Список сокращений

ГБ — глиобластома

GDNF — глиальный нейротрофический фактор

кДНК — комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота

ПЦР — полимеразная цепная реакция

Введение

Глиомы головного мозга — гетерогенная группа опухолей нейроэктодермального происхождения. На данный момент существует несколько классификаций глиом, основанных как на гистологических характеристиках опухоли, так и на молекулярных маркерах. По злокачественности глиомы подразделяются на 4 степени (Grade). Самая агрессивная форма — глиобластома (ГБ) — относится к Grade IV и характеризуется наиболее негативным прогнозом. Для мультиформной глиобластомы свойствен быстрый и высокоинтенсивный рост, однако одна из самых важных причин негативного прогноза у пациентов с данным заболеванием заключается в инвазивных или миграционных (различные школы по-разному называют процесс перемещения клеток опухоли в здоровые ткани мозга) свойствах клеток опухоли [1]. Инвазивный характер глиомы высокой степени злокачественности является основным источником рецидива [2]. Даже при наличии лучших методов визуализации трудно обнаружить клетки, которые мигрировали от первичной опухоли, иногда даже в противоположное полушарие, что делает невозможным полную хирургическую резекцию опухоли [3]. В исследованиях глиом используют либо известные клеточные линии, либо тканевый клинический образец удаленной опухоли. Этот подход не позволяет изучать генетические и эпигенетические характеристики клеток, способных к миграции [4, 5].

Глиальный нейротрофический фактор (GDNF), член надсемейства трансформирующего фактора роста-β (TGF-β), является растворимым внеклеточным малым белком; изначально было обнаружено его влияние на выживание и дифференцировку дофаминергических нейронов [6]. Известны две канонические сплайс-изоформы GDNF, различающиеся на 26 аминокислот (78 п. н.): полноразмерная — α-pro-GDNF (αGDNF) (NM_001190468.1, NCBI) и изоформа покороче — β-pro-GDNF (βGDNF) (NM_000514.4, NCBI) [7]. В ряде исследований показано, что белок GDNF способствует пролиферации и миграции опухолевых клеток и участвует в онкогенезе глиомы [8—10]. В незначительном количестве работ упоминается о том, что повышенная экспрессия GDNF в клетках глиомы увеличивает их миграцию за счет роста производства металлопротеиназы MMP-13 и воздействия на каскады MEK/ERK и JNK, c-Jun и AP-1 [10]. Уровень экспрессии GDNF значительно выше в злокачественной глиоме, чем в нормальной ткани головного мозга человека [11, 12]. Показано, что GDNF также связан с миграционными свойствами клеток глиомы [13]. Известно, что GDNF участвует в молекулярных каскадах через взаимодействие со своими рецепторами α1(GFRα1) и Ret [14, 15]. Однако ряд исследователей, изучающих влияние GDNF на миграционные свойства клеток глиомы, показали, что в патологическом процессе молекулы адгезии интегрина β1 и нейронального кадгерина (N-кадгерина) также могут выступать в качестве рецепторов сигнальной трансдукции GDNF [16, 17]. Инвазивные свойства связаны со снижением адгезии между отдельными клетками опухоли, а также с большей адгезией опухолевых клеток с внеклеточным матриксом. Было показано увеличение содержания N-кадгерина в глиоме по сравнению с нормальной мозговой тканью млекопитающих [18—20]. В дальнейшем обнаружено, что мигрирующие клетки глиомы имеют на своей поверхности не просто N-кадгерин, а прекурсорную форму зрелого белка ProN-кадгерин [21]. Таким образом, в работе Y. Xiong и соавт. было продемонстрировано, что proN-кадгерин опосредует миграцию клеток глиомы, промотированной GDNF, и проясняет новый молекулярный механизм, лежащий в основе инвазии и миграции клеток глиомы [22].

Наше исследование посвящено анализу в культурах клеток глиом человека различной степени злокачественности (Grade I—IV) и миграционной активности экспрессии матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) сплайс-вариантов GDNF [23—25]. Было проведено сравнение паттернов экспрессии конвенциональных сплайс-форм pre-α-pro-GDNF (αGDNF) и pre-β-pro-GDNF (βGDNF) в образцах 15 глиом человека в корреляции с диагностированной степенью злокачественности опухоли и интенсивностью миграции ее клеток.

Материал и методы

Культуры клеток

Культуры клеток (см. таблицу) были получены из ткани глиом человека после резекции опухоли. Технология обработки описана ранее [23]. Клеточные культуры использовались после пятого пассажа, поскольку известно, что на ранних этапах пассирования клеточная культура сохраняет свойства первичной опухоли. Миграцию клеток оценивали с помощью вставок transwell с диаметром пор 8 мкм для 24-луночных плашек (353097, «Corning», США) по протоколу, описанному ранее [25].

Проводили анализ изоформ на стадии транскриптов. Для этого получали тотальную РНК из клеток глиомы и комплементарную дезоксирибонуклеиновую кислоту (кДНК), которая далее анализировалась методом Саузерн-блот-гибридизации с использованием ДНК-зонда, соответствующего нуклеотидам (432; 817) транскрипта GDNF (NM_00514.4, NCBI).

Получение тотальной РНК

Образцы клеток глиом (10^6—10⁷ клеток) лизировали в 1 мл RNAzol (MRC, США), и выделяли тотальную РНК в соответствии с протоколом производителя.

Для получения кДНК применяли выделенную тотальную РНК, обратную транскриптазу MMLV (MMLV RT kit, «Евроген») и рандомный N10 праймер («Евроген», Россия) в соответствии с протоколом производителя. Полученную кДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) в присутствии высокоточной Phusion-полимеразы («Thermo Fisher», США). Нормализацию кДНК выполняли по гену домашнего хозяйства β-актин — ACTB. Использовали следующие праймеры:

F1 5’-CCG GAC GGG ACT TTA AGA TGAA

F2 5’-TCA CCA GAT AAA CAA ATG GCA GTG CTT

R 5’-GGA GTC AGA TAC ATC CAC ACC TTT

Параметры ПЦР: предварительная денатурация 94 °C 3 мин; 30 циклов амплификации (15 с денатурации при 94 °C; 15 с отжиг праймеров при 58 °C; 40 с элонгации при 72 °C); финальная элонгация 72 °C 3 мин.

Саузерн-блот-гибридизация кДНК продуктов

Полученные ПЦР-продукты разделяли в 1,5% агарозном геле в 1×TBE-буфере (89 мМ Трис, 89 мМ борной кислоты и 2 мМ ЭДТА, pH 8.3) в течение 1,5 ч при напряжении 5 V/см. После разделения ампликоны переносили капиллярным способом на позитивно-заряженную нейлоновую мембрану («Roche», Германия) в денатурирующих условиях (NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M) и проводили Саузерн-гибридизацию в буфере Church—Gilbert («G-biosciences», США). В качестве ДНК-зонда при Саузерн-гибридизации использовали последовательность, соответствующую нуклеотидам (432;817) транскрипта GDNF (NM_00514.4, NCBI). ДНК-зонд был конъюгирован с dUTP-biotin («Thermo Fischer», США) в результате амплификации методом ПЦР (праймеры F2 и R). Для детекции результатов гибридизации мембрану, предварительно обработанную блокинг-реагентом («Roche», Германия), инкубировали в присутствии стрептавидина, меченного пероксидазой хрена («Abcam», США), и затем использовали систему HRP-luminol ECL Detection Reagents («Amersham-Pharmacia Biotech», Франция) согласно протоколу производителя с экспозицией от 30 с до 3 мин с применением ChemiDoc XRS («Bio-Rad», США). Интенсивность люминесценции определяли с помощью программы ImageJ 1.53n. Эксперимент проводили в трех повторениях, результаты представлены в виде среднего значения±SEM.

Результаты

Для исследования отобраны 15 культур клеток, которые характеризовались различной степенью злокачественности. Ранее была охарактеризована миграционная активность клеток данных культур (см. таблицу) [23—27].

Краткая характеристика культур клеток глиомы человека по степени злокачественности и миграционной активности

Примечание. NOS - статус не уточнен, n/a — данные не опубликованы.

В связи с тем, что глиомы низкой (I и II) степени злокачественности крайне сложно выводятся в перевиваемую клеточную культуру, в нашей выборке оказалась только одна культура Grade I, и 3 — Grade II.

В результате Саузерн-блот-гибридизации в образцах были обнаружены транскрипт-варианты, соответствующие по подвижности известным ранее двум конвенциональным изоформам GDNF — αGDNF и βGDNF. Кроме того, после гибридизации определены другие сплайс-варианты GDNF, требующие дальнейшего изучения.

Анализ экспрессии GDNF в различных глиомах показал разнородность в уровне экспрессии сплайс-вариантов в зависимости от степени злокачественности глиомы (см. рисунок, а, б).

Анализ экспрессии GDNF в глиомах I—IV Grade.

1 — G47; 2 — G44; 3 — G37; 4 — G11; 5 — G73; 6 — G39; 7 — G23; 8 — Sus\fP2; 9 — G22; 10 — Sh\fP3; 11 — G01; 12 — G134; 13 — G1832; 14 — G 40; 15 — G13. а — Саузерн-гибридизация продуктов амплификации гена GDNF. Гибридизации с ДНК-зондом на зрелую часть GDNF нормализовали кДНК на β-актин; б — процентное соотношение уровней экспрессии pre-α-pro-GDNF (αGDNF) (558 п. н.) и pre-β-pro-GDNF (βGDNF) (480 п. н.) в различных культурах клеток глиом. Результаты представлены в виде среднего значения±SEM.

При сравнении интенсивности экспрессии мРНК αGDNF и βGDNF выявлено незначительное преобладание экспрессии именно полноразмерной формы αGDNF. Однако в клеточных культурах, для которых характерна крайне низкая миграционная способность (G47, G37), обнаруживалась следовая полоса βGDNF. Данный факт интересен и требует дальнейшего исследования, так как есть предположение, что βGDNF играет роль в нейродегенерации и гибели нейронов. Возможно, что следовая экспрессия только этой формы может служить характеристикой отсутствия инвазивных свойств опухоли. Еще в одном образце, Sh/fP2, была обнаружена также низкая активность экспрессии GDNF, однако мы выявили следовую экспрессию формы нейротрофического фактора αGDNF. Этот интересный факт необходимо проанализировать, возможно, на большей выборке.

При оценке клеточных культур глиомы низкой злокачественности (исключая спорную G1832) и интенсивности экспрессии в них αGDNF и βGDNF мы обнаружили, что в клетках глиом Grade II αGDNF и βGDNF экспрессируются очень незначительно, исключение составляет культура G13. Возможно, эта культура является пограничной между II и III степенями злокачественности и требует в дальнейшем более внимательной оценки онкомаркеров.

В глиоме I Grade (G1832) было показано, что, помимо αGDNF и βGDNF, наблюдается высокий уровень экспрессии неизвестных транскриптов (см. рисунок). Этот факт требует дальнейшего изучения.

Экспрессия транскриптов GDNF в глиомах Grade II неодинакова (см. рисунок). В клетках G47 (1) наблюдается низкий уровень экспрессии транскриптов GDNF и только бета-изоформы, а в G44 — экспрессия и альфа-, и бета-изоформ с незначительным преобладанием альфа-изоформы. В то же время в G13 показана более выраженная экспрессия по сравнению с остальными культурами клеток этой степени злокачественности (см. рисунок, б).

Исследование образцов G37, G11, G73, G39, G134 показало, что глиомы Grade III преимущественно экспрессируют конвенциональные изоформы GDNF — α и β (см. рисунок). Среди них образец G134 выделяется низкой экспрессией транскриптов, а образец G37 — слабой экспрессией только бета-изоформы.

В глиомах Grade IV (дикого типа IDH1, т.е. глиобластомах) наблюдается разнородность как в интенсивности экспрессии транскриптов, так и в собственно экспрессии транскрипт-вариантов (см. рисунок). На рисунке видно, что в образцах G23, Sh\fP3 уровень экспрессии транскриптов значительно ниже, чем в Sus\fP2, G22, G01, G40. И, помимо более низкого уровня, наблюдается экспрессия только одного транскрипт-варианта: в случае образца G23 — βGDNF, а в случае Sh\fP3 — αGDNF. Образцы клеток Sus\fP2 и G22 выделяются на фоне остальных гиперэкспрессией транскриптов конвенциональных изоформ, но также и экспрессией дополнительных транскрипт-вариантов. При этом анализ клеток G01 и G40 показал умеренную экспрессию только двух конвенциональных сплайс-вариантов.

Образцы с низким уровнем экспрессии мРНК GDNF — Sh\fP3, G134 — характеризуются как клеточные культуры с низкими миграционными свойствами. В образцах активно мигрирущих клеточных культур глиом — G11, G01, G40 — выявлен средний уровень экспрессии мРНК двух изоформ GDNF.

Таким образом, наибольшая интенсивность экспрессии αGDNF и βGDNF выявлена в клеточных культурах глиом высокой степени злокачественности (Grade III, IV), также в этих культурах миграционная способность клеток была высокой. Низкая экспрессия βGDNF при отсутствии экспрессии αGDNF оказалась характерной только для глиом с низкой миграционной активностью.

Кроме того, после гибридизации были обнаружены дополнительные (помимо конвенциональных альфа- и бета-изоформ GDNF) сплайс-варианты, но клонировать и секвенировать нуклеотидную последовательность на данном этапе работы не удалось.

Заключение

Инвазия опухолевых клеток в нормальную ткань представляет собой многофакторный процесс, включающий взаимодействия с окружающими клетками и внеклеточным матриксом, а также сопутствующие биохимические механизмы, поддерживающие активное движение клеток. Процесс инвазии активируется рецепторами клеточной поверхности, среди которых значимы рецепторы тирозинкиназы (PTK), Wnt, TGF-β, NOTCH и др. [28—30].

Необходим поиск новых маркеров, которые позволят детектировать мигрирующие клетки глиомы, что даст возможность изучить их свойства и разработать технологии управления их миграцией.

Одним из таких маркеров может стать GDNF, повышенная экспрессия которого в глиомах высокой степени злокачественности описана рядом исследователей [8—10]. GDNF играет важную роль в клетках нервной системы в норме, он экспрессируется и секретируется глиальными клетками, такими как астроциты. Однако его обнаруженная экспрессия в клетках глиом привлекла внимание исследователей к изучению его роли и в патологии [8, 31]. Известно, что GDNF усиливает миграцию и инвазивные свойства клеток линии U251 (ГБ человека), а также способствует прогрессированию глиом [32, 33].

Глиальный нейротрофический фактор представлен различными изоформами; на данный момент описаны изоформы αGDNF и βGDNF, которые играют важную роль в регуляции жизнеспособности, дифференцировки и функционирования нейронов. В контексте глиом изучение экспрессии этих сплайс-вариантов связано с особенностями поведения опухолевых клеток, включая их миграционную активность. Исследование паттернов экспрессии αGDNF и βGDNF в клетках глиом может пролить свет на механизмы злокачественного прогрессирования и инвазивности опухолей.

Мы также подтвердили, что высокая экспрессия суммарного GDNF характерна для полученных у человека клеток культур глиом с высокими миграционными свойствами. Мы проанализировали экспрессию известных сплайс-вариантов αGDNF и βGDNF и показали, что в обоих случаях она закономерно увеличивается в клетках с высокими миграционными свойствами. Такие исследования ранее не проводились. В доступной литературе мы не обнаружили работ по изучению транскриптов GDNF и поиску новых форм в опухолевых клетках глиом человека, особенно в клетках глиом с разной способностью к миграции. Связь GDNF со степенью злокачественности неочевидна, в большинстве клеточных культур ГБ наблюдается возрастание и αGDNF, и βGDNF. При этом показано, что общий уровень экспрессии GDNF повышен в клетках глиом человека с высокой миграционной активностью. Изоформы αGDNF и βGDNF демонстрируют закономерное увеличение экспрессии в активно мигрирующих клетках, что может свидетельствовать об их участии в регуляции миграционных свойств опухоли. Отсутствие экспрессии αGDNF при одновременно низкой экспрессии βGDNF может быть прогностическим признаком низкой миграционной активности клеток глиомы человека. Пока затруднительно говорить об их значимости в миграции или степени злокачественности опухолевых клеток. Но сам факт наличия отдельно экспрессирующихся αGDNF и βGDNF привлекает внимание и требует дальнейшего исследования. Экспрессия изоформ GDNF может иметь значение для определения степени инвазивности опухоли, а также сам фактор потенциально может быть использован в качестве терапевтической мишени. Наличие альтернативного сплайсинга GDNF в некоторых глиомах требует дальнейшего изучения.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Павлова Г.В.

Сбор и обработка материала — Павлова С.А., Захарова Л.Г., Шамадыкова Д.В.

Написание текста — Шамадыкова Д.В.

Редактирование — Павлова Г.В.

Финансирование

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ №24-15-00157.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Комментарий

При диффузных, инвазивно растущих опухолях, к которым относится абсолютное большинство глиом, радикальное вмешательство невозможно. С повышением степени злокачественности опухоли некоторые ее клетки становятся более мобильными и распространяются на значительное расстояние от первичного очага, в том числе в противоположное полушарие головного мозга. Существует гипотеза, что эти наиболее агрессивные клетки и определяют плохой прогноз при глиомах высокой степени злокачественности, и разработка способов целенаправленного воздействия на инвазивные свойства новообразования может привести к прогрессу в лечении этих опухолей, включая глиобластому.

Для разработки методов воздействия необходима идентификация агрессивных клеток в культуре опухоли (поскольку микроскопически эти клетки не отличаются от других, менее агрессивных, составляющих большинство). Для этого и был предложен метод определения выработки (экспрессии) изоформ глиального нейротрофического фактора клетками глиом различной степени злокачественности. Показано, что экспрессия этого фактора коррелирует с миграционной активностью клетки, что дает в руки исследователей инструмент для выявления таких клеток в культуре и обеспечивает возможность объективной оценки степени инвазивности опухолей ЦНС.

А.В. Козлов (Москва)