Цикл бодрствование—сон и экспериментальные модели мутаций по гену Panx1

Недавно группой канадских и американских исследователей [1] была впервые описана 17-летняя пациентка турецкого происхождения с гомозиготной точечной мутацией гена паннексин-1 (Panx1) — заменой гуанина на аденин в положении 650, что приводит к замене Arg на His в положении 217 в экспрессируемом белке. В результате этот белок теряет способность к нормальному фолдингу и, соответственно, свою функцию. У больной была выявлена мультисистемная дисфункция, включающая умственную отсталость, глухоту, кифосколиоз (горбатость) и недоразвитие яичников. Предполагается, что первопричиной этой глобальной патологии является нарушение функционирования паннексина-1 — белка, обнаруженного группой российских исследователей в 2000 г. [2]. Столь тяжелые последствия единичной точечной мутации (однонуклеотидного полиморфизма) — редкое явление в медицинской генетике; они указывают на исключительно важную роль гена Panx1 в развитии организма.

В геномах млекопитающих имеется 3 гена семейства паннексинов. Паннексины могут быть вовлечены в регуляцию многих важных биологических функций, а также в реализацию ряда патологических механизмов. Паннексины могут играть ключевую роль в межклеточной коммуникации, так как способны формировать щелевые контакты между клетками; функционируют в наружной мембране клетки в виде полуканалов, которые обладают высокой проницаемостью для пуринов (АТФ) и ряда других сигнальных молекул. Эти свойства определяют ключевое значение паннексинов в пара- и аутокринной системах [3, 4]. Несмотря на то что опыты, направленные на поиск фенотипических эффектов, связанных с функцией паннексинов, обнаруживают достоверные изменения в работе отдельных систем и органов, животные, нокаутные по гену Panx1, фертильны и внешне сходны с контрольными. Почему фенотип отсутствия паннексина-1 у человека выражен сильнее, чем у животных, остается неясным.

Паннексины присутствуют в различных органах и тканях млекопитающих, причем экспрессия паннексина-1 в головном мозге — одна из самых высоких. Нервные и глиальные клетки экспрессируют этот белок уже на ранних стадиях эмбрионального развития, так что формирование дефектных клеточных каналов может влиять на нейрональное развитие и дифференцировку. Нарушение функционирования образуемых паннексином-1 мембранных каналов может приводить к снижению поступления АТФ в межклеточную среду головного мозга. Внеклеточный АТФ в свою очередь является источником аденозина — важнейшего регулятора цикла бодрствование—сон [5]. В связи с этим заметим, что в упомянутой работе [1] о нарушении у больной этого цикла не сообщалось.

Цель настоящего исследования — проверка высказанного авторами ранее [6] предположения, что мутация Panx1 может играть важную роль в нарушении регуляции цикла бодрствование—сон.

Для проверки гипотезы на первом этапе исследования в качестве объекта были выбраны взрослые (2—3-месячные, массой 25—30 г) мыши-самцы линии C57BL/6J (контроль) и выведенные от этой линии нуль-нокаутные по гену Panx1 взрослые самцы [7].

Под авертиновым наркозом животным были вживлены 4 эпидуральных нихромовых электрода в лобные и теменные отделы коры мозга и референсный электрод в носовую кость. После операции животных помещали в индивидуальные звукоизолированные боксы при постоянном световом режиме 12/12: 9—21 ч — яркий (150 лк) белый свет, 21—09 ч — слабый (15 лк) — красный и температуре 22—24 °С. Вода и пища были доступны животным постоянно. По истечении недельного периода восстановления начинали непрерывную круглосуточную регистрацию полисомнограммы (ПСГ), включающей 2 канала ЭЭГ и запись механограммы (двигательной активности), а также видеорегистрацию поведения животных. Каждое животное было подсоединено посредством гибкого кабеля к входу миниатюрного автономного цифрового телеметрического усилителя биопотенциалов размером 30×25×4 мм и массой 5 г (конструкция А.А. Трощенко), снабженного 3-мерным акселерометром. Плата усилителя соединена эластичной связью с источником питания, и вместе с ним подвешена к штанге над камерой посредством вращающегося карабина. Такая конструкция дает возможность регистрировать ПСГ, не ограничивая свободу перемещений животного, и позволяет плате усилителя биопотенциалов со встроенным акселерометром свободно колебаться в трех плоскостях и реагировать даже на небольшие движения мыши. ЭЭГ регистрировали с частотой дискретизации 250 Гц, а двигательную активность — 50 Гц. Сигналы усилителя передавались на регистрирующий компьютер по каналу bluetooth. Визуальный полуавтоматический анализ полученных ПСГ по 20-секундным эпохам проводили с помощью специальной программы, созданной на базе EDF-браузера с открытым кодом [8]. По общепринятым критериям для грызунов выделяли состояния бодрствования, медленного и быстрого сна, что было описано нами ранее [9].

