Эксперимент с использованием лабораторных животных и других живых объектов является одним из ведущих методов познания в современной медицине, фармакологии, ветеринарии, биологии. Успешность любого эксперимента определяется соблюдением техники и методики эксперимента, а также адекватным выбором лабораторных животных [1, 2]. Ввиду ряда преимуществ при создании моделей болезней человека часто используются кролики породы шиншилла. Это обусловлено некоторым сходством филогенеза ЦНС кролика и человека, а также сроками процесса миелинизации нервных волокон, которые у большинства млекопитающих, включая приматов, практически заканчивается к моменту родов, т. е. активно протекают в пренатальном периоде, а у человека и кролика они сохраняются и в постнатальном периоде [3—10].

Разработка и внедрение в практику новых экспериментальных моделей неврологических заболеваний позволят значительно сократить время тестирования новых биологически активных соединений в качестве потенциальных лекарственных препаратов, а также выявить ранние и доклинические маркеры различных патологических состояний в неврологии.

Во всем мире отмечается неуклонный рост числа заболеваний нервной системы (сосудистые заболевания мозга, нейродегенеративные заболевания, спинальная травма и др.), которые относят вследствие их распространенности и последствий к категории социально значимых [11]. Цереброваскулярная патология занимает второе место в ряду основных причин смерти, уступая лишь заболеваниям сердца и опережая злокачественные опухоли всех локализаций, а также является ведущей причиной инвалидизации населения, что определяет ее как одну из важнейших медицинских и социальных проблем. При церебральных кровоизлияниях отмечается высокая летальность, которая, по данным разных авторов, колеблется от 75 до 95% [12].

Нейроны являются высокоспециализированными постмитотическими клетками, гибель которых приводит к дезинтеграции иерархических структур мозга, утрате соответствующей специализированной функции и развитию, как правило, необратимого неврологического и/или психического дефекта. В условиях весьма ограниченных возможностей регенерации нейронов проблема нейропротекции, т. е. защиты нейронов от повреждающего действия каскада нейрохимических реакций при острых катастрофах (инсульт, травма и др.) и хронических патологических процессах в нервной системе, выходит на первый план. Поэтому до настоящего времени актуальными остаются вопросы поиска эффективных методов лечения патологии центральной и периферической нервной системы, стимулирующих их восстановление, активизирующих процессы регенерации, что в целом будет способствовать восстановлению утраченных функций у пациента, перенесшего одно из заболеваний нервной системы.

В этом аспекте интерес исследователей вызывает препарат целлекс — белково-пептидный комплекс, полученный из эмбрионального головного мозга свиней, который обладает способностью положительно влиять на регенерацию нервной ткани.

Результаты экспериментальных исследований на лабораторных животных и клинических исследований I—III фазы показали эффективность и безопасность препарата при ишемических и геморрагических повреждениях мозга.

В 2015 г. было завершено двойное слепое плацебо-контролируемое многоцентровое исследование [13] целлекса при лечении пациентов с острым ишемическим инсультом, в котором были установлены высокая эффективность препарата в отношении регресса неврологической симптоматики, а также уменьшение выраженности когнитивного дефицита.

Целлекс — лекарственный препарат, обладающий нейропротективным и нейрорепаративным действием, проявляющимся в восстановлении регенеративного потенциала клеток мозга (стимуляция экспрессии нейрональных генов, миграция нейрональных стволовых клеток и нейробластов к очагу повреждения) за счет наличия органоспецифических сигнальных белков — факторов роста, факторов дифференцировки нервных клеток и регуляторных пептидов. Прямое нейропротективное действие целлекса на нейрональный и глиальный пулы нервной ткани доказано в экспериментах на лабораторных животных в моделях острого ишемического повреждения мозга методом фотоиндуцированного тромбоза, в клеточных культурах нейронов мозжечка и на модели глутаматной токсичности.

