Бывальцев В.А.

отдел нейрохирургии и ортопедии Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии Сибирского отделения РАМН; НУЗ Дорожная клиническая больница ОАО "РЖД", Иркутск

Панасенков С.Ю.

НУЗ Дорожная клиническая больница ОАО "РЖД", Иркутск

Цыганов П.Ю.

Отдел лазерной физики и нанотехнологий Национального исследовательского Иркутского государственного технического университета

Белых Е.Г.

отдел нейрохирургии и ортопедии Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии Сибирского отделения РАМН

Сороковиков В.А.

Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии Сибирского отделения РАМН, Иркутск; ГБОУ ДПО "Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования"

Наноструктурный анализ поясничных межпозвонковых дисков на разных стадиях дегенеративного процесса

Журнал: Журнал «Вопросы нейрохирургии» имени Н.Н. Бурденко. 2013;77(3): 36-41

Просмотров : 22

Загрузок : 1

Как цитировать

Бывальцев В. А., Панасенков С. Ю., Цыганов П. Ю., Белых Е. Г., Сороковиков В. А. Наноструктурный анализ поясничных межпозвонковых дисков на разных стадиях дегенеративного процесса. Журнал «Вопросы нейрохирургии» имени Н.Н. Бурденко. 2013;77(3):36-41.

Авторы:

Бывальцев В.А.

отдел нейрохирургии и ортопедии Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии Сибирского отделения РАМН; НУЗ Дорожная клиническая больница ОАО "РЖД", Иркутск

Все авторы (5)

В современном мире все большее значение приобретают открытия и исследования, совершаемые на стыке наук. Одним из наиболее перспективных в этом плане видится соединение биологических исследований и последних достижений в области физики. Получаемые результаты нередко приводят к переосмысливанию ранее полученных знаний, которые могут быть использованы в практической медицине [8, 9]. Одной из целей настоящей работы стала разработка нового метода, позволяющего эффективно оценить морфологические изменения в межпозвонковом диске (МПД), происходящие на различных стадиях остеохондроза [2, 4, 5, 8]. Техника наноструктурного анализа внедряется в диагностическую базу клинической медицины. Метод сканирующей зондовой микроскопии (АСМ) позволяет получать данные о структуре поверхности и ее биомеханических характеристиках [2, 8, 9]. Недавнее исследование [8] показало перспективность изучения МПД методом атомно-силовой микроскопии — АСМ. В настоящем исследовании метод АСМ использован для оценки изменений в поясничных МПД человека, происходящих по мере развития дегенеративного процесса.

Цель исследования — изучить наноструктурные характеристики поясничного МПД при различных стадиях дегенеративного процесса.

Материал и методы

Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом НЦ РВХ СО РАМН. Забор материала проводился интраоперационно, были отобраны три группы проб для оценки изменений ткани МПД на уровне LIII—LIV, LIV—LV, LV—SI. В основу разделения на группы положена классификация остеохондроза по А.И. Осна (1971).

Группу 1 (начальные проявления дегенерации) составили 15 проб тканей (фрагменты объемом до 0,1—0,3 см3), полученных при механической перкутанной нуклеотомии и аспирации зондом Decompressor (Stryker) [1]. Возраст пациентов составлял 25—45 лет, в клинико-неврологическом статусе превалировала стойкая болевая и мышечно-тоническая симптоматика. Инструментальные методы диагностики демонстрировали начальные проявления остеохондроза [3, 4, 6]: 1-я и 2-я рентгенологическая стадия по А.И. Осна, наличие протрузий МПД от 2 до 5 мм. Таким образом, строение полученных образцов ткани считали наиболее близким к нормальному.

Группа 2, состоящая из 30 проб, представлена образцами (фрагменты 0,1—0,9 см3), полученными при традиционной микродискэктомии по Caspar. В этой группе процесс дегенерации имел наибольшую степень проявлений, что соответствовало 3-й и 4-й рентгенологической стадии остеохондроза по А.И. Осна, и проявлялся грыжами МПД подвязочной и интраканальной локализации (экструзия и секвестрация МПД) [3, 4, 6].