Статистический анализ проводили с помощью непараметрического критерия Манна—Уитни (U-тест).

Как видно из рис. 1, у

Двигательная активность у нокаутных мышей была значительно выше, чем у контрольных и в темный, и в светлый период суток в камере как по своей продолжительности, так и по интенсивности (рис. 2).

Была проведена также 6-часовая депривация сна в светлый период суток с помощью «мягкого» поведенческого метода пробуждений [10] (покачивание клеток, постукивание по стенкам, поддувание животных струей воздуха из резиновой груши и т. п.) на фоне регистрации ПСГ. Однако сравнение продолжительности и структуры сна в его «отдаче» не выявило статистически значимых различий между нокаутными и контрольными животными.

Таким образом, в настоящем исследовании были выявлены значительные структурные различия цикла бодрствование—сон между мышами, лишенными гена Panx1, и контрольными особями, а именно: повышение у первых представленности (суммарной продолжительности) бодрствования и уровня двигательной активности и, соответственно, сокращение медленного сна (особенно выраженное в темный период суток). Эти различия связаны в первую очередь с удлинением суммарного (за 12 ч) времени бодрствования с соответствующим сокращением сна. То, что этот эффект наиболее выражен в темное время суток, когда животные наиболее активны, а также наличие «отдачи» быстрого сна в светлое время, свидетельствует в пользу предположения, что выявленные эффекты в первую очередь связаны с повышением уровня бодрствования, а изменение структуры сна носит скорее всего ответный характер. Мыши без гена Panx1 лишены одного из основных путей выхода АТФ в межклеточное пространство и, соответственно, у них снижена концентрация ее метаболита — аденозина, который общепризнан как один из важнейших модуляторов цикла бодрствование—сон [5]. Логично связать выявленные различия в структуре этого цикла у нокаутных и контрольных животных с гипотетическим снижением уровня внеклеточного аденозина в ключевых структурах головного мозга.

Другой способ понизить уровень внеклеточного аденозина — это заблокировать его белок—переносчик ENT1 (type 1 equilibrative nucleoside transporter). Следует отметить, что у мышей, нокаутных по гену ENT1, также отмечалось снижение представленности медленного сна по сравнению с контрольными животными, хотя оно было более выражено в светлый, а не в темный период, как в наших опытах [11]. Кроме того, «отдача» в ответ на депривацию сна у мышей, нокаутных по гену ENT1, не отличалась от контроля, как и в наших опытах [11]. Можно предположить, что оба способа выброса АТФ в межклеточное пространство могут компенсировать друг друга как в условиях нормы, так и патологии. Гипотеза о накоплении аденозина в «ключевых» точках межклеточного пространства головного мозга (базальная область переднего мозга и др.) в ходе продолжительного бодрствования является сейчас общепринятой, поэтому наши результаты по депривации сна, как и результаты [11], на первый взгляд, расходятся с этим предположением. Помимо возможности «компенсационного» накопления аденозина альтернативным путем нельзя исключить, что аденозин в этом процессе не задействован [12].

Однако обращает внимание, что наши эксперименты на мышах с гомозиготным нокаутом по гену Panx1, как и другие исследования на подобных моделях, не выявили столь драматичных изменений, какие отмечены у пациентки в указанной статье [1]. Мы обнаружили у этих мышей лишь повышение двигательной активности и представленности бодрствования с соответствующим снижением доли медленного сна. Эти изменения были особенно выражены в темный (активный) период суток. Возможные различия между нашей моделью и патологией у человека могут быть связаны с компенсаторным усилением экспрессии двух других паннексинов (Panx2 и Panx3) у модельных объектов в ходе онтогенеза. Кроме того, экспрессия белка Panx1 с нарушенной структурой, не способного к полноценному выполнению своих функций у больной, может быть по своим эффектам не тождественна полному его отсутствию у модельных животных. Тем не менее как клинические, так и экспериментальные данные свидетельствуют о важнейшей роли паннексина-1 в регуляции целого ряда функций организма, включая процессы бодрствования—сна. В дальнейшем мы планируем изучение описанной в статье [1] мультисистемной патологии на более адекватной модели не с удалением, а с заменой нормального гена Panx1 на дефектный.

Поскольку выяснилось, что мутации гена Panx1 могут серьезно влиять на состояние человека, мы изучили набор мутаций, потенциально способных сказаться на работе данного белка. Всего в гене Panx1 их найдено 3311, при этом 306 (303 положения) — в кодирующей части гена [13]. Бо́льшая часть этих мутаций синонимична, т. е. не приводит к замене кодируемой аминокислоты (88 штук), но есть и исключения: 6 нонсенс-мутаций (т.е. таких, в результате которых кодон теряет способность кодировать какую-либо аминокислоту, и становится стоп-кодоном, что приводит к преждевременному прерыванию синтеза данного белка) в положениях аминокислот 104, 127, 239, 300, 413, 418, а также 217 миссенс-мутаций (переключающих кодон на синтез другой аминокислоты). Найдены также 4 инделя (инсерций или делеций нескольких нуклеотидов) в районе положения аминокислот 197, 294, 298, 405, ведущие к мутации «сдвига рамки считывания» генома.

Часть вариаций (45 штук) обнаружены в проекте «1000 геномов» и их частота может быть оценена. Из них 12 синонимичны и особого интереса не представляют. Самая частая вариация встречается в положении 5, где у каждых 7 человек из 10 находится аминокислота глутамин, а у 3 — гистидин. Скорее всего эта вариация не сказывается существенно на работе белка, поскольку гистидин в этом положении у других млекопитающих встречается чаще, чем глутамин. Особый интерес, на наш взгляд, может представлять мутация в первом кодоне, превращающая стартовый метионин в триптофан. Теоретически при такой замене синтез белка может либо вообще не состояться, либо начаться со следующего старт-кодона (ATG). Ближайший ATG-кодон лежит на 108 нуклеотидов вправо, и синтез с этой позиции приведет к образованию укороченного белка, полностью лишенного внутриклеточного концевого N-фрагмента. (Структура белка паннексин-1 такова, что он содержит внутриклеточные концевые N- и C-фрагменты, 4 трансмембранных домена, 2 внеклеточные и 1 внутриклеточную петли). Такое изменение может радикально повлиять на функцию паннексина-1. Данная вариация встречается в проекте «1000 геномов» с частотой 0,0004. Ясно, что гомозигота по этой мутации будет встречаться очень редко, но несколько десятков таких случаев могут существовать в Российской Федерации, если мутация не ведет к смерти в гомозиготном состоянии.

Можно сделать следующее заключение: 1) мутаций, влияющих на функции гена Panx1, мало, что может свидетельствовать о важности этого белка для нормального развития и функционирования организма человека; 2) наряду с описанной мутацией в положении 217 в популяции людей существуют и другие потенциально вредные мутации паннексина-1. Это означает, что число гомозигот, связанных с нарушением работы паннексинов, может составлять десятки и даже сотни больных. Такие не выявленные пациенты могут находиться в настоящее время в различных психоневрологических стационарах на территории России.

Работа поддержана грантом РНФ (проект № 17−15−01433).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: kovalzon@sevin.ru