миокардита [7]. Экспрессия Ki-67 традиционно используется в онкологии для определения индекса пролиферации опухолей, однако в отдельных работах ее возрастание установлено и при миокардитах в сравнении со здоровым сердцем [8—10]. Недавно в эксперименте на мышах изучена роль c-kit-позитивных прогениторных клеток в развитии Коксакивирусного миокардита [11]: у ювенильных мышей эти клетки активно продуцировали вирусный материал и погибали посредством апоптоза, чего не наблюдали у взрослых и что согласуется с известной склонностью детей к развитию Коксаки-миокардита.

При очевидной значимости представленных маркеров в развитии миокардита их значение в его клинической диагностике и перспективы применения в клинике остаются неясными.

Целью работы было изучить степень экспрессии некоторых структурных белков, маркеров клеточной пролиферации и врожденного иммунитета в миокарде для оценки их возможной диагностической и прогностической роли у больных хроническим миокардитом.

Материал и методы

Проведено клинико-морфологическое исследование. В работу включены 23 больных (16 мужчин, средний возраст 52,0±12,4 года, от 27 до 73 лет) с различными формами некоронарогенного поражения миокарда, которым в диагностических целях проводилась биопсия миокарда.

В 1-ю группу вошли 10 больных (9 мужчин, средний возраст 49,2±11,0 года, от 27 до 60 лет) с дилатацией камер сердца (признаки ДКМП) и предполагаемым миокардитом как причиной данного синдрома. Критериями включения были конечный диастолический размер (КДР) левого желудочка (ЛЖ) 6 см и более, фракция выброса (ФВ) 45% и менее, хроническая сердечная недостаточность (ХСН) не менее II стадии, 2-го функционального класса, давность симптомов не менее полугода (хроническое течение болезни), более чем 2-кратное увеличение хотя бы двух видов антикардиальных антител. Средний КДР ЛЖ составил 7,2±0,9 см, конечный диастолический объем ЛЖ — 267,8±105,6 мл, систолический — 197,0±99,0 мл, ФВ ЛЖ — 28,7±12,8%, объем левого предсердия — 122,2±26,0 мл, правого — 71,5±23,8 мл, размер правого желудочка — 3,2±0,8 см.

Во 2-ю группу включили 13 больных (7 женщин, средний возраст 49,2±11,0 года, от 27 до 60 лет) с пороками сердца (ревматические, дегенеративные митрально-аортальные, частичный аномальный дренаж легочных вен), гипертрофической кардиомиопатией, миксомой левого предсердия и хронической тромбоэмболией легочной артерии (ТЭЛА), предположительно без миокардита. Основным критерием включения было проведение операции на открытом сердце с возможностью забора миокарда для морфологического исследования. Не включались пациенты с КДР ЛЖ 6 см и более и ФВ менее 50%. Предполагалось, что эти больные составят группу сравнения.

Критериями исключения из обеих групп были наличие гемодинамически значимого коронарного атеросклероза, инфаркта миокарда, острого коронарного синдрома, инфекционного эндокардита, врожденных и ревматических пороков сердца (только для 1-й группы), тиреотоксического, гипертонического сердца (гипертрофия ЛЖ >14 мм), амилоидоза, болезней накопления, саркоидоза, диффузных болезней соединительной ткани, системных васкулитов, лимфопролиферативных заболеваний, химиотерапии антрациклинами, операции на сердце давностью менее 2 мес, отказ пациента от участия в исследовании.

Неинвазивные методы обследования. Всем больным проведены общеклиническое обследование, ЭКГ, ЭхоКГ, суточное мониторирование ЭКГ по Холтеру, определение уровня антикардиальных антител, вирусного генома в крови (вирусы герпеса 1, 2, 6-го типов, зостер, Эпштейна—Барр (ВЭБ), цитомегаловирус (ЦМВ), парвовирус В19, энтеро/аденовирусы) методом ПЦР в реальном времени (ООО «ДНК-технология»), а также коронарография (n=14) или МСКТ сердца (n=9) для исключения атеросклероза, МРТ сердца (n=3) для выявления признаков миокардита.

