Наследственные (семейные) кавернозные мальформации (КМ, каверномы) ЦНС составляют 10—30% всех каверном. Они наследуются аутосомно-доминантно с различной пенетрантностью и экспрессивностью признака [1, 2]. В ходе многочисленных генетических исследований, выполненных за последние 30 лет, выявлено три гена, гетерозиготные мутации которых ассоциированы с формированием наследственных КМ, — так называемые гены ССМ (англ.: cerebral cavernous malformations): CCM1 (7q21—22, OMIM 604214) [3, 4], ССМ2 (7p13—15, OMIM 607929) [5, 6] и ССМ3 (3q25.2—27 OMIM 609118) [7, 8]. Они отвечают за синтез трех белков: Krit1 (англ.: krev interaction trapped 1), OSM (англ.: osmosensing scaffold for MEKK3) и malcaverin (PDCD10 — programmed cell death 10) соответственно [9]. Данные белки работают в комплексе, обеспечивая сложное взаимодействие эндотелиальных клеток с другими элементами клеточной стенки и формирование микроваскулярного русла в ткани мозга. В настоящее время ведутся исследования по расшифровке молекулярных механизмов этого взаимодействия [10—12].

Существование наследственных форм каверном, связанных с установленными мутациями, позволило включить данную патологию в реестр моногенных заболеваний (MIM/OMIM 116860).

Цель работы — выявление мутаций генов КМ ЦНС у больных с наследственной формой патологии в российской популяции.

За период с 1993 по 2015 г. в НИИ нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко были обследованы более 1500 больных с КМ ЦНС. Среди них выявлены 36 семей (79 человек) с наследственными КМ, подтвержденными методами нейровизуализации (доказанные случаи), и 26 человек, у которых семейный характер патологии доказан только по клиническим данным, без нейровизуализационного подтверждения (далее — условно доказанные случаи). Образцы крови для генетических исследований взяты у 29 человек из 16 семей с доказанной формой патологии, выбранных случайным образом (больные с клинически проявившимися КМ, бессимптомные носители КМ), у 6 — с условно доказанными семейными КМ, а также у 38 — со спорадическими одиночными и множественными. При доказанной наследственной форме в 1 семье образцы крови были взяты у 4 человек, в 10 — у 2, в 5 — у 1. Таким образом, собрана коллекция ДНК, насчитывающая 73 образца крови. Средний возраст больных составил 30,1±14,3 года, соотношение мужчин и женщин — 27:46. Операцию удаления КМ выполняли в 54 случаях, 19 больных получают консервативную терапию или находятся под наблюдением.

Генетический анализ. Для анализа крупных структурных перестроек (делеции/вставки) в генах КМ использовали метод мультиплексной амплификации лигазносвязанных проб (MLPA, англ.: мultiplex ligation-dependent probe amplification). В анализ были включены все 73 образца. В случаях, когда крупные изменения генов у больных с наследственными формами не были обнаружены, выполняли полноэкзомное секвенирование и последующее выявление однонуклеотидных мутаций (SNР, англ.: single nucleotide polymorphism). Эти исследования были выполнены только у одного члена каждой семьи, так как при наследственной форме этого достаточно. Всего проанализировали восемь образцов крови (семь — доказанные семьи, один — условно доказанная). Анализ полиморфизмов проводили с помощью программы StationX. Значимость мутаций оценивали с использованием программы Polyphen.

Клинико-нейрорадиологический анализ. У каждого больного оценивали следующие параметры течения заболевания и данных магнитно-резонансной томографии (МРТ): возраст манифестации, кровоизлияние в анамнезе, количество и размер, а также новообразование и рост каверном. Каверномы оценивали как «активные» при манифестации заболевания до 18 лет, кровоизлияниях в анамнезе, размере более 2 см, новообразовании и/или росте, зафиксированных нейровизуализационными методами [13].

Методом MLPA в 14 образцах были выявлены крупные перестройки: делеции двух экзонов и более. Из этих образцов 9 относились к доказанным наследственным случаям (5 семей), 2 — к условно доказанным случаям (2 семьи), 3 — к так называемым спорадическим случаям. Выявление мутаций в 5 последних случаях свидетельствует о наследственном характере патологии, поэтому при дальнейшем анализе эти наблюдения были включены в группу наследственных. В 12 случаях выявлялись делеции, описанные ранее, в 2 — ранее не описанные делеции в гене ССМ3. SNP-анализ 8 образцов выявил мутации с высоким эффектом на структуру и функции кодируемого белка в гене ССМ1 в 4 образцах, в гене ССМ2 — в 2 (изменение последовательности в местах сплайсинга, сдвиг рамки, приобретенный «стоп») (см. таблицу). В 2 образцах ни в одном из генов КМ-мутаций, имеющих высокий эффект, не обнаружено. Вероятно, у этих больных патология обусловлена мутациями в других генах. Подтверждение данного предположения требует дальнейших исследований.

Таким образом, у подавляющего большинства пациентов с установленной наследственной формой заболевания были выявлены существенные изменения в генах КМ — в 11 из 12 семей, обследованных с помощью обоих методов. Кроме того, выявлены крупные перестройки этих генов в случаях, которые по клиническим данным были отнесены к условно доказанным или спорадическим.

Данные по найденной значимой однонуклеотидной мутации у пациентов с наследственной формой были экстраполированы на родственников с верифицированными К.М. Таким образом, больных с однонуклеотидными мутациями было 13 человек, а с мутацией в генах КM — 27. Количественное соотношение по генам CCM1, CCM2 и CCM3 составило 60,7, 32,2 и 7,1% соответственно.

Проведены сопоставления клинического течения заболевания в группе наследственных КМ (1-я группа), подтвержденных при генетическом анализе, и группе одиночных спорадических КМ (2-я группа). Спорадическими случаи были названы условно, так как у этих больных не было выполнено исследование по поиску SNP. Случаи множественных спорадических КМ исключали из анализа, так как множественность КМ ассоциирована с высокой вероятностью наследственной патологии [14]. Так, в нашей серии частота множественных КМ при наследственной форме патологии составила 76%, а в группе всех спорадических КМ — 14,7%.

Из 73 больных так называемые активные КМ были обнаружены у 44. Отличий в количестве «активных» каверном в 1-й и 2-й группах выявлено не было. Кровоизлияния в анамнезе зафиксированы у 16 (69,6%) из 23 больных 1-й группы и у 13 (43,3%) из 30 — из 2-й группы. Различие имело достоверность на уровне тенденции (p=0,06). Во 2-й группе не было больных с началом заболевания до 12 лет. В 1-й группе заболевание манифестировало в возрасте до 12 лет у 6 человек (3 — с крупными делециями в генах КМ, 2 — с однонуклеотидными значимыми мутациями и 1 — с предположительной мутацией вне известных генов КM). Во 2-й группе не было зафиксировано случаев роста и новообразования КМ. В 1-й группе рост и/или новообразование КМ выявлялись у 6 больных (у 4 — крупные делеции, у 2 — однонуклеотидная значимая мутация).

У 2 больных с крупными делециями в гене CCM3 наблюдалось тяжелое клиническое течение заболевания, характеризующееся повторными кровоизлияниями, ростом и новообразованием КМ.

Приводим наблюдение.

Больная Б-ва, 1977 г. р., впервые обратилась в институт в январе 2011 г.

Течение болезни: в сентябре 2010 г. появилось двоение. При МРТ головы выявлены множественные КМ головного мозга: правая лобная доля (6 мм), четверохолмие (2 см) и варолиев мост (1 см) (см. рисунок, а, б, в, м). Лечилась консервативно. 07.01.11 развилась сильная головная боль (ГБ), усилилось двоение, появилось онемение правой половины тела. На МРТ — признаки кровоизлияния из КМ среднего мозга. Консультирована в институте, рекомендовано консервативное лечение, однако состояние продолжало ухудшаться — появились эпизоды тошноты, рвоты. МРТ выявила окклюзионную гидроцефалию. Госпитализирована в институт, 17.02.11 выполнена операция «опорожнение гематомы покрышки среднего мозга, больше справа». Гистологический диагноз — капсула гематомы. В послеоперационном периоде состояние улучшилось. В августе 2011 г. — клиническая картина повторного кровоизлияния из КМ среднего мозга с развитием глазодвигательных и мозжечковых симптомов. На МРТ — признаки повторного кровоизлияния из КМ среднего мозга. 08.11.11 выполнена операция удаления хронической гематомы и КМ среднего мозга, больше слева. Гистологический диагноз — капсула гематомы, К.М. Выписана в удовлетворительном состоянии. Сохранялась очаговая стволовая симптоматика на дооперационном уровне. Спустя 1 мес отметила нарастание ГБ, появились приступы по типу окклюзионных. На К.Т. выявлена окклюзионная гидроцефалия, на глазном дне — признаки внутричерепной гипертензии. 14.12.11 выполнена вентрикулостомия III желудочка, 27.12.11 в связи с ее неэффективностью произведено вентрикулоперитонеальное шунтирование справа. Спустя 6 мес появились периодическая рвота, нарушения статики и походки. В сентябре 2012 г. состояние существенно ухудшилось — участилась рвота, снизилась общая активность, перестала ходить самостоятельно. МРТ выявила признаки кровоизлияния в черве и обеих гемисферах мозжечка (см. рисунок, г, д, е). Госпитализирована, 15.10.12 выполнена операция удаления гематомы и КМ мозжечка. Гистологический диагноз — капсула хронической гематомы, единичные полости с недифференцированными стенками. Также выявлено новообразование КМ в правой теменной доле (см. рисунок, к, л). В послеоперационном периоде симптоматика частично регрессировала. В последующие 2 года 9 мес состояние стабильное. Была полностью независима в быту. С июля 2015 г. стала отмечать нарастание двоения, головокружение, шаткость, онемение правой половины тела. На МРТ — признаки повторного кровоизлияния на уровне среднего мозга, больше слева (см. рисунок, ж, з, и). Госпитализирована. 11.08.15 выполнена операция удаления кавернозной ангиомы покрышки среднего мозга и верхних ножек мозжечка. Гистологический диагноз — КМ со следами кровоизлияний разной давности. В послеоперационном периоде отмечено нарастание глазодвигательных нарушений, которое в последующем существенно уменьшилось.

Генетический анализ: образец 61 (см. таблицу).

Спустя 6 мес после операции сохраняются легкие глазодвигательные нарушения, мягкая псевдобульбарная симптоматика, легкий левосторонний гемипарез, выраженные нарушения статики, походки, координации. Психопатологическая симптоматика в виде плаксивости, депрессивного настроения, снижения критики. Нуждается в постоянной помощи.

Семейный анамнез: отец с молодого возраста страдал паркинсонизмом. Более детальной информации нет. Дочь больной, 2007 года рождения, здорова, от предложенного МРТ-обследования и взятия крови для генетического исследования родители отказались.

Таким образом, за 5 лет с момента начала заболевания больная с первично множественными КМ головного мозга перенесла не менее четырех кровоизлияний из КМ среднего мозга. За период наблюдения сформировались две новые КМ, одна из которых проявилась тяжелым кровоизлиянием с формированием большой гематомы. Все кровоизлияния приводили к появлению и нарастанию как очаговой, так и общемозговой симптоматики. До последнего ухудшения состояние больной оставалось достаточно компенсированным, и лишь последнее кровоизлияние привело к инвалидности.

Клинические данные о возможном наследовании каверном ЦНС появились около 100 лет назад. Долгое время предположение о семейном характере заболевания основывалось на сведениях о клинических проявлениях церебральной патологии у кровных родственников больного, а достоверный диагноз можно было поставить только в случаях хирургических вмешательств у 2 членов одной семьи и более. С появлением и повсеместным распространением МРТ, а также совершенствованием точности этого метода возможности по выявлению наследственных каверном существенно возросли. К настоящему времени описано множество наблюдений [15, 16], когда МРТ-обследование клинически здоровых родственников больных со спорадическими КМ позволяло установить семейный характер патологии. Специфичность клинико-инструментального подхода высока, что подтверждается и данными нашей серии — у подавляющего большинства пациентов с установленной таким образом наследственной формой заболевания были выявлены значимые мутации в известных генах КМ. В то же время чувствительность инструментального метода требует уточнения. Самым точным методом определения наследственной формы КМ на настоящий момент следует признать генетическое исследование.

Существование наследственных и спорадических форм КМ многие авторы объясняют с помощью гипотезы «двойного удара» Кнудсена, выдвинутой для объяснения аналогичных форм ретинобластом [17]. Согласно этой гипотезе, в случае наследственной формы заболевания мутация в первом аллеле происходит в клетках зародышевой линии (наследственная), а вторая («второй удар») — в соматических. В соответствии с этими представлениями, спорадическая форма заболевания может быть результатом двух мутаций в соматической клетке. В нашей серии у 3 (7,9%) больных с предположительно спорадической формой заболевания выявлены крупные мутации в генах КM, что позволяет говорить о наследственном характере болезни. Поскольку не все образцы крови были исследованы с помощью крайне дорогого метода анализа (SNP), данная цифра скорее всего занижена.

Данные о распространенности мутаций в трех генах КM различны. Согласно данным двух больших серий, соотношение генов CCM1/CCM2/CCM3 составляет 71,5:20,1:8,4% (333 пациента) [14] и 63:19:18% (300 пациентов) [18] соответственно. Во всех сериях преобладают мутации гена CCM1 с последующим изменением белка Krit1. Проведенный нами анализ также показал, что основное число наследственных случаев обусловлено мутациями в гене ССМ1. Соотношение генов CCM1/CCM2/CCM3 в нашей серии составило 60,7:32,2:7,1%, что соответствует данным других исследований.

В определении «активности» КМ мы руководствовались ранее предложенными достаточно условными критериями [13], однако более точная оценка биологического поведения КМ до настоящего времени не разработана. Отсутствие значимых различий «активности» КМ в наследственной и спорадической группах нашей серии, возможно, объясняется тем, что в исследование попали в основном оперированные и, следовательно, клинически значимые спорадические К.М. Тем не менее наши предыдущие исследования [16] и настоящая серия демонстрируют тенденцию к большей частоте кровоизлияний и более раннюю манифестацию заболевания при наследственных КМ. К аналогичным выводам приходят и другие авторы [8]. В связи с этим требует изучения то, что в одной семье могут быть пациенты с «активными» и «неактивными» КМ и факт различной «активности» КМ у одного больного при множественных формах патологии. К серьезным изменениям в фенотипе могут приводить как большие делеции, так и значимые однонуклеотидные полиморфизмы, приводящие к нарушению структуры и функции белка.

Существуют данные о неравноценном клиническом значении мутаций в различных генах КM. Мутации в CCM1 связывают с более тяжелым течением заболевания по сравнению с CCM2 [14]. Наиболее тяжелые формы описаны при мутации гена CCM3 — PDCD10. Молекулярно-генетические механизмы, лежащие в основе тех или иных клинических проявлений, интенсивно изучаются, но уже сейчас известно, что данный ген связан с регуляцией процессов апоптоза и деления клеток [19]. У больных с мутациями гена CCM3 описаны [14, 19, 20] более раннее начало болезни, большая вероятность геморрагических событий, большее количество КМ в аналогичном возрасте. В ряде работ [8, 18] описано сочетание множественных КМ и менингиом головного мозга у больных с мутацией в CCM3. В нашей серии выявлены 2 больных с делециями в гене CCM3. В обоих случаях было подтверждено более тяжелое клиническое течение заболевания в виде повторных кровоизлияний, потребовавших оперативного лечения, а также новообразования и роста КМ. В отношении возраста манифестации в этих случаях делать какие-либо выводы сложно, тем не менее отметим, что в одной из семей заболевание у 2 братьев проявилось до 5-летнего возраста.

Роль отдельных мутаций каждого из генов КМ требует дальнейшего изучения. По-видимому, она зависит от степени влияния на структуру и функцию белка.

В одной из больших серий [14] по молекулярно-генетическому анализу ДНК у больных с наследственными формами каверном (96 случаев) мутации в генах КМ выявлены в 94% случаев. В нашей серии мутации выявлены у 91,7% семей. Таким образом, в ряде случаев при подтвержденных семейных КМ ни у пробанда, ни у родственников не удается выявить мутации в генах КM. Такие наблюдения позволяют предположить существование других генов, мутация в которых приводит к возможности образования КМ [21]. В нашей серии выявлены 2 семьи, в которых не обнаружено мутаций в генах КМ. В одном случае имеет место верифицированная семейная форма, в другом — условно семейная. В настоящее время продолжается работа по анализу этих семей.

Настоящее исследование — первая в России работа по изучению генетических изменений у больных с различными формами КМ ЦНС.

Полученные данные показали, что при клинически доказанных наследственных КМ различные мутации генов КМ выявляются в 91,7% случаев. Частота мутаций в трех генах КМ в российской популяции соответствует таковой в популяциях стран Европы и Америки. К серьезным изменениям в фенотипе могут приводить как большие делеции, так и значимые однонуклеотидные мутации, приводящие к нарушению структуры и функции белка.

Полученные данные позволяют проводить медико-генетическое консультирование семей с наследственными КМ ЦНС.

Дальнейшее изучение типов мутаций, а также мутаций вне известных генов КМ и проведение клинико-генетических сопоставлений позволят создавать диагностические тест-системы, прогнозировать течение заболевания у конкретного индивида и в последующих поколениях, и, возможно, будет способствовать разработке менее дорогих методов генетического анализа при данной патологии.

Работа частично выполнена в рамках тематического плана НИЦ «Курчатовский институт» и при поддержке гранта Президиума РАН по программе фундаментальных исследований «Фундаментальные исследования для разработки биомедицинских технологий», «Создание тест-системы для идентификации молекулярно-генетических маркеров кавернозных мальформаций ЦНС у больных с наследственной формой патологии», 2014 г.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.