Фиксация тканей на стекле происходила естественным образом, после высушивания приготовленного среза с использованием стандартной гистологической техники. Размеры предметных стекол были стандартизированы, все образцы подписывались, имели краткую характеристику. Исследование микропрепаратов проводилось на участках, топологически соответствующих друг другу. Обеспечивалась гистологическая верификация области МПД для наноструктурного анализа путем цветной маркировки.

Исследования образцов тканей проводились с помощью зондовой нанолаборатории Ntegra Prima. Краткая спецификация прибора:

— максимальная область сканирования 75×90×10 мкм;

— видеомикроскоп с регулировкой увеличения и тонкой фокусировкой;

— система активной виброзащиты;

— широкий диапазон рабочих методик изучения, включая магнитные и электрические методики;

— система активных датчиков устранения артефактов, вызванных определенными особенностями пьезоэлектроники.

Все измерения проводились в лаборатории зондовой микроскопии при комнатных условиях на воздухе:

— температура окружающей среды 20±5 оС;

— дрейф температуры не превышал 1 оС/ч;

— относительная влажность не более 30%;

— атмосферное давление 760±30 мм рт.ст.;

— в отсутствие прямого света, акустических волн, с включенной активной системой подавления вибраций.

Ввиду достаточной прочности составляющих частей ткани МПД для исследования применялись методики контактной силовой микроскопии. В связи с тем, что исследование проводилось на свежих препаратах хряща, нами также использовалась техника полуконтактной микроскопии с целью максимального сохранения изначального рельефа поверхности и минимизации упругих деформаций образца жесткими режимами исследований [8].

В исследованиях использовались кантилеверы типа NSG-01, CSG-10, применялись стандартные параметры сканирования полуконтактного и контактного режимов.

При полуконтактном режиме применялся метод сканирования «Метод отображения фазы» для лучшего контраста разных по свойствам компонентов, а также актуализации мелких составляющих частей хряща. До начала сканирования проводилась амплитудная спектроскопия с целью предварительной оценки возможности сканирования данного участка, а также для предварительного исследования его жесткости и решения о правильности подобранных параметров сканирования. Частота развертки сканирования 0,98—1,03 Гц, разрешение 1024×1024 точки, ускорение и шаг сканирования устанавливались по умолчанию. Для минимизации эффектов задержки системы обратной связи устанавливали поперечное направление сканирования.

Для контактного режима сканирования применялись следующие параметры. Использовался кантилевер типа CSG-10, из-за своих специфических характеристик более подходящий для сканирования в контактном режиме. Применялся метод сканирования «Метод отображения распределения латеральных сил». При исследовании гистологических проб данная методика позволяет отображать механические характеристики разных участков поверхности. До начала сканирования проводилась силовая спектроскопия пьезоотклика с целью предварительной оценки возможности сканирования данного участка, а также для предварительного исследования его жесткости и определения правильности подобранных параметров сканирования. Частота развертки сканирования 0,80—0,98 Гц, разрешение 1024×1024 точки, ускорение и шаг сканирования устанавливались по умолчанию. Для минимизации эффектов задержки системы обратной связи также устанавливали поперечное направление сканирования.

Все исследования проходили при включенной активной системе виброизоляции и включенных емкостных датчиках, устраняющих артефакты, вызванные особенностями пьезоэлементов сканера.

Результаты

Применение метода АСМ позволило получить количественные признаки, характеризующие поверхность изученных образцов (см. таблицу)

с различной выраженностью дегенеративного процесса [3, 4, 6].

Группа 1 — начальные проявления дегенерации (рис. 1, 2).

Рисунок 1. АСМ-снимок поверхности МПД в области пульпозного ядра (группа 1), контактный режим «распределения латеральных сил», размер снимка 70×70 мкм, количество точек 512×512. а — 2D-изображение; б — 3D-изображение; в — график распределения высот. Полученные значения средней шероховатости, меры эксцесса представлены в таблице.
Рисунок 2. Оптическая картина, полученная при исследовании неокрашенного среза МПД (группа 1) на уровне LV—SI сегмента. 500х + цифровое увеличение.