Исследование антикардиальных антител проводили в лаборатории иммуногистохимии ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. акад. В.И. Шумакова: определяли титры антител к антигенам эндотелия, КМЦ, гладкой мускулатуры, волокон проводящей системы сердца, а также ядер КМЦ (антинуклеарный фактор). Использовали метод иммуноферментного анализа с применением чистых антител к IgG человека, меченных ФИТЦ (флюоресцеинизотиоцианатом) или его аналогами (препарат «Алекса 480»), а также люминесцирующих сывороток против IgG человека производства ННИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. Учет результатов проводили с помощью люминесцентных микроскопов Leica (Laborlux и DM4000В) при увеличении 400 и 600. Как диагностически значимое расценивали обнаружение антинуклеарного фактора в любом титре, прочих антител в титрах ≥1:160—1:320.

Морфологическое исследование миокарда выполнено всем больным 1-й и 2-й групп: в 1-й группе преимущественно ЭМБ правого желудочка (n=6), а также интраоперационная биопсия ЛЖ в ходе операции обратного ремоделирования (n=2) и исследование обоих желудочков в рамках аутопсии (n=2). Во 2-й группе забор миокарда ЛЖ проводили интраоперационно (в ходе оперативного лечения пороков сердца, удаления миксомы, тромбэндартерэктомии у пациентов с ТЭЛА, расширенной миоэктомии у больных с гипертрофической кардиомиопатией). Все операции на открытом сердце выполняли в РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского. ЭМБ проводили по стандартной методике доступом через бедренную вену биопсийными щипцами Cordis STANDARD 5.5 F 104 FEMORAL c забором 3—5 участков. Материал фиксировали в 10% забуференном формалине, заливали в парафин. Серийные срезы больше 4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и использовали для иммуногистохимических реакций. Биоптаты исследовали в световом микроскопе (окраска гематоксилином и эозином, по Ван Гизону) и методом ПЦР на геном парвовируса В19, вирусы герпеса 1, 2-го типа (ВПГ1,2), герпеса человека 6-го типа (ВГЧ6), ВЭБ, ЦМВ.

Иммуногистохимическое исследование миокарда проведено всем больным 1-й и 2-й групп. Оно включало определение экспрессии виментина, десмина, c-kit (CD 117), Ki-67 («Dako», 1:100) и TLR 2-го и 9-го типов («Abbiotec», 1:100). Демаскировку антигенов проводили в ретривере с использованием цитратного буфера pH 6,0, при температуре 120 °C в течение 20 мин. Для определения экспрессии E-катгерина использовали кроличьи моноклональные антитела (clone NCH-38, «Dako») в разведении 1:100. Разводили раствором для разведения антител Emerald antibody diluent (фирма «Cell MARQUE»). Ставили положительные и отрицательные контроли. Результаты реакций оценивали полуколичественным методом с расчетом баллов по количеству окрашенных клеток одного типа: 2 балла до 20% положительных клеток, 4 балла более 20%, но менее 40%, 6 баллов 40% и более. Для Ki-67 рассчитывали процент клеток с окрашенными ядрами.

Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом Первого МГМУ им. Сеченова.

Средний срок наблюдения в 1-й группе составил 9,5 (2,75, 31) мес; во 2-й группе наблюдение ограничивалось ранним послеоперационным периодом (1 мес). Основной конечной точкой была летальность. Лечение ХСН и нарушений ритма проводили в соответствии с общепринятыми рекомендациями, лечение миокардита будет описано ниже.

Статистическая обработка полученных результатов проведена с помощью программы SPSS 21. Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Колмогорова—Смирнова. Количественные признаки с нормальным распределением представлены как М±SD (среднее ±1 стандартное отклонение), в ином случае — в виде медианы с указанием 1-го и 3-го квартилей. Достоверность различий оценивали с помощью критериев Стьюдента, Манна—Уитни, Вилкоксона, корреляционные связи — с использованием коэффициентов Пирсона и Спирмена. Результаты считали значимыми при р<0,05.

Результаты

Морфологическое и вирусологическое исследования миокарда у больных 1-й и 2-й групп

По данным гистологического исследования лимфоцитарный миокардит диагностирован у всех больных 1-й группы: согласно далласским критериям он расценен как активный у 4 пациентов и пограничный у 6 пациентов. Во всех случаях отмечали дистрофию и гипертрофия КМЦ, мелкоочаговый кардиосклероз различной степени выраженности, лимфогистиоцитарную инфильтрацию в интерстиции и периваскулярно (рис. 1, а,

