В настоящее время в литературе существует много сообщений о повышенной провоспалительной активности (ПА) моноцитов, секретирующих провоспалительные цитокины: ИЛ-1, ИЛ-6, фактор некроза опухоли альфа (TNF-α) [1—3], хемокины [4, 5] у больных системными воспалительными заболеваниями, а также у больных с психическими расстройствами, в том числе у больных шизофренией [6—8] и депрессией [9]. Известно, что моноциты являются наиболее крупными клетками крови, их диаметр составляет 9—15 мкм [10]. Моноциты продуцируют разнообразные рецепторы и состоят как минимум из двух фенотипически различных субпопуляций, секретирующих разный уровень провоспалительных рецепторов CD16 и выполняющих в организме разные функции. Например, моноциты с фенотипом CD14⁺⁺/CD16^– обладают фагоцитарной активностью (это так называемые «классические моноциты»); моноциты с фенотипом CD14⁺/CD16⁺ выполняют антигенпредставляющую функцию и обладают провоспалительной активностью (это так называемые «неклассические моноциты»). При этом у здоровых людей CD14⁺⁺/CD16^- моноциты составляют более 95% от общего количества моноцитов периферической крови; соответственно, субпопуляция моноцитов с фенотипом CD14⁺/CD16⁺ составляет 5% [1].

В настоящее время общепринятым способом определения ПА моноцитов является метод проточной цитометрии, направленный на оценку уровня экспрессируемых на поверхности моноцитов провоспалительных рецепторов CD16 с помощью моноклональных антител, специфических к этим рецепторам. Суть метода заключается в том, что к моноцитам, выделенным из периферической венозной крови, добавляют моноклональные антитела, специфичные к моноцитарным рецепторам CD14 и CD16 и оценивают относительное количество провоспалительных моноцитов с фенотипом CD14⁺/CD16⁺ на проточном цитофлуориметре [11]. Результаты многочисленных исследований ПА моноцитов с помощью этого способа оценки выявили значительное повышение количества моноцитов с провоспалительным фенотипом CD14⁺/CD16⁺ у больных с системными воспалительными заболеваниями [11—13]. Результаты недавних исследований с использованием общепринятого способа оценки ПА моноцитов по уровню секреции ими провоспалительных рецепторов CD16⁺ у больных с психическими и нейродегенеративными заболеваниями выявили также повышенный уровень провоспалительных моноцитов с фенотипом CD14⁺/CD16⁺ у больных с юношеской депрессией [14] и с болезнью Альцгеймера [15]. Несмотря на то что способ оценки ПА моноцитов с помощью проточного цитофлуориметра представляется достаточно точным, недостатком его является высокая стоимость проведения исследования, связанная с необходимостью использования дорогостоящих оборудования и моноклональных антител, а также высокая сложность и трудоемкость выполнения анализа, так как для предварительной настройки прибора и работы на нем требуется высокая квалификация оператора.

Существует другой, более простой и дешевый способ оценки ПА моноцитов, основанный на подсчете общего количества выделенных моноцитов с диаметром от 9 до 15 мкм и количества больших моноцитов с диаметром от 12,5 до 15 мкм на многофункциональном счетчике и анализаторе клеток Multisizer типа MS-4 (Beckman Coulter, США), работающем по принципу Культера, и расчете в процентах индекса провоспалительной активности (ИПА) моноцитов, равного отношению количества больших моноцитов с диаметром от 12,5 до 15 мкм к общему количеству моноцитов с диаметром от 9 до 15 мкм. Преимущество предложенного способа оценки выражается в снижении трудоемкости, а также стоимости его исполнения и упрощении оценки ПА моноцитов при сохранении высокой достоверности полученных результатов (на уровне существующего способа).

Следует отметить, что предложенный способ оценки ПА моноцитов основан на данных, полученных в конце прошлого века рядом авторов, которые показали, что моноциты периферической крови распределяются по объему на три субпопуляции — малые (М1), средние (М2) и большие (М3) и что эти субпопуляции обладают разными функциональными характеристиками [16]. Авторы показали, что М3-моноциты (объемом около 480 мкм³) в значительно большей степени, чем две другие субпопуляции вместе взятые (М1 и М2), были способны к направленной миграции в очаг воспаления (к хемотаксису). При этом результаты многочисленных современных исследований свидетельствуют, что моноциты, обладающие способностью к хемотаксису, осуществляют воспалительные реакции и участвуют в механизмах развития хронического иммунного воспаления при различных системных заболеваниях [4, 5] и нейроиммунного воспаления у больных психическими расстройствами [17], то есть, по сути, являются провоспалительными моноцитами с фенотипом CD14⁺/CD16⁺ [4, 14, 15].

Таким образом, основываясь на этих данных, можно предположить, что моноциты большого объема, проанализированные и описанные в статье E.B. Arenson Jr и соавт. [16], осуществляют провоспалительную функцию и их можно отнести к провоспалительным моноцитам с фенотипом CD14⁺/CD16⁺. Исходя из этого, мы предположили, что результаты, полученные с помощью предложенного нами способа подсчета относительного количества больших моноцитов на автоматическом счетчике и анализаторе клеток, будут аналогичны результатам, полученным путем измерения относительного количества моноцитов с провоспалительным фенотипом CD14⁺/CD16⁺ на проточном цитофлуориметре с использованием специфических моноклональных антител.

Для подтверждения выдвинутого предположения оценку ПА моноцитов проводили одновременно обоими способами.

Материал и методы

В исследование были включены 18 больных юношеской депрессией мужского пола в возрасте от 17 до 23 лет (средний возраст 19,8±0,4 года), а также в качестве контрольной группы — 12 психически и соматически здоровых мужчин соответствующего возраста. Все пациенты были впервые госпитализированы в клиническое отделение ФГБНУ «Научный центр психического здоровья» и обследованы один раз до назначения им психотропной терапии.

Условия проведения настоящей работы соответствовали Хельсинкской декларации 1964 г., принятой на 18-й ассамблее Всемирной ассоциации врачей, (Хельсинки, Финляндия, июнь) с поправками, принятыми в 1975 г. на 29-й ассамблее Всемирной ассоциации врачей (Токио, Япония, октябрь) и этическим стандартам Локального Этического комитета ФГБНУ «Научный центр психического здоровья». Все обследованные дали письменное информированное согласие на взятие крови и участие в исследовании.

Моноциты выделяли у больных и здоровых общепринятым способом в два этапа: на первом этапе моноциты выделяли в составе мононуклеарных клеток (лимфоциты + моноциты, МНК) из периферической венозной крови больных и здоровых центрифугированием в градиенте плотности фиколл-урографина (ρ=1,077; «ПанЭко», РФ) по стандартной методике [18]. На втором этапе получали чистую взвесь моноцитов методом фракционирования, основанным на способности моноцитов прилипать к стеклу или пластиковой поверхности [19]. Для этого полученную взвесь МНК разводили в среде RPMI 1640 с глутамином до концентрации 5х10⁶/мл, наслаивали в чашки Петри диаметром 60 мкм (Nunclon, Delta, Denmark) и инкубировали в CO₂-инкубаторе при 37 °C 1 час, в течение которого моноциты, вследствие своих адгезивных свойств, прилипали ко дну чашки Петри. По истечении этого времени удаляли надосадочную жидкость и отделяли прикрепившиеся ко дну чашки клетки (моноциты) путем добавления к ним охлажденного раствора Версена на 20 мин с последующим двойным отмыванием в центрифужных пробирках питательной средой 199 с добавлением 10% фетальной сыворотки (fetal calf serum — FCS, Serva, USA). Полученные моноциты разводили до концентрации 1·10⁶/мл в среде RPMI 1640 и использовали для проведения сравнительного анализа провоспалительной активности моноцитов у больных и здоровых двумя способами.

Первый способ включал определение с помощью фенотипирования относительного количества моноцитов с провоспалительным фенотипом CD14⁺/CD16⁺. Для этого к выделенным моноцитам добавляли специфические моноклональные антитела (Beckman Coulter, США), а именно: антитела к антигену дифференцировки 16, меченые fluorescein isothiocyanate (CD16-FITC), и антитела к антигену дифференцировки 14, меченые phycoerythrin (CD14-PE). Цитофлуориметрический анализ выполняли на проточном цитофлуориметре FC-500 (Beckman Coulter, USA) с использованием единых настроек прибора для всех проб. Для исключения дебриса порог устанавливали по FS и CD45PC5; популяцию моноцитов выделяли по CD14 в комбинации с боковым светорассеянием (SSC) [20]. В каждом из образцов анализировали не менее 3000 моноцитов. По уровню экспрессии рецепторов CD14 и CD16 моноциты были распределены на две субпопуляции CD14⁺⁺/CD16^– («классические» моноциты) и CD14⁺/CD16⁺ («неклассические» провоспалительные моноциты). Количество моноцитов в каждой из субпопуляций выражали в процентах по отношению к общему количеству моноцитов, которое принимали за 100%.

Предлагаемый нами способ основан на подсчете относительного количества больших моноцитов на многофункциональном счетчике и анализаторе клеток Multisizer MS-4 (Beckman Coulter, США). Для этого из подготовленной взвеси моноцитов отбирали 100 мкл и добавляли к 10 мл изотонического раствора для разведения проб Isoton II (Beckman Coulter, USA) в кюветах (accuvettes ST) объемом 20 мл (поставляются в комплекте с прибором). Взвесь моноцитов в растворе тщательно перемешивали. Для подсчета количества моноцитов кюветы помещали в автоматический счетчик Multisizer MS-4, работающий по принципу Культера и позволяющий подсчитывать количество и объем частиц и проводить анализ их распределения. Подсчитывали общее количество моноцитов с диаметром от 9 до 15 мкм и количество больших моноцитов с диаметром от 12,5 до 15 мкм. Рассчитывали индекс ПА (ИПА) моноцитов как отношение количества больших моноцитов с диаметром от 12,5 до 15 мкм к общему количеству моноцитов с диаметром от 9 до 15 мкм и выражали его в процентах. Подсчет ИПА моноцитов в каждой пробе проводили два-три раза и в качестве его окончательного значения рассчитывали среднее значение ИПА.

Для подтверждения идентичности результатов, полученных разными способами оценки ПА моноцитов, исследования проводили в разных вариантах: у больных в общей группе и в подгруппах больных с низким и высоким уровнем активных моноцитов, а также в группе здоровых лиц.

Для уточнения правильности представленных рассуждений нами приведены результаты дополнительных исследований по подсчету на счетчике и анализаторе клеток количества моноцитов с фенотипом CD14⁺, выделенных из периферической крови с помощью специфических к ним моноклональных антител CD14, меченных магнитными частицами (метод магнитной сепарации).

Все статистические исследования проводили, используя пакет программ Statistica (StatSoft Inc, США, версия 10). Достоверность различий между показателями независимых выборок проводили с помощью t-критерия Стьюдента. В связи с малым числом пациентов в выборках (n≤15) использовали t-критерий Стьюдента для зависимых и независимых переменных. Корреляционный анализ проводили с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена (Spearman r). Оценку статистической значимости связи между изучаемыми показателями определяли по тесту χ² и по двухстороннему точному критерию Фишера (Fisher Exact Test 2-tailed).

Результаты и обсуждение

Результаты сравнения двух способов оценки ПА моноцитов в группах больных и здоровых, представлены в табл. 1.

Таблица 1. Сравнение двух способов оценки ПА моноцитов в общих группах больных и здоровых

Примечание. Достоверные различия между больными и здоровыми: * — p<0,05.

Как видно из табл. 1, относительное количество провоспалительных моноцитов CD14⁺/CD16⁺, определяемое на проточном цитофлуориметре и процент больших моноцитов (ИПА моноцитов), подсчитанный на анализаторе, представляют собой практически идентичные величины как в группе больных, так и в группе здоровых. При статистической обработке результатов эти данные были полностью подтверждены, то есть значимые различия между средними значениями определяемых показателей не выявлялись (p–0,6) ни у больных, ни у здоровых. Следует отметить также, что между больными и здоровыми при обоих способах оценки ПА моноцитов выявлялись статистически выраженные различия (p<0,05). Подтверждением идентичности полученных результатов служило также выявление статистически значимой позитивной корреляции между числом провоспалительных моноцитов CD14⁺/CD16⁺, определяемым с помощью моноклональных антител на проточном цитофлуориметре, с одной стороны, и их числом, подсчитанном на анализаторе, с другой стороны (Spearman r=0,75; p<0,05).

Индивидуальный анализ, проведенный у больных, показал, что уровень ПА моноцитов у больных существенно варьировал при определении обоими способами. В связи с этим, для получения выборок больных с более равномерным распределением значений показателей был предпринят способ дихотомического разделения больных в общей группе по двум подгруппам с низкими и высокими уровнями ПА моноцитов, относительно близкими к их медианным значениям, оцененным двумя способами. В результате такого подхода больные распределились приблизительно поровну в обозначенные подгруппы с нормальным распределением значений каждого из показателей и со статистически выраженными различиями между ними (p<0,001). В табл. 2 представлены результаты сравнительного анализа двух способов оценки ПА моноцитов в подгруппах больных с высоким (подгруппа 1) и низким (подгруппа 2) уровнем значений.

Таблица 2. Сравнение двух способов оценки ПА моноцитов в подгруппах больных

Примечание. Достоверные различия между 1 и 2 подгруппами больных: * — p<0,05.

Из табл. 2 видно, что количество провоспалительных моноцитов CD14⁺/CD16⁺, определяемое стандартным способом с помощью моноклональных антител на проточном цитофлуориметре и относительное количество больших моноцитов, подсчитываемое с помощью предлагаемого способа на анализаторе и счетчике клеток, практически одинаково во всех вариантах оценки. Статистическая обработка результатов также подтвердила, что значимые различия между средними значениями показателей ПА моноцитов, определяемых двумя способами в каждой из подгрупп больных, выявлены не были (p=0,6). Соотношения между значениями показателей были подтверждены по χ² тесту, с определением достоверности по двухстороннему точному критерию Фишера (Fisher Exact Test 2-tailed): (r=0,77, p=0,05). Из табл. 1 и 2 также видно, что уровень ПА моноцитов, определяемый обоими способами, у больных в подгруппе 2 с низким уровнем показателя существенно не отличается от его значений в контрольной группе здоровых (p=0,6).

При подсчете клеток на автоматическом счетчике и анализаторе моноциты с фенотипом CD14⁺ распределяются по диаметру от 9 до 15 мкм, а в диапазоне от 12,5 до 15 мкм существует заметный пик больших моноцитов. Например, для больного N количество всех моноцитов с диаметром 9—15 мкм составило 441, количество М3-моноцитов с диаметром 12,5—15 мкм составило 40. Поэтому ИПА оценен как (40/441)·100%=9,1%.

Таким образом, выбор указанных значений диаметра моноцитов обусловлен объективными и подтвержденными экспериментальным путем данными.

В результате проведенного сравнительного анализа определения ПА моноцитов у больных и здоровых двумя способами оценки было показано, что: два анализируемых способа оценки ПА моноцитов дают статистически незначимую разницу между результатами во всех вариантах оценки; способ оценки ПА моноцитов на автоматическом счетчике и анализаторе клеток Multisizer является более экономичным, более простым в исполнении, так как не требует применения дорогостоящих приборов и реагентов, не требует сложных настроек прибора и высокого уровня квалификации оператора, как в общепринятом способе; выполнение исследований с помощью разработанного способа осуществляется всего лишь по двум параметрам: по подсчету числа больших моноцитов с диаметром от 12,5 до 15 мкм и общего числа моноцитов с диаметром от 9 до 15 мкм.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что разработанный новый способ оценки ПА моноцитов с помощью подсчета относительного количества больших моноцитов на счетчике и анализаторе клеток Multisizer MS-4 может быть использован для применения в исследовательских целях.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.