Группа 2 — выраженные проявления дегенеративного процесса 3—4-й стадии остеохондроза (рис. 3, 4).

Рисунок 3. АСМ-снимок поверхности МПД на границе пульпозного ядра (группа 2, интраканальное секвестрирование фрагмента МПД), размер снимка 20×20 мкм, количество точек 512×512. а — 2D-изображение; б — 3D-изображение; в — график распределения высот. Характерны высокая средняя шероховатость и мера эксцесса.
Рисунок 4. Фрагмент секвестрированной грыжи МПД (группа 2). Окраска гематоксилином и эозином. ×200.

В результате проведенного исследования получен ряд параметров, важных для разработки математической модели развития дегенеративных процессов в МПД.

1. Параметр среднеквадратичной шероховатости — играет важную роль в характеристике оптических свойств поверхности (степень поглощения, рассеяния и отражения электромагнитного излучения).

2. Параметр асимметрии поверхности — может быть использован как одно из средств диагностики степени выраженности происходящих дегенеративных изменений. Математический смысл данного параметра заключается в том, что он является характеристикой графика гистограммы высот, построенного на основании полученных при АСМ результатов. Исходя из этого, в работе употреблен термин «асимметрия поверхности», т.е. насколько симметричным является статистическое выражение полученных данных на гистограмме распределения высот.

3. Мера эксцесса — характеризует отклонения гистограммы высот от формы кривой Гаусса, характеризует амплитуду колебания высот исследуемого образца поверхности.

На основании анализа этих параметров получены характеристики поверхности МПД при начальных и финальных проявлениях дегенеративного процесса.

При начальной степени дегенерации выявляются меньшие значения показателей шероховатости с изменением параметра от 200,032 до 400,014 нм с характерной большей однородностью поверхности. Показатели асимметрии поверхности изменяются от 0,12 до 0,22.

При значительной степени дегенерации зарегистрирована максимальная разнородность показателей асимметрии от 0,04 до 0,31. Размеры и форма распределения высот, характеризующие меру эксцесса (степень энтропии), также изменяются в сторону уменьшения упорядоченности при 3—4-й стадии остеохондроза.

При изучении меры эксцесса в группе 2 выявлено, что она демонстрирует значительные отклонения гистограммы высот при 3-й рентгенологической стадии остеохондроза, но при 4-й — отклонения гистограммы уменьшаются, а параметры шероховатости на некоторых участках близки к таковым у образцов с начальной степенью дегенерации в группе 1.

Исследование полученных образцов позволило выявить новые, наноструктурные признаки дегенерации МПД. Использование для этих целей АСМ представляется оптимальным по следующим причинам. Невысокая прочность живых тканей в состоянии in vivo обусловливает необходимость выбора методик, которые вносят наименьшее искажение в результаты за счет упругих и неупругих взаимодействий с поверхностью образца. Так, согласно закону сохранения импульса, при упругом взаимодействии происходит соударение кантилевера и поверхности с сохранением значений импульса. При неупругом взаимодействии соответственно при соударении происходит обмен энергией импульса, и его значение меняется для участвующих в процессе объектов. Характер исследуемого образца не позволяет исследовать его достаточно эффективно на приборах сканирующей туннельной микроскопии, так как биологические ткани обладают невысокой естественной проводимостью, и добиться удовлетворительных результатов исследований становится очень сложно [7—9]. В этом смысле вариативность используемых в АСМ методов исследования предоставляет выгодное преимущество. Объем получаемых методом АСМ данных позволяет проводить математическое моделирование стохастических процессов, т.е. процессов, поведение которых не является детерминированным, а последующее состояние системы, в которой они происходят, описывается величинами, которые могут быть как предсказаны, так и случайными.

Выводы

1. Методика атомно-силовой сканирующей зондовой микроскопии может быть использована в качестве средства изучения ткани МПД и оценки степени его дегенерации.

2. Характеристики изменений свойств поверхности образцов МПД: параметры шероховатости и асимметрии поверхности изменяются на разных стадиях дегенеративного процесса МПД (стадии остеохондроза).