Рис. 1. Результаты морфологического и вирусологического исследования миокарда у больных 1-й и 2-й групп. а, б — эндомиокардиальные биоптаты правого желудочка у пациентов 1-й группы, в, г — интраоперационные биоптаты ЛЖ у пациентов 2 группы, окраска гематоксилином-эозином, большое увеличение; продуктивный васкулит (а), лимфогистиоцитарные инфильтраты (а-г), выраженная дистрофия, гипертрофия кардиомиоцитов (а), некроз (б), субэндокардиальный липоматоз (в); в центре — распределение больных обеих групп по наличию и активности миокардита, наличию или отсутствию вирусного генома в миокарде (пояснения в тексте)
б). Для больных активным миокардитом в сравнении с пограничным оказалась характерна, помимо различных вариантов гибели клеток (некроз, миолиз, апоптоз), высокая частота продуктивного васкулита (75% в сравнении с 16,7%). При пограничном миокардите, напротив, чаще выявляли субэндокардиальный липоматоз (83,3% в сравнении с 25%).

У больных 2-й группы при гистологическом исследовании миокарда в 6 (46,2%) случаях также отмечены признаки миокардита — активного у 3 и пограничного у 3 больных (см. рис. 1, в, г). Его морфологическими особенностями были высокая частота сопутствующего эндокардита (50%) и склероза эндокарда (100%), что у пациентов с ревматическими пороками сердца расценено как признак активности ревматического процесса. Субэндокардиальный липоматоз выявлен у всех больных без миокардита и у половины с миокардитом (преимущественно пограничным). При анализе клинических данных на возможность миокардита указывало лишь значимое повышение титров антикардиальных антител у 3 больных.

Вирусный геном выявлен в миокарде у 50% больных 1-й группы: парвовирус В19 у 2, ЦМВ в сочетании с ВЭБ у 2 и моноинфекция ВЭБ у 1 пациента. В крови геном ЦМВ и ВЭБ выявлен одновременно с миокардом у одного больного и ВЭБ при отсутствии вирусов в миокарде еще у одного. Всего вируспозитивны по крови/миокарду оказались 6 (60%) больных 1-й группы. Во 2-й группе частота обнаружения вирусов в миокарде достигла 69,2%: у 4 пациентов моноинфекция парвовирусом В19, еще у 4 его ассоциация с ВГЧ6 и у 1 больного ВПГ1,2. У 2 вируспозитивных по миокарду больных в крови выявлены ВГЧ6 и ВЭБ (которого в миокарде не было). Морфологические признаки миокардита в отличие от 1-й группы отмечены лишь у 5 из 9 вируспозитивных больных. Миокардит во 2-й группе оказался вируспозитивным в 83,3% случаев. Корреляции вирусного генома с активностью миокардита в обеих группах не отмечено.

Таким образом, всего миокардит диагностирован у 16 больных обеих групп, в том числе активный у 9, пограничный у 7, вируспозитивных по миокарду 10 (см. рис. 1, диаграмма в центре). Дальнейший анализ экспрессии структурных белков, маркеров клеточной пролиферации и врожденного иммунитета проводили в соответствии с наличием и активностью миокардита у пациентов 1-й и 2-й групп одновременно.

ИГХ-исследование миокарда в зависимости от наличия и активности миокардита. Экспрессию виментина определяли как в строме, так и паренхиме миокарда, десмина — в кардиомиоцитах; c-kit (СD117) — в отдельных веретеновидных клетках, имеющих характеристики на светооптическом уровне фибробластических клеток, экспрессирующих одновременно виментин и десмин; ТLR 2,4 — преимущественно в клетках воспалительных инфильтратов и стромы, а также в кардиомиоцитах; Ki-67 — в отдельных клетках воспалительных инфильтратов и стромы. Результаты определения экспрессии всех изученных маркеров представлены в табл. 1.

Таблица 1. Выраженность экспрессии изученных маркеров в миокарде в зависимости от наличия и активности миокардита

Обнаружена выраженная корреляция экспрессии TLR2 и TLR9 с наличием морфологической картины активного миокардита при отсутствии его достоверной связи с уровнем экспрессии остальных изученных маркеров (рис. 2).

