Структура стенки внутренней сонной артерии при патологической извитости

Патологическая извитость (ПИ) внутренних сонных артерий (ВСА) является второй по частоте причиной развития симптомов сосудисто-мозговой недостаточности, уступая лишь атеросклеротическим поражениям магистральных артерий головы [1]. ПИ ВСА встречается у 5—7% взрослого населения [2—4]. Этиология возникновения таких изменений до сих пор окончательно не выявлена, большинство авторов считают, что извитость сонных артерий является результатом врожденных [5, 6] или приобретенных факторов (артериальная гипертония, атеросклероз, старение) [7—9].

Общепринятой классификации ПИ ВСА не существует. Наибольшее распространение получила классификация патологических форм ВСА, предложенная J. Weibel и W. Fields [10, 11]. Авторы выделяют три типа деформации ВСА, обозначая их как извитость (tortuosity), петлеобразование (coiling) и перегиб артерий (kinking). Петлеобразование характеризуется врожденной круговой деформацией с образованием петли, которая может приводить к нарушению мозгового кровообращения. Под извитостью понимается S- или C-образная деформация ВСА без острых углов и видимых нарушений кровотока. Перегиб представляет собой приобретенное, гемодинамически значимое углообразование ВСА со стенозированием ее просвета (угол перегиба ВСА менее 90°) [12]. Последние два типа развиваются вследствие атеросклероза и фиброзно-мышечной дисплазии стенки артерии [13].

При ПИ ВСА, в основе которой лежит фиброзно-мышечная дисплазия, в интиме артерии отмечается неравномерная гиперплазия c пролиферацией гладкомышечных клеток. В медиальной оболочке выявляются фрагментация эластических волокон, развитие фиброзной соединительной ткани, дистрофия коллагеновых волокон и гладкомышечных клеток [14, 15]. Ведущим морфологическим признаком фиброзно-мышечной дисплазии является нарушение формирования эластических волокон: неравномерное утолщение, расщепление, фрагментация, а также существование молодых, незрелых эластических структур с одновременным неправильным формированием гладкомышечных структур в средней оболочке артерии, их беспорядочной ориентацией, гипертрофией и атрофией, с изменениями тинкториальных свойств цитоплазмы и признаками функциональной активности их ультраструктур, с постепенным количественным уменьшением гладких мышечных клеток наряду с нарастанием процессов фиброза [16]. В адвентиции выявляется фиброз с наибольшей выраженностью по малой кривизне ПИ ВСА, который фиксирует артерию в изогнутом положении [14, 15].

Эластин и коллагены играют центральную роль в определении механических свойств стенки сосуда, обеспечивая прочность при его растяжении. Это достигается с помощью трехмерной сети окончатых эластических мембран средней оболочки артерий, между которыми расположены веретенообразные гладкомышечные клетки и коллагеновые волокна. Высокое содержание коллагеновых фибрилл, прежде всего коллагена I и III типов, в адвентиции также способствует предотвращению разрыва сосудов при высоком артериальном давлении. Процессы повышения жесткости сосудов, обусловленные снижением содержания эластина и увеличением коллагена в стенках сосудов, происходят при различных патологических процессах. Низкое содержание эластина приводит к пролиферации гладкомышечных клеток, уменьшению просвета сосуда и появлению стеноза. Снижение содержания коллагена III типа приводит к хрупкости сосудов и склонности к разрыву крупных артерий. Гладкомышечные клетки выполняют контрактильную и синтетическую функции, продуцируя коллаген и эластин, цитокины и протеазы. Изменение их количества и превалирование синтетической функции над контрактильной приводят к нарушению нормального соотношения компонентов внеклеточного матрикса [17].

Несмотря на активные работы в области изучения ПИ ВСА, на сегодняшний день не существует единой теории возникновения данной патологии и остаются неизученными изменения структуры стенки артерии. Целью данной работы было исследование экспрессии эластина, коллагена I и III типов, матриксной металлопротеиназы 9 (ММП-9) и содержания гладкомышечных клеток в стенке внутренней сонной артерии при ПИ, возникающей на фоне фиброзно-мышечной дисплазии, с использованием иммуногистохимического (ИГХ) метода и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

Проведено исследование образцов артерий 58 пациентов, проходивших хирургическое лечение по поводу ПИ ВСА. При морфологическом исследовании у 34 (59%) пациентов выявлено атеросклеротическое поражение сонных артерий, у 15 (26%) — фиброзно-мышечная дисплазия стенки артерии и у 9 (15%) — ее сочетание с атеросклерозом, т. е. ПИ ВСА наиболее часто развивалась на фоне атеросклеротического поражения артерий (р=0,03).

