Молекулярно-биологические маркеры пролиферации, апоптоза и ангиогенеза при диффузном токсическом зобе

Диффузный токсический зоб (ДТЗ) — аутоиммунное заболевание, в основе которого лежит продукция аутоантител к собственному рецептору тиреотропного гормона (ТТГ) [1]. До настоящего времени остается неясным, какие факторы влияют на клиническое течение заболевания и соответственно определяют возможность прогнозирования консервативного и оперативного лечения. В последние годы в литературе обсуждаются вопросы, связанные непосредственно как с изучением состояния иммунной системы при ДТЗ, так и с процессами, происходящими в щитовидной железе (ЩЖ), — пролиферацией, апоптозом, ангиогенезом.

Ядерный белок Ki-67 широко используется в качестве маркера пролиферации [2, 3], в том числе и тиреоцитов. Имеются данные, что при ДТЗ по сравнению с диффузно-узловым нетоксическим зобом (ДУНЗ) экспрессия Ki-67 в тиреоцитах значимо выше [4].

Увеличение количества тиреоцитов при ДТЗ может быть связано не только с повышенной пролиферацией, но и с замедлением апоптоза клеток тиреоидного эпителия. Апоптоз может быть запущен двумя основными механизмами. Внешний путь активации апоптоза связан с семейством рецепторов смерти, в том числе с Fas/FasL-взаимодействием. Внутренний путь связан с ответом на цитотоксические стимулы или со снижением ростовых факторов и трофических сигналов, поступающих в клетку в виде цитокинов [5, 6]. Оба пути приводят к активации инициаторных каспаз (каспаз 8 и 10 в первом случае и каспазы 9 во втором).

В литературе имеются работы, в которых показано, что при ДТЗ повышается экспрессия антиапоптотических молекул, таких как Bcl-2, и снижается экспрессия Fas, что может способствовать подавлению апоптоза и усилению пролиферации тиреоцитов [7—11]. Изучаются связи между экспрессией различных белков ЩЖ и иммунологическими показателями. В работе A. Bossowski и соавт. [12] выявлена статистически значимая корреляция между экспрессией Bcl-2 в тиреоцитах у больных ДТЗ и уровнем антител к рецептору ТТГ (r=0,47; р<0,03).

В настоящее время изучается экспрессия ангиогенных факторов в ЩЖ у больных ДТЗ. Одним из важнейших ангиогенных факторов является сосудистый фактор роста (VEGF). Работы по изучению VEGF у больных ДТЗ неоднозначны. Так, по данным A. Jebreel и соавт. [13], различий между плотностью стенок сосудов и патологией ЩЖ не выявлено. При сравнении VEGF у больных с аутоиммунной патологией ЩЖ и заболеваниями с автономной дисфункцией было показано, что экспрессия VEGF при аутоиммунных заболеваниях ниже. P. Malkomes и соавт. [14] показали противоположные результаты — значимую экспрессию VEGF и его рецепторов (VEGF-R1 и VEGF-R2) в ткани ЩЖ у оперированных больных ДТЗ. Авторы делают вывод, что выявленные изменения могут способствовать пролиферации тиреоцитов и соответственно развитию и рецидивированию зоба.

Фактор роста фибробластов (FGF) участвует в регуляции ангиогенеза и имеет множество функций, включая пролиферацию и хемотаксис из нескольких типов клеток, включая фибробласты, эндотелиальные клетки и гладкомышечные клетки [15]. В 1998 г. N. Emoto и соавт. [16] показали высокий уровень экспрессии FGF при ДТЗ. По результатам экспериментальных работ в других тканях существует взаимозависимость уровня FGF и VEGF. FGF-2 индуцирует экспрессию генов VEGF на эндотелиальных клетках [17, 18]. Вполне вероятно, что FGF может выступать в качестве ангиогенного фактора и в ЩЖ при непосредственном воздействии VEGF и индуцировать развитие зоба.

Таким образом, в основе патогенеза ДТЗ лежит несколько неразрывно связанных между собой процессов.

Целью настоящего исследования явилось изучение клинико-лабораторных показателей, а также экспрессии белков Ki-67, Bcl-2, Bax, Fas-L, CD34, VEGF, FGF при различном послеоперационном исходе у больных, оперированных по поводу ДТЗ.

В исследование были включены 24 женщины, которым в связи с отсутствием ремиссии ДТЗ более чем 2 года от момента включения в исследование была выполнена операция по методике Е.С. Драчинской. В зависимости от уровня ТТГ все пациенты были разделены на три группы: 1-я группа — после операции сохранялся стойкий эутиреоз; 2-я группа — развился гипотиреоз; 3-я группа — развился тиреотоксикоз. Оценивали показатели лабораторных и инструментальных методов исследования и их динамика в процессе лечения. Уровни ТТГ, св. Т₄, св. Т₃, содержание в сыворотке крови антител к рецептору ТТГ и антител к ТПО оценивали иммуноферментным методом. Объем Щ.Ж. рассчитывали по данным ультразвукового исследования (УЗИ).

У 24 больных ДТЗ сделаны серийные срезы ЩЖ толщиной 5 мкм. Проводили иммуногистохимические реакции по стандартному протоколу. Для визуализации использовали компоненты системы NovoLink Polymer Detection System (500 test) фирмы «Novocastra» (Великобритания). Были использованы первичные антитела (Ki-67 клон MIB-1, «ДАКО», Дания; Bax клон SP47, «Спринт», США; Bcl-2 клон 124, «ДАКО», Дания; Fas-L клон 5D1, «Новокастра», Великобритания; VEGF «Новокастра», Великобритания; FGF «Новокастра», Великобритания). Результаты реакции оценивали морфометрически. Подсчет объектов в иммуногистохимических препаратах осуществляли с использованием светового микроскопа, объектив ×40, бинокулярная насадка ×1,5 и окуляры ×10. При помощи цифровой камеры оптическое изображение переводилось в цифровое и далее морфометрия выполнялась с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений ВидеоТесТ — Морфология 5.2. Экспрессию исследуемого маркера в клеточной популяции оценивали по относительной площади экспрессии, которую рассчитывали как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения, и выражали в процентах. Оценка экспрессии CD34 в сосудах проводилась методом визуального подсчета объектов по Г.Г. Автандилову.

Для объективной оценки функциональной активности ЩЖ интраоперационно были взяты образцы ткани ЩЖ; проанализировано 245 гистологических препаратов (на пациента — не менее 5 из каждой доли, включая узловые образования). Использовали морфометрические количественные показатели, предложенные О.К. Хмельницким [19]: высота тиреоцитов, площадь фолликулов, фолликулярно-коллоидный индекс.

Статистический анализ результатов исследования выполнен с помощью программы Statistica v10.

Средний возраст пациентов ДТЗ составил 45,71±2,56 года. Морфометрическая и лабораторная характеристика больных представлена в табл. 1.

При гистологическом исследовании морфологическая картина ЩЖ отличалась неоднородностью и на одном гистологическом срезе сочетались морфологические признаки повышенной и пониженной функциональной активности (мозаичность строения). Как видно из представленных данных, площадь фолликулов в 3-й группе (пациенты с послеоперационным тиреотоксикозом) была достоверно меньше (6891,36±671,35 мкм), чем во 2-й группе (пациенты с послеоперационным гипотиреозом) (11432,24±1244,57 мкм), р=0,007. При оценке лабораторных показателей исходно уровень антител к рецептору ТТГ крови был достоверно выше (р=0,002) в группе с рецидивом тиреотоксикоза после операции, а антител к ТПО в группе больных с послеоперационным гипотиреозом (р=0,005).

При сопоставлении иммуногистохимических показателей во 2-й и 3-й группах установлена значимо большая экспрессия у пациентов с послеоперационным тиреотоксикозом: Bcl-2 (р=0,001), Ki-67 (р≤0,0001), СD 34 (р=0,005), FGF (р=0,001), VEGF (р=0,001) и соотношения экспрессии Bcl-2/Bax (р=0,007). Анализ Fas-L показал, что экспрессия была выше у больных с послеоперационным гипотиреозом (р=0,002) (табл. 2).

Был проведен корреляционный анализ между изучаемыми показателями. Выявлена значимая корреляционная связь между уровнем антител к рецептору ТТГ и объемом ЩЖ, к рецептору ТТГ и площадью фолликулов, объемом ЩЖ и высотой тиреоцитов, Bcl-2 и уровнем антител к рецептору ТТГ, Bcl-2 и исходным уровнем антител к ТПО, Bcl-2 и Ki-67, Ki-67 и уровнем антител к ТПО, FGF и уровнем антител к рецептору ТТГ, VEGF и уровнем антител к рецептору ТТГ, FGF и объемом ЩЖ, FGF и Ki-67 (табл. 3).

Корреляционный анализ подтверждает тесную связь между иммунологическими, структурными и клиническими показателями.

Для выявления маркера, определяющего послеоперационный исход у больных ДТЗ, была выполнена процедура пошагового дискриминантного анализа. При проведении анализа между 2-й и 3-й группами главной дискриминантной переменной оказался антиапоптотический белок Bcl-2, при его значении более 2,19 вероятность послеоперационного тиреотоксикоза составляет 87,5% (см. рисунок,

Понимание механизмов рецидивирующего течения ДТЗ важно не только с теоретической точки зрения, но имеет большое практическое значение. В настоящее время в связи с невозможностью прогнозирования послеоперационного исхода у больных ДТЗ выполняется экстирпация ЩЖ и пациенты пожизненно принимают гормональную заместительную терапию. Выявленные нами особенности морфогенеза, ангиогенеза и экспрессии белков апоптоза и пролиферации позволяют выделить группу больных ДТЗ с высоким риском развития послеоперационного тиреотоксикоза. По результатам нашего исследования у больных ДТЗ с послеоперационным тиреотоксикозом была установлена значимо большая экспрессия: антиапоптотического белка Bcl-2, маркера пролиферации Ki-67, сосудистых факторов роста (FGF, VEGF) и СD34. Кроме того, выявлено, что при относительной площади экспрессии антиапоптотического белка Bcl-2 более 2,19 или белка пролиферации Ki-67 более 1,059 прогнозируется развитие послеоперационного тиреотоксикоза с вероятностью 87,5%. Выявленная положительная корреляционная связь антител к рецептору ТТГ с объемом ЩЖ и с антиапоптотическим белком Bcl-2 свидетельствует о пролиферативном потенциале ЩЖ на фоне высокого уровня антител к рецептору ТТГ у больных ДТЗ.

Имеются работы, в которых показано, что VEGF может секретироваться непосредственно фолликулярными клетками ЩЖ, вероятно, в ответ на стимуляцию рецептора ТТГ [14, 20]. В нашей работе выявлена сильная корреляционная связь между сосудистыми факторами роста (VEGF, FGF) и уровнем антител к рецептору ТТГ. Можно предположить, что чем активнее стимуляция рецептора ТТГ, тем более выражен синтез сосудистых факторов роста. Вероятно усиление ангиогенеза в свою очередь приводит к еще большей пролиферации тиреоцитов и утяжелению течения ДТЗ, что подтверждается значимыми корреляционными связями между объемом ЩЖ, белком пролиферации Ki-67 и FGF.

Концепция и дизайн исследования: С.В.Д., М.Г.Р

Сбор и обработка материала: С.В.Д., Д.А.А., Ю.С.К.

Статистическая обработка: С.В.Д., Л.А.Б.

Написание текста: С.В.Д., А.Р.В.

Редактирование: М.Г.Р.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.