Рис. 2. Экспрессия toll-like-рецепторов 2-го и 9-го типов у больных с активным, пограничным миокардитом и без морфологических признаков миокардита. ИГХ-препараты миокарда левого и правого желудочков. Пояснения в тексте.
Уровень экспрессии TLR2 у пациентов с пограничным миокардитом или без него составил 0 [0; 0,75] баллов, с активным миокардитом — 1,5 [1; 1,5] балла, TLR9 — 2 [2; 2] и 4 [3; 4] балла соответственно (p<0,001), рис. 3.
Рис. 3. Сравнение уровня экспрессии toll-like-рецепторов 2-го (слева) и 9-го (справа) типов у больных без миокардита, с пограничным и активным миокардитом. Достоверность различий отмечена для пациентов с активным миокардитом в сравнении с больными с пограничным миокардитом и без миокардита. Пояснения в тексте.

При пограничном миокардите экспрессия TLR2 и TLR9 была ниже, чем без миокардита (0 [0; 0] против 0 [0; 1] балла и 2 [1,5; 2] против 2 [2; 3]) баллов, что может отражать гибель/истощение КМЦ на поздних стадиях болезни. Отмечена также тесная корреляция уровней экспрессии TLR2 и TLR9 между собой (r=0,824, р<0,001) и с уровнем Ki-67 в строме миокарда (r=–0,531 и r=–0,702, р<0,01), табл. 2.

Таблица 2. Корреляции структурных белков, маркеров клеточной пролиферации и врожденного иммунитета друг с другом, клинико-инструментальными параметрами и исходами

Среди других изученных маркеров отмечена не достигавшая степени достоверности тенденция к уменьшению выраженности экспрессии виментина, c-kit и Ki-67 у больных с активным миокардитом в сравнении с пациентами без миокардита и с пограничным миокардитом (см. табл. 1). В частности, минимальной (близкой к 0) оказалась экспрессия Ki-67 у больных с активным миокардитом: это может свидетельствовать о снижении индекса пролиферации по мере возрастания активности болезни и требует осмысления. Низкий уровень c-kit также может отражать отсутствие пролиферации стволовых клеток в активную фазу миокардита. Снижение уровня виментина может быть связано с нарушением структуры КМЦ.

Интересно, что уровень десмина прямо коррелировал с наличием в миокарде или крови вирусного генома: известно, что некоторые кардиотропные вирусы могут изменять экспрессию этого белка в миокарде, имитируя картину первичных (генетически детерминированных) десминопатий: описано прямое воздействие вируса Коксаки В3 на структуру десмина в КМЦ [12], его ингибирование при экспериментальном вирусном миокардите [13], а также образование антител к десмину в рамках миокардита [14]. Отмечена также корреляция наличия вирусного генома с титром антител к антигенам КМЦ, которая может свидетельствовать о роли вирусов в повреждении миокарда и индукции аутоиммунного ответа в ответ на обнажение глубоких антигенов (собственно КМЦ). Наконец, выявлена прямая связь экспрессии c-kit с выраженностью кардиосклероза (индукция стволовых клеток в ответ на замещение мышечной ткани?) и ФВ (более высокое значение ФВ при повышенной экспрессии) — значение данных корреляций не может быть оценено однозначно и требует дальнейшего изучения.

Корреляции экспрессии отдельных маркеров с результатами лечения и исходами. Всесторонняя оценка результатов лечения не входила в задачу данного исследования, однако была сделана попытка проанализировать прогностические возможности изученных ИГХ-маркеров (в первую очередь TLR), в связи с чем необходимо охарактеризовать лечение. Стандартную кардиотропную терапию получали все пациенты в соответствии с существующими рекомендациями по лечению ХСН и нарушений ритма сердца. Среди 16 больных миокардитом противовирусная терапия (ацикловир, внутривенно иммуноглобулин) проведена 5 больным, иммуносупресивная терапия (ИСТ) — 10 больным: она включала кортикостероиды у 5 больных (в комбинации с гидроксихлорохином в дозе 200 мг/сут или азатиоприном 75—150 мг/сут), а также монотерапию гидроксихлорохином. Средняя доза метилпреднизолона составила 24 (20, 36) мг/сут. Двум пациентам стероиды назначили после проведения курса терапии ацикловиром по поводу ВЭБ-инфекции.