3. Применение метода АСМ для изучения ультраструктуры МПД позволяет производить математическое моделирование стохастических процессов, с возможностью оценки объемных характеристик поверхности на основании анализа трехмерных свойств объекта.

Работа выполнена при поддержке гранта Президента Российской Федерации МД-6662.2012.7.

Комментарий

Попытки описать стадийность дегенеративного процесса в межпозвонковых дисках существуют давно (А.И. Осна, 1971). Однако до настоящего времени наиболее цитируема теория «дегенеративного каскада» (W. Kirkaldy-Willis, 1974). При этом морфологическая составляющая клинических проявлений при наличии множества вариантов физического воздействия на дегенерированный диск (лазер, плазменный генератор, механическое разрушение, гидротерапия) не имеет однозначной интерпретации.

Представленная работа содержит описание метода наноструктурного анализа межпозвонкового дегенерированного диска, проводимого с применением атомно-силовой микроскопии. Авторы оценивали структурные изменения в ткани диска, удаленного с применением механического деструктора — нуклеотома, выявляя корреляцию изменений с этапами дегенеративного процесса.

Спецификой тканевого строения межпозвонкового диска in vivo является его невысокая прочность при контактном исследовании, вызывающем искажения. Данный метод исследования позволяет выявить наноструктурные признаки дегенерации, что также важно в свете работ по изучению перспектив трансплантации ткани хондробластов при дегенерации дисков и создании искусственных гелевых композиций, протезирующих межпозвонковый диск.

В результате проведенного исследования получен ряд параметров, важных для разработки математической модели развития дегенеративных процессов в межпозвонковых дисках (шероховатость, асимметрия поверхности и др). Возможности объективного анализа и градации дегенеративных изменений в веществе межпозвонкового диска позволяют по-новому взглянуть на минимально-инвазивную хирургию позвоночника и планировать объективную интраоперационную оценку степени дегенерации с одномоментным патофизиологическим восстановлением функции диска.

А.О. Гуща (Москва)

Комментарий

Новейшие разработки в области нанотехнологий и изучения молекулярной биологии, морфологии и патогенеза дегенеративных процессов в межпозвонковых дисках представляют большой интерес, так как стандартное рутинное гистологическое исследование с описанием изменений хрящевой ткани далеко не всегда может отражать стадию процесса и обладать достаточной информативностью. Метод атомно-силовой микроскопии (ACM) находит все более широкое применение в биологии и медицине и имеет ряд преимуществ перед другими электронными сканирующими микроскопами. Этот метод позволяет не только получить истинно трехмерный рельеф исследуемой поверхности, но и анализировать механические свойства объекта исследования и более глубоко изучать мобильность поверхностных слоев, клеточные процессы, адгезию и молекулярное связывание. О применении ACM для изучения дегенеративных процессов межпозвонковых дисков в литературе имеются лишь единичные сообщения.

В представленной работе авторы с помощью метода АСМ изучают различные стадии поражения межпозвонкового диска, согласно классификаци остеохондроза А.И. Осна.

В работе детально описывается методика забора материала, фиксации, проводятся специализация прибора и режимы исследования. К сожалению, авторы не указывают полное название оборудования и фирмы производителя, что принято при описании новых не рутинных методов исследования.

В результате проведенных исследований получен ряд важных математических параметров, на основе анализа которых выявлены характеристики разных стадий дегенеративного процесса межпозвонковых дисков. Иллюстрации хорошего качества и отражают суть полученных данных, приводится также сравнение с гистологическими препаратами.

Авторы обосновывают преимущество АСМ для поставленной цели, сравнивая этот метод с другими видами сканирующей микроскопии. Именно метод ACM позволяет провести математическое моделирование процессов дегенерации с возможностью объемных характеристик поверхности на основании анализа топографических свойств пораженного хряща.

Статья, безусловно, актуальна и представляет значительный интерес для хирургов, клиницистов, морфологов, биологов, являясь первым шагом в изучении дегенеративных изменений межпозвонковых дисков с помощью метода ACM, и дает надежду, что это не просто новый метод визуализации с высоким разрешением, а перспективный путь дальнейшего изучения этой патологии на молекулярном уровне.

Л.В. Шишкина (Москва)

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail