Белок альфа-синуклеин (αS) является основным компонентом амилоидных агрегатов, обнаруживаемых в тельцах Леви, которые служат маркером патологии болезни Паркинсона (БП). БП — наиболее часто встречающееся двигательное расстройство [1]. Молекулярную основу патогенеза БП представляет процесс сборки белка αS, состоящего из 140 аминокислотных остатков, в амилоидные фибриллы с образованием олигомерных интермедиатов [2]. Дупликации, тройные повторы и точечные мутации в гене αS служат основой семейных форм БП [3, 4].

Биологическая функция αS точно не известна, но предполагается, что белок участвует в высвобождении и транспорте синаптических везикул, регуляции работы ферментов и переносчиков, контроле апоптотической реакции нейронов [5, 6]. αS присутствует в пресинаптических терминалях [7—9]; сообщается о том, что белок существует in vivo как в свободном состоянии в цитоплазме, так и ассоциации с мембранами [10].

Ассоциированные с мембранами молекулы αS могут образовывать ядра олигомеризации и олигомеризоваться, и это может запускать агрегацию цитоплазматического αS [10]. Мономерная форма αS в растворе имеет слабо упорядоченную структуру, тогда как в состоянии, ассоциированном с мембранами, она обогащена α-спиральными структурами [7, 11—13]. Патогенез Б.П. может быть связан с изменениями или нарушением взаимодействий αS с липидами. Исследования in vitro показали, что мутации при БП с ранним началом могут влиять на связывание αS с фосфолипидами [14—16]. Выдвинуто предположение, что механизм токсичности при БП вовлекает механизмы непосредственного нарушения взаимодействий между αS и липидными бислоями, в которых происходит взаимное влияние процессов роста агрегатов αS и удаления липидов из бислоя [17]. Показано, что αS специфически связывается с митохондриями, приводя к нарушению их функции [18].

Учитывая функциональную роль и отношение αS к патогенезу, следует отметить важность исследований взаимодействий αS с липидными мембранами.

Известно много работ, авторы которых стремились понять природу взаимодействий между αS и липидными бислоями, но проблема характеристики мембрано-ассоциированного состояния белка и роли мембран в его агрегации не была решена. Проблема имеет прямое отношение к трудности выделения мембрано-связанного белка из образцов мозга. Исследования in vitro также не позволили выяснить механизм агрегации αS в присутствии липидов, что объясняется отчасти вариабельностью исходных образцов белка и разнообразием условий кинетических исследований перехода мономеров αS в амилоидные фибриллы [10, 19—27].

Цель исследования биофизический анализ взаимодействий αS с липидами, который раскрывает роль химической природы липидных головок как в связывании αS, так и формировании амилоида. Эксперименты привели к открытию скрытого процесса с участием олигомерных форм αS, который при связывании с мембранами служит матрицей для линейного роста тонких амилоидных фибрилл αS.

В работе использовали рекомбинантный синтезированный в прокариотических клетках белок αS человека. Белок αS получали так, как описано ранее [28]. Свойства рекомбинантного белка идентичны свойствам природного белка αS в отношении мисфолдинга, олигомеризации и агрегации. Белок хранили в лиофилизированном виде при температуре −80 °C. Мономерный αS очищали из лиофилизированного порошка белка после его растворения в 8 M мочевине и 20 мM этилендиаминтетрауксусной кислоте гель-фильтрационной хроматографией (разделение по размерам молекул, SEC) на колонке Superdex 75 («GE Healthcare», Швеция) в 20 мM фосфатном буфере, pH 6,5. Кинетические исследования агрегации также выполняли с образцами лиофилизированного белка, непосредственно растворенного в 20 мM фосфатном буфере, pH 6,5 и фильтрованного сквозь фильтры — шприцевые насадки с порами размером 0,2 мкм. По данным электрофореза в полиакриламидном геле, эти образцы (содержащие как мономеры, так и олигомеры) состояли исключительно из полноразмерного αS (не содержали его фрагментов). Концентрацию белка определяли спектрофотометрически с использованием молярного коэффициента экстинкции 5960 M^–1 см^–1 при 280 нм. Липидные везикулы готовили методом гидратирования липидных пленок. Соответствующий объем хлороформного раствора липидов (DOPS или DOPG) переносили в круглодонную колбу и удаляли органический растворитель на роторном испарителе. Полученную пленку затем высушивали под вакуумом в течение минимум 3 ч и затем гидратировали 20 мM фосфатным буфером, pH 6,5. Суспензии липосом подвергали экструзии через поликарбонатные фильтры с порами диаметром 100 нм с применением экструдера Avestin LiposoFast-Basic extruder. Размер липосом определяли методом динамического светорассеяния с применением прибора Zetasizer Nano ZS («Malvern Instruments Ltd.», Великобритания).

Применялись хлороформные растворы DOPS (натриевой соли 1, 2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидил-L-серина) и DOPG (натриевой соли 1, 2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидил-(1′-rac-глицерина) от Avanti Polar Lipids («Alabaster», США); однозамещенный фосфат натрия (NaH₂PO₄; >99%), двузамещенный фосфат натрия (Na₂HPO₄; >99%) и тиофлавин T особой степени чистоты (ThT) (>95%) «Sigma-Aldrich» (Швеция).

Спектроскопия кругового дихроизма (КД) в дальнем УФ. КД-спектры в дальнем УФ 5 мкМ раствора αS в присутствии возрастающих концентраций липосом в 20 мМ фосфатном буфере, pH 6,5, записывались при температуре 37 °C на оборудовании Chirascan («Applied Photophysics», Великобритания), оснащенном ячейкой с элементом Пельтье для контроля температуры. КД-спектры в диапазоне между 250 и 200 нм регистрировали с использованием кварцевых кювет с длиной хода луча 1 мм при следующих параметрах: ширина щели 1 нм, шаг 1 нм, длительность регистрации точки 1 с, усредняли данные трех спектров. Регистрировали КД-сигналы буфера и липосом и вычитали из КД-сигнала образцов с белком.

Анализ данных КД. Фиттинг кривых титрования КД осуществляли с использованием модели одностадийного связывания [22]:

где F и B — свободная форма αS в растворе и связанная с везикулами форма αS соответственно, а L — количество молекул липида, взаимодействующих с одной молекулой αS.

Таким образом:

Регистрируемый сигнал КД можно выразить как сумму вкладов от αS, связанного с везикулами (x_B=[B]/[αS]), и свободного αS в растворе (xF=[F]/[αS]):

где CD — КД, а СD_B и СD_F — КД-сигналы от αS в связанном и свободном состоянии соответственно.

и из уравнений (1)—(4) следует:

Для фиттинга кривых титрования КД с использованием уравнений (6) и (7) применяли программу Matlab (разработчик «MathWorks»).

Кинетика агрегации. αS, очищенный гель-фильтрацией (SEC) непосредственно перед инкубацией, или αS, растворенный непосредственно в буфере, инкубировали при температуре 37 °C в 20 мМ фосфатном буфере, pH 6,5 в присутствии 20 мкМ ThT и различных концентраций липосом DOPG и DOPS. Образцы (60 мкл на лунку) инкубировали в несвязывающих полистироловых 96-луночных микропланшетах с половинным объемом с прозрачным дном («Corning Life Sciences», США); флюоресцентный сигнал ThT регистрировали (в режиме мониторинга) с использованием микропланшетного ридера («FLUOstar Optima», «BMG Labtech», Германия). Флюоресценцию (длина волны возбуждения 440 нм, длина волны эмиссии 480 нм) измеряли каждые 20 мин в ходе инкубации, а планшеты встряхивали в течение 5 мин перед каждым измерением для надлежащего перемешивания образцов. В отсутствие липосом агрегации αS не происходит за все время эксперимента (100 ч).

Атомно-силовая микроскопия (АСМ). Для получения изображения АСМ образцы разбавляли водой, фильтрованной сквозь систему Milli-Q (в 10—20 раз), и наносили на свежерасщепленную слюду. Спустя 10 мин слюду ополаскивали водой, фильтрованной сквозь систему Milli-Q, и высушивали в слабом токе азота. Изображения записывали в режиме прерывистого контакта на воздухе с применением зондовой нанолаборатории NTEGRA Prima («NT-MDT Spectrum Instruments», Россия), кантилевера из монокристаллического кремния с золотым напылением (NT-MDT, NSG01, упругая постоянная (постоянная пружины) составляла ~5,1 Н/м^–1), резонансная частота ~180 кГц. Получали изображения размером 512 пикселей при сканировании с частотой 0,5 Гц. Изображения анализировали с применением программы WS×M 5,0, разработанной I. Horcas и соавт. [29].

Методом КД-спектроскопии в дальнем УФ-диапазоне было исследовано связывание мономерных αS с липидными везикулами, состоящими из липидов DOPS или DOPG. Титрование крупных однослойных липосом (LUV) белком αS вызывало переход от неупорядоченной к α-спиральной структуре белка, что прослеживалось по характерным негативным полосам при 208 и 222 нм в КД-спектре (рис. 1, а,).

Формирование амилоида αS запускается по-разному анионными липидными везикулами двух видов. Результаты по исследованию КД показали различную стехиометрию L к αS для липосом из DOPG и DOPS. Для того чтобы оценить важность этого явления для формирования амилоида αS в присутствии отрицательно заряженных везикул, был применен типичный анализ ThT, в котором используется усиление квантового выхода флюоресценции ThT при связывании с амилоидными фибриллами [30, 31]. Чтобы создать условия, при которых αS существует как в свободном состоянии в растворе, так и связанном с везикулами состоянии, выбраны фиксированная концентрация αS (70 мкМ) и различные концентрации липидов, определенные в соответствии с кривыми титрования КД. В эффективных условиях это означает, что в опытах были сходное содержание α-спиралей αS, но различные концентрации липидов DOPG и DOPS. Кроме того, были протестированы условия насыщения, при которых практически все молекулы αS были связаны с везикулами.

αS (70 мкМ), инкубированный при температуре 37 °C в течение 100 ч, не обнаруживал усиления флюоресценции ThT, что указывает на отсутствие амилоидных фибрилл, выявляемых ThT (рис. 2,).

Везикулы DOPS также усиливали агрегацию αS, но с различными особенностями. При отношении DOPS/αS, равном 10,5 (13% αS связано), наблюдалась агрегация белка, но, хотя при более высоких отношениях DOPS/αS (т.е. 21 и 56) флюоресценции ThT не наблюдалось в соответствии с титрованием КД, αS присутствовал и в свободном, и связанном состоянии (см. рис. 2, б и г).

Изображения АСМ образцов из конечной точки (после 100 ч инкубации) показали, что в области плато флюоресценции ThT фибриллы, сформировавшиеся в присутствии отрицательно заряженных везикул обоих типов, были гетерогенными, некоторые из волокон достигали 7—9 нм, а некоторые были высотой <5 нм (см. рис. 2, д и е). Для сравнения, свойства этих амилоидных фибрилл соответствуют тем, которые наблюдаются у фибрилл амилоидов αS, сформированных в отсутствие везикул, но в присутствии небольших стеклянных шариков при взбалтывании для ускорения реакции.

«Загрязнение» олигомерами αS резко изменяет агрегацию αS в присутствии негативно заряженных везикул. Для того чтобы быть уверенными в том, что исходный материал αS содержит только мономеры αS, в экспериментах, описанных выше, лиофилизированный αS растворяли и всегда очищали SEC, перед тем как использовать. Действительно, анализ SEC лиофилизованных образцов αS показал наличие белковых агрегатов, размеры которых, судя по их подвижности, превышали размер мономеров, что указывает на формирование олигомерной фракции. Более того, анализ АСМ показал наличие в лиофилизиорованном образце αS сферических структур размером 1—3 нм. На основании анализа SEC, фракция олигомеров соответствует приблизительно 5% общего белка и молекулярная масса олигомера составляет около 80 кДа. Олигомеры довольно стабильны, во всяком случае они не диссоциировали в присутствии 8 М мочевины. Как предполагалось, для образца, содержавшего, главным образом, мономеры и небольшую примесь олигомеров, кривые титрования в экспериментах по КД с отрицательно заряженными везикулами с использованием его в качестве источника αS соответствовали данным, полученным для образца, содержавшего только мономерную форму αS. Имеются сообщения о том, что лиофилизация индуцирует формирование олигомеров αS, и предполагалось, что эти формы могут влиять на агрегацию αS [32—34]. Следовательно, в настоящем исследовании изучалась кинетика агрегации гетерогенных препаратов αS (т.е. лиофилизированных αS, растворенных без последующей очистки) в присутствии отрицательно заряженных везикул.

Сигнал ThT от лиофилизированного растворенного в буфере αS без везикул не изменялся в пределах 100 ч эксперимента в условиях агрегации, что указывает на отсутствие формирования амилоида и, что важно, абсолютно тот же результат получали с применением образца, содержавшего только мономер αS в отсутствие везикул (рис. 3, a

Напротив, для того же образца αS сигнал ThT возрастал почти линейно во времени без лаг-фазы в присутствии больших однослойных липосом (LUV) из DOPG при соотношении липид/белок 2,1, 4,2, 11,2 и из DOPS при соотношении липид/белок 10,5 (см. рис. 3, a и б). Но амплитуды этих изменений ThT были очень низкими, хотя явно отличались от плоских кривых ThT, полученных для αS без везикул. Анализ АСМ после реакции показал наличие тонких амилоидных фибрилл размером 3—4 нм (см. рис. 3, в и г). Таким образом, если наряду с мономерами αS присутствует небольшая фракция олигомеров, при наличии отрицательно заряженных везикул имеется элонгация небольшого количество фибрилл, наиболее вероятно, из «загрязняющих» олигомеров в качестве затравки (ядер образования). В то же время, что наиболее интересно, отсутствует типичная кооперативная агрегация, которая наблюдается при использовании образцов αS, содержащих только мономеры αS в присутствии везикул (см. рис. 2).

Как описано в литературе, связывание αS с липидными мембранами зависит от многочисленных факторов, таких как условия растворения, химические свойства липидов, фазовое состояние липидного бислоя и кривизна изгиба мембраны [23, 35—38]. В экспериментальных условиях настоящего исследования индукция одного и того же количества α-спиралей в αS требовала присутствия в 4 раза большей концентрации везикул DOPS, чем везикул DOPG. Площадь на молекулу липида DOPS (65,3 Å2 [39]) почти на 10% меньше, чем площадь на молекулу DOPG (70,8 Å2), и это указывает на то, что взаимодействие притяжения между липидными головками фосфатидил-L-серина сильнее, чем между головками фосфатидилглицерина. Более сильное притяжение приводит к большей молекулярной упорядоченности области полярных головок в липидных слоях, образованных DOPS, по сравнению с липидными слоями, образованными DOPG [40], и усиливает степень экспозиции гидрофобных частей DOPG по сравнению с липидными бислоями DOPS. Ранее описан феномен связывания αS с высоким сродством с модельными мембранами с дефектами, и это свидетельствует о том, что упаковка липидов сильно влияет на взаимодействия αS [36, 37, 41]. Таким образом, DOPG может экспонировать гидрофобные области в большей степени, и αS может проникать глубже в мембраны DOPG, чем в мембраны, образованные DOPS. Это увеличивает эффективную площадь связывания, поскольку, когда бислой растягивается, эффективная поверхностная площадь на липид увеличивается. Это рассуждение может объяснить, почему на одну молекулу αS приходится меньшее количество липидных молекул DOPG по сравнению с DOPS. Сообщения о различном сродстве αS к отрицательно заряженным головкам, выходящим за рамки общего заряда, также подчеркивают специфику αS по отношению к разным фосфолипидам [18, 42].

КД-спектры связывания αS с анионными липидными везикулами показывают наличие перехода от в основном неупорядоченной к большей части упорядоченной α-спиральной конформации αS. В условиях избытка липидов большинство мономеров αS связано с везикулами. В настоящем исследовании наблюдались такие максимальные значения средней молярной эллиптичности на остаток (СМЭ, или MRE) при 222 нм, как –25·10³ и –27·10³ градус·м⁻¹·M⁻¹ для αS, связанного с DOPG и DOPS везикулами, соответственно. С использованием значений СМЭ и полагая, что все молекулы αS связаны с везикулами, авторы работы [43] рассчитали, что 68—74% молекул белка имеют α-спиральную структуру, что соответствует ~100 из 140 остатков αS. Этот результат соответствует структурным исследованиям, которые показали, что с липидными везикулами взаимодействуют первые 100 N-концевых остатков αS [11, 44]. Количество остатков αS, связанных с везикулами, может быть оценено исходя из предположения, что размеры α-спирали составляют ~0,13 нм на один остаток в длину [45] и 1 нм в ширину в сочетании с отношением липид/белок в насыщении, определенном в настоящем исследовании как 21 (площадь липида 7,5 нм²) для везикул DOPG и 83 (площадь липида 27 нм²) для DOPS. Мы пришли к выводу, что на везикулах DOPG можно разместить только около 58 остатков каждого αS, тогда как на поверхности везикул DOPS доступная площадь на мономер αS соответствует 200 остаткам αS в α-спиральной конформации.

Этот простой анализ может свидетельствовать о том, что αS индуцирует перестройку бислоя DOPG, приводящую к латеральной экспансии, такой, что становится возможным разместить 100 остатков αS в расчете на одну молекулу. Наконец, было предположено, что связывание αS с липидными бислоями может вовлекать инсерцию (вставку) спиральных сегментов в район головок, приводя к латеральной экспансии; важно, что этот эффект сильно зависит от степени упорядоченности мембраны [36]. Другая возможность состоит в том, что часть спирали αS выступает с поверхности мембраны везикул DOPG. Ранее сообщалось, что для связывания αS с везикулами, содержащими фосфатидил-L-серин, требуются все остатки (1—102), тогда как связывание с везикулами, содержащими фосфатидную кислоту, может быть опосредовано только одним из сегментов последовательности (1—42, 43—56 или 56—102) [16].

В настоящем исследовании наблюдалась различная модуляция формирования амилоида мономерным αS везикулами DOPG и DOPS. При отношении липид/белок, достаточно высоком для того, чтобы все молекулы αS связались с везикулами, белок не агрегировал за временные рамки экспериментов (100 ч). Однако для везикул обоих типов в случае, если в растворе присутствуют свободные мономеры, имеется образование фибрилл, а в процессе наблюдается начальная лаг-фаза, которая объясняется механизмом, зависимым от нуклеации [21, 46]. Поскольку нуклеация αS в присутствии везикул DOPG происходит быстрее, чем в их отсутствие, можно предположить, что именно фракция αS, связанная с липидом, формирует начальные центры амилоидообразования. Возможно, липидное окружение увеличивает локальные концентрации αS, усиливая самосборку ассоциированных с мембранами молекул αS и впоследствии приводя к образованию ядер на поверхности бислоя. Если предположить, что содержание α-спиралей соответствует связанному αS, то везикулы DOPG индуцируют формирование амилоида мономерным αS до тех пор, пока белок присутствует как в свободном, так и связанном состоянии. Напротив, в случае DOPS происходит агрегация всего 13% αS, связанного с липидами, и лаг-фаза в случае DOPS длиннее, чем в случае αS с DOPG при той же доле (в %) белка, связанного с везикулами. Если фракция αS, связанного с DOPS, была больше, чем 13%, это приводило к отсутствию образования амилоида. Кроме того, при сравнении результатов в случае DOPS и DOPG при сходных абсолютных концентрациях липидов, соответствующих отношению липид/белок 10,5 и 11,2 соответственно, лаг-фазы образования αS амилоида были все еще значительно дольше в случае DOPS, чем в случае DOPG. Эти данные свидетельствуют, что эффективность нуклеации αS на везикулах зависит от химии поверхности везикул, динамики и структуры, которые все вместе определяют режим связывания αS. Ранее предполагалось, что агрегация αS вызывается только липидами с короткими насыщенными углеводородными цепями (цепи из 12 или 14 углеродных остатков) [23]. Результаты настоящего исследования показывают, что в некоторых условиях агрегация αS может также вызываться и усиливаться длинными ненасыщенными углеводородными цепями (т.е. DOPS, DOPG; цепь из 18 углеродных атомов с одной двойной связью). Основываясь на результатах предшествующих исследований, можно предположить, что при агрегации αS на везикулах происходят как экстракция липидов из бислоя, так и частичная коагрегация белка и липида [17, 47].

Неожиданно авторы настоящего исследования обнаружили, что формирование амилоида αS в присутствии везикул критически изменяется, если присутствует небольшая доля олигомеров. Данные АСМ показали формирование небольшой фракции тонких амилоидных фибрилл [21, 48]. Такие амилоидные фибриллы росли без лаг-фазы, и это подразумевает то, что предварительно сформированные «загрязняющие» олигомеры были источником центров нуклеации. Отметим, что этот процесс блокировал агрегацию оставшихся мономеров, что отличается от результатов, полученных с образцами αS, содержащими исключительно мономеры αS, в присутствии отрицательно заряженных везикул. Поскольку амилоидные фибриллы отсутствовали в реакциях агрегации этого образца αS без везикул, «загрязняющие» олигомеры должны были зависеть от наличия везикул, чтобы служить центрами нуклеации амилоидообразования. Описано, что олигомеры αS взаимодействуют с отрицательно заряженными бислоями и могут вызывать разрушение мембран [32, 49]. Остаются неизвестными молекулярные детали взаимодействий олигомеров с мембранами и эффект, оказываемый такими взаимодействиями на окружающие мономерные формы αS. Если взаимодействия αS с липидными везикулами являются кооперативными, то даже несколько (или один) олигомеров могут изменять способ расположения многих мономеров на поверхности липосомы. Отметим, что изучение агрегации αS на поддерживающих липидных бислоях показало, что мономерный αS имеет большее сродство к белковым агрегатам на поверхности, чем самому липидному бислою [17]. Более того, подобно результатам настоящего исследования цитированное исследование показало, что после начального образования первых агрегатов они растут во времени, но формирование новых семян (центров нуклеации) αS происходит со значительно меньшей частотой.

Результаты настоящего исследования указывают на важность тщательной оценки свойств мембраны, синергических эффектов, обусловленных белково-липидными взаимодействиями, а также как липидными везикулами, так и динамикой структуры белка. Настоящее исследование также показывает важность процедуры приготовления препаратов белка. Литература, освещающая агрегацию αS, включает широкий ряд разнообразных результатов, по меньшей мере некоторые из которых можно объяснить различиями исходного материала белка.

На основании настоящей работы можно предположить, что последствия взаимодействий αS с синаптическими везикулами и мембранами in vivo будут зависеть от одновременных взаимодействий с другими белками, которые могут модулировать поверхность везикул. Вероятно, связывание предварительно сформированных олигомеров с везикулами изменяет поверхностные свойства так, что мономеры не могут независимо образовывать центры нуклеации (ядра конденсации) амилоидов. Результаты настоящей работы также освещают вопрос о том, какие условия in vitro имеют наибольшее отношение к сценарию in vivo, который неизбежно приводит к Б.П. Наконец, следует отметить, что для того чтобы понять настоящее биологическое значение этих находок in vitro, нужно изучить везикулы, состоящие из смешанных липидов, имитирующих мембраны нервных клеток.

Исследование поддержано фондом Knut and Alice Wallenberg foundation, Шведским научно-исследовательским Советом (Swedish Research Council), фондом Chalmers Foundation и программой фонда Марии Кюри People Program (Marie Curie Actions) в European Union’s Seventh Framework Program FP7/2007—2013/ по грантовому соглашению REAGrantAgreementNo. 607842 (ЮрисКишкис).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: boksha_irina@mail.ru