Критерием хорошего непосредственного ответа на терапию (группа респондеров, 5 человек) служило возрастание ФВ на 10% и более в течение первых 4—6 мес лечения. Остальные 5 пациентов, получавшие ИСТ, отнесены к группе нереспондеров. В каждой подгруппе оказалось по одному ВЭБ-позитивному больному. На этом небольшом количестве больных проведено сравнение экспрессии изученных ИГХ-маркеров у респондеров и нереспондеров (рис. 4):

Рис. 4. Сравнение уровней экспрессии TLR 2-го, 9-го типов и виментина у больных миокардитом с хорошим (слева) и плохим (справа) ответом на лечение. Достоверность различий показана для групп с хорошим и плохим ответом не лечение. Пояснения в тексте.
установлены близкие к достоверным различия по уровню экспрессии TLR2 и виментина; медиана уровня экспрессии TLR9 у респондеров была выше, но различия не достигали степени достоверности. Следует учитывать, что у 2 больных экспрессию белков изучали после курса ИСТ (исследование эксплантированного сердца и аутопсия).

Летальность среди всех пациентов, включенных в исследование, составила 21,7% (5 больных): в одном случае смерть больного из 2-й группы наступила в раннем послеоперационном периоде (после тромбэндартерэктомии по поводу хронической ТЭЛА), остальные пациенты с миокардитом и синдромом ДКМП умерли внезапно (n=1) от терминальной сердечной и печеночной недостаточности (n=1), полиорганной недостаточности после экстренной абдоминальной операции по поводу желудочного кровотечения (n=1) и септического шока с развитием электрического «шторма» после репротезирования аортального клапана по поводу протезного эндокардита (n=1). Отмечена корреляция летальных исходов с обнаружением крупноочагового кардиосклероза в миокарде и низкой ФВ (см. табл. 2). Достоверных корреляций летальных исходов с экспрессией изученных ИГХ-маркеров не установлено.

Обсуждение

Прежде всего необходимо отметить, что частота выявления морфологических признаков миокардита оказалась высокой не только у пациентов с синдромом ДКМП и миокардитом, предварительно диагностированным на основании неинвазивного обследования (100%), но и у больных с предположительно невоспалительными заболеваниями сердца без дилатации камер и снижения сократимости (46,2%). Это свидетельствует о необходимости углубленного обследования с применением предложенного нами алгоритма [15] всех пациентов, характер кардиологических симптомов которых (в первую очередь нарушений ритма и сердечной недостаточности) не до конца ясен.

Среди всех изученных ИГХ-методом маркеров (виментин, десмин, c-kit, Ki-67, TLR 2-го и 9-го типов) только для TLR обоих типов (в большей степени 9-го типа) установлена достоверная корреляция с наличием миокардита и степенью его активности: максимальный уровень экспрессии отмечен у больных с активным миокардитом. При этом низкая экспрессия определялась не только у пациентов без миокардита, но и у больных с пограничным миокардитом. Оба факта представляются одинаково важными для понимания сути болезни и в то же время имеют несомненное прикладное значение (для дифференциальной диагностики различных форм миокардита, которые не всегда различимы по степени инфильтрации и некрозу). В отдельных работах показано, что экспрессия генов TLR8 особенно резко возрастает у пациентов с гигантоклеточным миокардитом и саркоидозом (наиболее тяжелыми формами иммунного воспаления) в сравнении с «обычным» активным миокардитом [16].

Если повышенная экспрессия может рассматриваться одновременно и как проявление генетической предрасположенности к аутоиммунному ответу (высокая активность «посредников» между вирусной инфекцией и генами — активаторами иммунного ответа) и как достоверный критерий самого этого ответа, то низкая экспрессия может, напротив, отражать истощение (исходную недостаточную активность?) TLR вследствие их генетически обусловленных особенностей либо гибели КМЦ в процессе болезни. В то же время генетические особенности TLR как механизм предрасположенности к миокардиту и фактор, определяющий характер его течения (активный, пограничный, острый или хронический), изучены недостаточно. В отдельных работах показано наличие доминантного негативного аллеля гена TLR3 как причины сниженной активации интерферона и более тяжелого течения Коксакивирусного миокардита [17], что, однако, не получило подтверждения в недавнем экспериментальном исследовании [18]. Этот вопрос требует дальнейшего углубленного изучения.

Снижение экспрессии TLR9 однократно описано в литературе как уникальный паттерн ДКМП, который отличал ее от миокардита [19]: у пациентов с миокардитом (с сохранной ФВ) и перикардитом уровень экспрессии TLR9 был существенно выше, чем при воспалительной ДКМП и тем более ДКМП без признаков воспаления. Авторы считают такое распределение следствием прогрессирующего уменьшения числа КМЦ, в которых, по их данным, избирательно локализовались TLR9. Однако тот же процесс (убыль КМЦ) может быть следствием хронического миокардита и не свидетельствует о первичной природе ДКМП. Кроме того, по нашим данным, у больных миокардитом (как активным, так и пограничным) TLR9 экспрессируются не только в КМЦ, но и в эндотелии и лимфоцитах (см. рис. 2), т. е. степень экспрессии зависит не только от количества сохранных КМЦ.

В целом ряде работ изучена экспрессия TLR4 у больных (либо экспериментальных животных) миокардитом. В одном из первых таких исследований показан не только более высокий уровень экспрессии TLR4 у больных Коксаки-миокардитом в сравнении с контролем, но и корреляция TLR4 с наличием вирусной РНК и репликацией вируса [20]. Это закономерно, поскольку вирусы являются одним из внешних лигандов, активирующих TLR4. Однако в данной работе отсутствовали вируспозитивные пациенты в контрольной группе; наши данные свидетельствуют, что вирусный геном (ДНК-содержащие вирусы — парвовирус В19 и герпетическая группа) выявляется и у больных без миокардита и сам по себе не является детерминантой, которая обязательно приводит к активации семейства TLR. Можно предположить, что врожденные особенности самих TLR определяют ответ на вирусную инвазию.

Кроме того, доказана повышенная экспрессия TLR 4-го типа у больных с вируснегативным (аутоиммунным) миокардитом [21]; хотя и в этих случаях полностью исключить участие вирусной инфекции в индукции хронического миокардита на основании отсутствия вирусов на момент исследования невозможно. Тем не менее установлено, что TLR4 участвуют в формировании не только патогенассоциированного молекулярного паттерна (так называемый ПАМП), но и ДАМП (danger-associated molecular patterns), который возникает при иных (неинфекционных) механизмах повреждения миокарда, например при инфаркте миокарда, ишемии [22, 23]. В качестве эндогенных лигандов TLR идентифицирован широкий спектр молекул, которые играют роль при различных вариантах повреждения миокарда (белки теплового шока, фибронектин, фибриноген, кальпротектин, церамид и др.) [24]. Таким образом, семейство TLR является одним из универсальных и ключевых звеньев развития и поддержания иммунного миокардита независимо от его этиологии.

Поскольку экспрессия TLR рассматривается как убедительный маркер аутоиммунного механизма миокардита, ее изучение открывает новые возможности в выборе медикаментозной терапии. Уже делаются попытки применения специфических ингибиторов TLR (ингибитора TLR-2 TAK-242, антагониста TLR4 эриторана) для подавления TLR-опосредованного иммунного миокардита [22, 24]). Однако более реальным на сегодняшний день является использование TLR при отборе пациентов на стандартную ИСТ. В нашем исследовании, которое в этом плане можно рассматривать как пилотное, на небольшом числе пролеченных больных установлена близкая к достоверной тенденция к более высокому уровню экспрессии TLR2, TLR9 и более низкому — виментина у больных с хорошим непосредственным ответом на комплексное лечение (включая ИСТ). Низкий уровень виментина, отражающий, вероятно, степень утраты КМЦ, свидетельствует об отсутствии резервов для улучшения. Нами не выявлено корреляции ответа на ИСТ с возрастанием маркеров пролиферации (Ki-67), что согласуется с данными литературы о возрастании их экспрессии не только у больных с хорошим ответом на ИСТ, но и без него, правда в меньшей степени [9].

Наиболее интересными и перспективными в этом направлении представляются результаты исследования группы C. Chimenti и A. Frustaci, принятые к публикации в 2017 г. [25]: на большом клиническом материале (237 больных с морфологически верифицированным вируснегативным миокардитом, получавших ИСТ в течение 6 мес) установлено, что только высокий уровень экспрессии TLR4 в миокарде, измеренный тремя разными методами, высокодостоверно коррелировал с положительным ответом на ИСТ (81,4% больных). Уровень экспрессии 2 балла и более (по 4-балльной шкале) обладал 100% чувствительностью и 90,9% специфичностью в предсказании положительного ответа на ИСТ. С экспрессией TLR4 и ответом на ИСТ коррелировала выраженность апоптоза, но не некроза кардиомиоцитов, что подтверждается экспериментальными исследованиями (активация апоптоза через TLR4 подтверждается и в эксперименте [23]) и позволяет предполагать преимущественные точки приложения ИСТ, дающие клинический эффект.