Для ИГХ-исследования отобран материал с фиброзно-мышечной дисплазией и с сочетанным поражением, в образцах которого имелись достаточные для оценки результатов участки дисплазии (n=21, мужчин — 3, женщин — 18, средний возраст 56,67±10,61 года). Контрольную группу составили 11 образцов внутренних грудных артерий (мужчин — 7, женщин — 4, средний возраст 59,27±8,27 года), полученных при операции маммарокоронарного шунтирования. Для анализа результатов пациенты были поделены на группы в зависимости от возраста: молодой возраст — 25—44 года, средний — 45—59 лет и пожилой возраст — 60—75 лет. По типам извитости материал был разделен следующим образом: с петлеобразованием (coiling) и перегибом (kinking) — по 4 (19%) образца, с C-образной деформацией ВСА — 3 (14%) образца и с S-образной деформацией — 10 (48%).

Материал фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине и после гистологической проводки заливали в парафин. Для гистологического исследования срезы толщиной 3—4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, а также применяли комбинированную окраску фукселином и пикрофуксином.

Для ИГХ-исследования срезы толщиной 3—4 мкм монтировали на высокоадгезивные предметные стекла («Gerhard Menzel GmbH»). Депарафинирование и ИГХ-исследование проводилось по стандартному протоколу в автоматическом режиме в иммуногистостейнере Bond-Max («Leica»). Использовали первичные антитела к эластину (клон 10В8, «Abcam», разведение 1:400), коллагену I типа (клон 3G3, «Abcam», разведение 1:200), коллагену III типа (клон Col-29, «Abcam», разведение 1:100) и гладкомышечному актину (SMA, клон 1A4, «Dako», разведение 1:400). В каждой серии препаратов использовали соответствующие положительные и отрицательные контроли. Срезы докрашивались гематоксилином. Препараты исследовали с помощью световой микроскопии. Результаты иммунопероксидазной реакции оценивали полуколичественным методом: (–) — отсутствие экспрессии, (+)  — слабая, (++) — умеренная, (+++) — выраженная интенсивность иммунопероксидазной реакции. Для анализа данных типы экспрессии объединили в 2 группы: низкая (–, + для коллагена III типа и +, ++ для остальных маркеров) и высокая (++ для коллагена III типа и +++ для остальных маркеров) экспрессия. Для визуализации изображения использовали цифровую камеру («Leica»).

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Исследование проводили на тонких депарафинизированных и дегидратированных срезах (2—4 мкм) с парафиновых блоков. Температурную демаскировку антигенов проводили с использованием 0,01 М цитратного буфера, рН 6,0, под давлением. Для промывки использовался фосфатносолевой буфер с твином-20. Срезы инкубировали в течение 30 мин с блокирующей сывороткой при комнатной температуре. После промывки наносили первые первичные антитела к ММП-9 (клон 439, «Novocastra», разведение 1:80) и инкубировали 1 ч при комнатной температуре. В качестве вторичных антител использовали Alexa fluor 647, «Abcam». После дополнительной отмывки образцы инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре со вторыми первичными антителами к эластину (клон 10В8, «Abcam», разведение 1:400). В качестве вторичных антител использовали Alexa fluor 488, «Abcam». После отмывки срезы докрашивали DAPI, appliChem. Все образцы заключали в монтирующую среду DACO. Результат: первые антитела — красная флюоресценция; вторые антитела — зеленая флюоресценция; двойное окрашивание — голубая флюоресценция; контрастированное ядро — синяя флюоресценция. Исследование образцов проводили на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе Olympus FV1000D. Для изучения объектов получали спектры флюоресценции и определяли количественные характеристики. Проводили измерение двух параметров — относительную площадь экспрессии и площадь колокализации. Относительную площадь экспрессии рассчитывали как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах. Флюоресценцию с определенными спектральными характеристиками регистрировали только в плоскости (2D).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программного обеспечения SPSS Statistics 17.0 for Windows. Достоверность различий между сравниваемыми группами (р) определяли с помощью критерия χ² и точного метода Фишера. Для всех проведенных анализов различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05.

При гистологическом исследовании ВСА с фиброзно-мышечной дисплазией выявляли утолщенную интиму, нарушение структуры средней оболочки с фрагментацией эластических волокон, беспорядочным расположением коллагеновых волокон, формированием фиброзных разрастаний, местами отмечали деструкцию внутренней эластической мембраны.

При исследовании ИГХ-методом в контрольной группе у большинства пациентов (63,5%) отмечали низкую экспрессию эластина в медиальной оболочке артерий и лишь у 36,5% больных — высокую экспрессию (рис. 1, а). В то время как при ПИ ВСА содержание эластиновых волокон в медии было выше (у 81% — высокая экспрессия, у 19% — низкая; р=0,03), но выявляли их фрагментацию (см. таблицу, рис. 1, б).

Содержание коллагена I типа в средней оболочке стенки артерий было примерно одинаковым в обеих группах: в большинстве случаев отмечалась низкая экспрессия (90% при ПИ и 91% в контрольной группе; р>0,05) (см. рис. 1, в). Сопоставление экспрессии коллагена III типа также не показало достоверных различий между группами (р>0,05). У пациентов с ПИ в группе сравнения превалировала низкая экспрессия данного маркера — 90 и 73% соответственно (см. рис. 1, г). При этом в адвентиции содержание обоих типов коллагена было высоким как при ПИ, так и в контрольной группе.

Сравнение содержания гладкомышечных клеток выявило достоверные различия между группами (р=0,01): при ПИ ВСА низкую и высокую экспрессию гладкомышечного актина отмечали примерно в одинаковом количестве случаев (54 и 47% соответственно), в то время как в контрольной группе во всех образцах обнаружена его высокая экспрессия (100%) (см. рис. 1, д, е).

Поиск корреляций экспрессии каждого из четырех маркеров с полом и возрастом ни при ПИ ВСА, ни в контрольной группе зависимости не выявил (р>0,05). Ассоциации показателей экспрессии изучаемых маркеров с типом патологической извитости также не найдены (р>0,05).

Таким образом, выявлено, что при ПИ ВСА отмечается нарушение эластических свойств сосуда за счет разрушения эластических волокон, что согласуется с данными других авторов [14, 16]. При этом содержание коллагена I и III типов как в медиальной оболочке, так и в адвентиции остается неизменным. Уменьшение количества гладкомышечных клеток может приводить как к ухудшению механических свойств артерии, так и к нарушению синтеза ими компонентов внеклеточного матрикса. В работе G. La Barbera [15] также продемонстрировано уменьшение количества эластических волокон и гладкомышечных клеток.

При исследовании методом конфокальной микроскопии уровня экспрессии ММП-9, разрушающей эластин, и эластина в контрольной группе получены следующие значения: экспрессия ММП-9 составила 4,3±0,69; эластина — 16,2±1,48 (рис. 2, а). В группе ПИ ВСА выявлена экспрессия ММП-9 26±1,26; эластина 9,1±0,36 (см. рис. 2, б). При сравнении экспрессии ММП-9 и эластина между группами выявлены достоверные различия (p<0,03 для ММП-9; р<0,05 для эластина). При этом отмечалась коэкспрессия данных маркеров в 16,9% случаях, т. е. в группе контроля наблюдался высокий уровень экспрессии эластина и низкий уровень экспрессии протеиназы, и, напротив, в группе ПИ — низкое содержание эластина и высокое — протеиназы. Таким образом, при ПИ ВСА происходит разрушение эластина матриксной ММП-9.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что одной из причин возникновения ПИ является нарушение эластических свойств сосуда за счет деструкции эластических волокон и их фрагментации, а также снижения количества гладкомышечных клеток и нарушения их синтетической функции, что обусловливает в свою очередь усиление активности ММП-9 и деградацию тканевого матрикса.

Следует обратить внимание, что в данной работе не использовали все возможности конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, позволяющей исследовать материал не только на плоскости по осям X, Y, но и в объеме по оси Z. Это обусловлено использованием тонких срезов с парафиновых блоков, а не толстых (10—25 мкм) криостатных срезов, позволяющих исследовать искомые антигены в толще, восстанавливая структуру ткани и определяя коэкспрессию и взаиморасположение их на всем протяжении объекта. Эти задачи являются предметом нашего дальнейшего исследования.

Участие авторов:

Дизайн и концепция исследования: А.В.Г.

Сбор и обработка материала: С.А.О., А.Г.И., А.В.А., Е.М.П.

Статистическая обработка данных: Ю.С.К., В.О.П.

Написание текста статьи: Е.М.П., С.А.О., В.О.П.

Редактирование: А.В.Г.

Конфликт интересов отсутствует.