Первичное нейропротективное действие целлекса позволяет добиться уменьшения очага некроза мозговой ткани, за счет прерывания апоптоза в зоне пенумбры с уменьшением перифокального отека, направленной миграции нейрональных стволовых клеток и нейробластов к области повреждения, тем самым напрямую влияя на повышение процента выживаемости пациентов [14]. Активация препаратом вторичной нейропротекции в виде стимуляции редупликации ДНК и деления клеток (нейроны, глия), запуска синаптогенеза, восстановления сигналов аутофагии, улучшения тканевой иммунорегуляции с торможением иммуногенной цитотоксичности макрофагов, регуляции нейромедиации с торможением спилловера нейротрансмиттеров значительно расширяет показания применения препарата в неврологии и медицине катастроф.

Цель настоящего исследования — изучение эффективности применения целлекса при экспериментальном моделировании паренхиматозного кровоизлияния в головной мозг у кроликов породы шиншилла.

Для моделирования геморрагического инсульта использовали 57 кроликов породы шиншилла (возраст от 6 мес до 1 года, масса тела от 1,5 до 2 кг). Животных содержали в стандартних условиях вивария (12-часовой световой день, свободный доступ к воде и пище, температура воздуха 23—25 °С).

Все манипуляции проводились под внутримышечным наркозом с использованием телазола 100 мг в дозировке 7,5 мг/кг и миорелаксанта рометар 0,15 мг/кг.

Для анестезии в месте разреза кожи использовали 2% раствор лидокаина. Линейный разрез кожи (около 3 см) осуществлялся в проекции сагиттального шва. Затем, отступив 1,0 см от средней линии, проводилась трепанация черепа и при помощи кусачек Фолькмана расширялся костный дефект до 1 см. Далее с помощью инъекционной иглы, введенной на глубину 1—1,3 см, проводилась деструкция мозговой ткани в проекции теменной доли головного мозга. Дефект закрывался с помощью ксенотрансплантата (лоскут свиной кожи 2×4 см). Такая методика позволила создать приблизительно одинаковый размер повреждения у всех экспериментальных животных.

Все кролики были разделены на 2 группы в зависимости от лечения в послеоперационном периоде: основная группа (ОГ) состояла из 26 животных, которым подкожно вводили препарат целлекс (1,0 мл раствора, содержавшего 0,1 мг препарата, 1 раз в сутки, подкожно в течение 10 сут, начиная со дня эксперимента). Группу сравнения (ГС) составил 31 кролик, которому без медикаментозного лечения вводился только 0,9% физиологический раствор в аналогичных дозах и режиме.

Эвтаназию кроликов проводили путем передозировки внутривенного тиопенталового наркоза с последующей декапитацией. Для фиксации материала использовали 10% кислый или нейтральный забуференный раствор формалина.

Для оценки эффективности целлекса использовали наблюдение за экспериментальными животными. Проводили также нейроморфологическое исследование мозга, которое включало следующие методы: гистологический (окраска гематоксилином и эозином), иммуногистохимический, морфометрический.

Для обзорной световой микроскопии патологических процессов ткань головного мозга размером 1×1×0,5 см фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Ткань обезвоживали в батареях спиртов восходящей концентрации (1-я: 50, 60, 70, 80, 96%; 2-я: 96% и абсолютный спирт), просветляли в ксилоле, выдерживали в насыщенном при +37 °С растворе парафина в ксилоле, помещали в парафин при +56 °С с последующей заливкой в смесь парафина и воска и изготовлением парафиновых блоков, из которых делали серийные срезы толщиной 4—5 мкм. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Патогистологическое исследование проводили на базе кафедры патологической анатомии с секционным курсом Медицинской академии им. С.И. Георгиевского — подразделения КФУ им. В.И. Вернадского.

Иммуногистохимическое исследование ткани проводили по стандартизованной методике с использованием серийных парафиновых срезов толщиной 3—5 мкм, помещенных на адгезивные стекла, покрытые полизином («Menzel-Glaser», Германия), и реактивов компании «DAKO» с поликлональными антителами Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), системы визуализации EnVision FLEX+, Mouse, HighpH (Link), CodeK8012 на автостейнере фирмы «DAKO» в гистологической иммуногистохимической лаборатории Клиники «Генезис». В стандартную методику входило использование негативного и позитивного контроля. GFAP визуализировался как коричневое окрашивание астроцитов, включая их тела и отростки.

Морфометрическое исследование включало измерение количества GFAP-позитивных клеток при ув. 400 в 10 произвольно взятых полях зрения с помощью программы Software («DP-SOFT»). Степень экспрессии GFAP-позитивных клеток классифицировалась в соответствии с количеством окрашенных клеток: слабовыраженная (+) — менее 10 окрашенных клеток; умеренно выраженная (++) — 10—30 окрашенных клеток; выраженная (+++) — более 30 окрашенных клеток.

Просмотр и фотографирование микропрепаратов осуществляли цифровой камерой OLYMPUS 5050Z, установленной на микроскопе Olympus CX-41.

Статистическая обработка данных выполнена с помощью пакета прикладных программ Statistica 7.0 («StatSoft Inc.», США). Сравнение между группами проводили непараметрическими методами с использованием критерия Манна—Уитни. Статистически значимыми считались отличия при p<0,05 (95% уровень значимости) и при p<0,01 (99% уровень значимости).

Через 1,5 ч после оперативного вмешательства и выхода из наркоза у кроликов обеих групп отмечались двигательные надсегментарные нарушения, обусловленные деструкцией моторной зоны теменной области головного мозга. Они проявлялись в виде изменений мышечного тонуса по типу горметонии (периодические тонические спазмы с резким повышением тонуса в контралатеральных конечностях). Активные движения в правой тазовой конечности были крайне ограничены, что соответствует глубокому парезу нижней конечности 4-й степени (шкала НИИ неврологии РАН). Наблюдалось нарушение равновесия и координации движений. Кролики выглядели апатичными и обессиленными. Не совершали рутинных действий.

На 6-е сутки после проведения оперативного вмешательства у кроликов ОГ на фоне введения препарата целлекс отмечался регресс неврологического дефицита — активные движения были неловкими, однако увеличился их объем в правой тазовой конечности, что соответствует 2-й степени пареза (умеренный парез) правой нижней конечности (p<0,05). Кролики О.Г. начинали быстрее принимать корм и воду, наравне с интактными особями участвовали в оспаривании иерархии внутри коллектива.

При макроскопическом исследования мозга в проекции деструкции теменной области головного мозга у кроликов ГС определялся процесс соединительнотканной регенерации: надкостница теменной области была спаяна с твердой мозговой оболочкой, а участок деструкции был заполнен твердым соединительнотканным рубцом (рис. 1, а).

У кроликов ОГ соединительнотканные изменения не прослеживались, а участок деструкции (0,6 см) после 10-дневного курса терапии уменьшился по сравнению с моделируемым (1 см) (p<0,001), что свидетельствовало о замедлении формирования соединительной ткани на фоне введения целлекса (см. рис. 1, б).

В ткани головного мозга кроликов ГС отмечались выраженные деструктивно-дистрофические процессы в сочетании с нарушением гемодинамики и воспалительными изменениями. Так, у большинства животных ГС были выявлены очаги коагуляционного некроза нервной ткани (рис. 2, а). Наряду с такими изменениями в паранекротической зоне определялись единичные, реже множественные нейроны с признаками апоптоза, так называемые «красные нейроны» (см. рис. 2, б). Некоторые из этих эозинофильных клеточных тел были сморщены, содержали конденсированный ядерный хроматин и были окружены отечными клетками глии. В этих участках происходила активация микроглиальных клеток, при этом отростки их укорачивались, они приобретали амебоподобное строение. В ткани головного мозга отмечались выраженный перицеллюлярный и интрацеллюлярный отек астроцитов, группы скоплений пенистых макрофагов (см. рис. 2, в). Вокруг очага поражения у животных ГС отмечались признаки расстройства кровообращения в виде отека, полнокровия и петехиальных кровоизлияний (см. рис. 2, г). Такие кровоизлияния имели вторичный характер, так как в них определялись свежие негемолизированные эритроциты. В отдельных случаях в просвете сосудов выявлялись микротромбы (см. рис. 2, д). В области очага поражения присутствовали мелкие очаговые скопления гемосидерина в виде глыбок золотисто-коричневого цвета (см. рис. 2, е). Во всех материалах ГС определялась выраженная мононуклеарная воспалительная инфильтрация (см. рис. 2, ж). Кроме того, обращали на себя внимание скопления гипертрофированных многоотростчатых астроцитов, которые формировали плотную сеть (глиальный рубец) по периферии очага деструкции (см. рис. 2, з).

При микроскопическом исследовании мозга кроликов ОГ отмечались прежде всего меньшая выраженность нарушений кровообращения и очаговость воспалительной реакции (рис. 3, а).

Таким образом, гистологическая картина головного мозга при моделировании геморрагического инсульта характеризовалась разными морфологическими проявлениями. Среди них доминировали изменения дистрофически-деструктивного характера и воспалительные изменения. Вокруг очагов некроза, помимо массивной воспалительной инфильтрации, обнаруживалась широкая зона реактивных гипертрофированных астроцитов, представляющая собой глиальный «рубец». Такую выраженность астроглиоза можно расценивать как изменения компенсаторно-адаптационного характера, которые защищают гематоэнцефалический барьер от повреждения. Однако секретируемые астроцитами нейроингибиторы подавляют процессы регенерации аксонов и ремиелинизации, что препятствует полному морфологическому и функциональному восстановлению ткани головного мозга.

У животных ОГ степень выраженности воспалительных и гемодинамических нарушений была значительно ниже, очаги некроза не выявлялись, но при этом определялись мелкие очаги неоангиогенеза. Макрофагальная реакция в этих случаях была значительно менее выраженной, что способствовало более активному течению процесса нейрорегенерации.

Для оценки степени выраженности репаративных процессов в ткани головного мозга при моделировании геморрагического инсульта в ОГ и ГС было проведено иммуногистохимическое исследование на основе выявления маркера астроцитов — GFAP (рис. 4).

При иммуногистохимическом исследовании вокруг очага некроза ткани головного мозга у животных ГС обнаруживались скопления астроцитов с признаками деструкции (см. рис. 4, а). Для оценки степени выраженности нейрорепарации исследовались участки, содержащие астроциты нормального строения без признаков деструктивно-дистрофических изменений, вне очага некроза нервной ткани (см. рис. 4, б). В результате иммуногистохимического исследования головного мозга кроликов ГС была установлена выраженная степень астроглиоза, при которой количество GFAP-позитивных клеток составило 38,07±0,6 (p<0,05) (см. рис. 4, в). При исследовании материала животных ОГ была выявлена низкая степень астроглиоза на границе очага поражения, при которой количество GFAP-позитивных клеток составляло 9,2±0,8 (p<0,05) (см. рис. 4, г).

Можно констатировать, что в ОГ животных пролиферативная активность астроцитов была достоверно менее выражена, составляя около 24% от показателей ГС (p<0,05), что может свидетельствовать о более активных процессах нейрорепарации в ОГ.

Таким образом, у кроликов ОГ на 6-е сутки после проведения оперативного вмешательства на фоне введения препарата целлекс отмечался регресс неврологического дефицита в виде увеличения объема активных движений в конечностях. Кролики О.Г. становились более адаптированными. При макроскопии головного мозга у них не прослеживалось соединительнотканных изменений, а участок деструкции уменьшился по сравнению с первоначальным. При микроскопическом исследовании в ОГ степень выраженности воспалительных и гемодинамических нарушений в ткани мозга была значительно ниже, очаги некроза не выявлялись, но при этом определялись мелкие очаги неоангиогенеза. Иммуногистохимическое исследование материала животных ОГ показало низкую степень астроглиоза на границе очага поражения. Полученные данные свидетельствуют о том, что использование препарата целлекс является стабилизирующим фактором в развитии патологического процесса, уменьшающим сроки восстановления нормальной структуры и функции.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: vlasenko65@rambler.ru