Несомненно, эта работа открывает реальные перспективы более точного отбора кандидатов на ИСТ, хотя существенным ограничением работы итальянских исследователей нам представляется исключение вируспозитивных (в том числе парвовирус В19+) больных миокардитом, процент которых достаточно велик. На основании собственных данных (настоящая работа, а также результатов ИСТ у вируспозитивных больных [26]) мы можем предполагать, что предсказательная ценность экспрессии TLR сохранится независимо от наличия вирусов. Кроме того, большое клиническое значение с учетом невозможности выполнения ЭМБ всем пациентам с подозрением на миокардит могла бы иметь одновременная оценка экспрессии TLR в крови. В отдельных исследованиях показана корреляция уровня TLR в крови и миокарде (в частности, TLR2 при реакции отторжения трансплантата [27]), что позволяет продолжить исследования в данном направлении.

В заключение следует отметить, что для решения проблемы миокардита ведется интенсивный научный поиск с применением ИГХ и молекулярно-генетических методов исследования, направленный как на понимание фундаментальных механизмов болезни, так и на улучшение ее диагностики и лечения. В частности, европейские исследователи проявляют значительный интерес к изучению роли различных микро-РНК (21, 155, 146b, 221, 590 и др.) в патогенезе и диагностике миокардита. Однако оценка экспрессии TLR уже сегодня должна входить в клиническую практику.

Ограничениями настоящего исследования являются относительно небольшое число больных в каждой подгруппе, а также число пациентов, получавших ИСТ, что не позволило определить чувствительность и специфичность выявленных предикторов ответа на лечение.

Выводы

1. Определение уровня экспрессии TLR2 и TLR9 в миокарде может служить ИГХ-маркером миокардита и сохранения его активности, что особенно ценно при дифференциальной диагностике у больных с пограничными формами болезни: при активном миокардите экспрессия обоих маркеров достоверно выше, чем при пограничном и его отсутствии — 1,5 [1; 1,5] в сравнении с 0 [0; 0,75] для TLR2 и 4 [3; 4] в сравнении с 2 [2; 2] для TLR4 (p<0,001). При пограничном миокардите экспрессия TLR2 и TLR9 ниже, чем без миокардита (0 [0; 0] против 0 [0; 1] балла и 2 [1,5; 2] против 2 [2; 3]), что может отражать гибель/истощение кардиомиоцитов на поздних стадиях болезни. Отмечена также тесная корреляция уровней экспрессии TLR2 и TLR9 между собой (r=0,824, р<0,001) и с уровнем Ki-67 в строме (r=–0,531 и r=–0,702, р<0,01).

2. Выраженная экспрессия данных маркеров врожденного иммунитета может отражать как один из механизмов генетической предрасположенности к развитию миокардита и его тяжелому течению, так и вторичную их активацию в патогенезе заболевания и является потенциальной мишенью терапии (иммуносупрессивной либо специфическими ингибиторами TLR).

3. При пограничном миокарде отмечена низкая даже в сравнении с пациентами без миокардита экспрессия TLR2 (0 [0; 0] против 0 [0; 1]) и TLR9 (2 [1,5; 2] против 2 [2; 3]), а также c-kit и К-67, что может отражать как исходную неспособность к активному аутоиммунному ответу, так и истощение механизмов активации аутоиммунитета в процессе болезни (т.е. ее стадию).

4. Достоверной корреляции экспрессии TLR2 и TLR9, а также морфологических признаков миокардита с наличием вирусного генома в крови/миокарде не установлено, что свидетельствует в пользу первичности в развитии болезни свойств макроорганизма, одним из которых может быть генетически запрограммированный уровень активности TLR.

5. Высокий уровень экспрессии TLR2 и TLR9, а также низкий уровень экспрессии виментина в миокарде должны изучаться в качестве прогностических критериев для определения потенциальных кандидатов на успешную иммуносупрессивную терапию миокардита независимо от наличия вирусного генома в миокарде.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Е.А.К., О.В.Б., А.В.Н., В.А.С.

Сбор и обработка материала: Е.А.К., О.В.Б., Н.М.Ф., А.В.Н., В.А.С.

Статистическая обработка: О.В.Б.

Написание текста: О.В.Б.

Редактирование: Е.А.К., А.В.Н.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благова Ольга Владимировна — д.м.н., проф. каф. факультетской терапии №1 лечебного факультета; e-mail: blagovao@mail.ru;
ORCID: http://orcid.org/0000-0002-5253-793X

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail