Васильева Е.Ф.

Научный центр психического здоровья РАМН, Москва

Брусов О.С.

ФГБНУ «Научный центр психического здоровья», Москва, Россия

Каледа В.Г.

Научный центр психического здоровья РАМН, Москва

Бархатова А.Н.

Научный центр психического здоровья РАМН, Москва

Петракова Л.Н.

ФГБУ "Научный центр психического здоровья РАМН", Москва

Шилов Ю.Е.

ФГБУ "Научный центр психического здоровья РАМН", Москва

Коляскина Г.И.

Научный центр психического здоровья РАМН, Москва

Цитотоксическая активность лимфоцитов натуральных киллеров у больных с первым приступом эндогенного психоза (сравнение двух способов тестирования)

Журнал: Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2013;113(6): 45-49

Просмотров : 27

Загрузок :

Как цитировать

Васильева Е. Ф., Брусов О. С., Каледа В. Г., Бархатова А. Н., Петракова Л. Н., Шилов Ю. Е., Коляскина Г. И. Цитотоксическая активность лимфоцитов натуральных киллеров у больных с первым приступом эндогенного психоза (сравнение двух способов тестирования). Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2013;113(6):45-49.

Авторы:

Васильева Е.Ф.

Научный центр психического здоровья РАМН, Москва

Все авторы (7)

В литературе имеется много сообщений о снижении цитотоксической активности (ЦА) лимфоцитов натуральных киллеров (НК) у больных шизофренией. В предыдущих работах авторов статьи [1, 3, 4] также было выявлено снижение уровня ЦА НК при этом заболевании, в частности у больных хронической шизофренией в период обострения. Однако пока остается неясным, на каком этапе развития болезни появляются указанные изменения в иммунной системе больных и какую роль они играют в патогенезе заболевания.

Известно, что активность лимфоцитов НК - один из основных факторов врожденного иммунитета. НК-клетки относят к системе естественной цитотоксичности, которая является первой линией защиты организма человека и животных от разного рода чужеродных воздействий [1, 12], в том числе вирусов и опухолевых клеток. Впервые эти клетки были обнаружены в 1976 г. в лимфоидной ткани крыс и мышей. Они проявляли цитолитическую активность против широкого спектра опухолевых клеток-мишеней. Эта активность выявлялась без какой либо направленной иммунизации животных, поэтому была названа природной, или естественной, киллерной активностью, а обладающие ею клетки - природными, или натуральными, киллерами.

Существует несколько методов оценки ЦА НК-лимфоцитов, в частности колориметрические [7, 8], которые считаются не очень точными [10]. Более современными в этом отношении являются радиометрические методы, например оценка ЦА НК по [3Н]-уридину [5, 6] и другим изотопам [15]. В настоящее время распространен радиоактивный метод оценки ЦА НК, основанный на определении количества [3Н]-РНК в клетках-мишенях, оставшихся недеградированными после их контакта с лимфоцитами НК [6]. В этом методе в качестве клеток-мишеней обычно используют адаптированные к лимфоцитам НК клетки перевиваемой культуры эритролейкемической лимфобластоидной линии человека - К-562, меченные по [3Н]-уридину. Поскольку в результате цитотоксического действия лимфоцитов НК часть клеток-мишеней разрушается на отдельные фрагменты (деградирует) и включившийся в них [3Н]-уридин выходит в окружающую среду, то измерение уровня радиоактивности в оставшихся интактными клетках-мишенях позволяет судить о величине ЦА НК-лимфоцитов. Недостатки таких способов оценки ЦА НК - трудоемкость (использование большого количества приборов и реагентов), продолжительность (2-3 дня) и опасность для здоровья исполнителя (использование радиоактивных веществ и сцинтилляционной жидкости).

Взяв за основу тот же принцип цитотоксического действия НК- лимфоцитов на клетки-мишени К-562, мы применили более простой и безопасный вариант оценки ЦА НК с использованием многофункционального счетчика-анализатора клеток Multisizer MS-4. В этом случае производится подсчет количества оставшихся недеградированными после контакта с лимфоцитами НК клеток-мишеней К-562 и определение их суммарного объема. Поскольку изложенный выше и предлагаемый нами варианты определения ЦА НК основаны на оценке оставшихся недеградированными клеток-мишеней К-562 (в первом случае - по суммарному уровню радиоактивности мишеней, во втором - по количеству мишеней и их суммарному объему), мы имели основание предполагать, что результаты, полученные с помощью предлагаемого способа оценки, должны быть аналогичны таковым, полученным при оценке ЦА НК радиоактивным способом.

Цель настоящего исследования состояла в изучении состояния иммунной системы у больных шизофренией с первым приступом эндогенного психоза с использованием двух указанных методов определения ЦА НК.

Материал и методы

Обследовали 16 больных (мужчины) шизофренией с первым приступом эндогенного психоза в возрасте от 18 до 25 лет (средний - 20,8±0,4 года). Все пациенты находились на лечении в клиническом отделении (руководитель - проф. М.Я. Цуцульковская) Отдела по изучению эндогенных психических расстройств и аффективных состояний (руководитель - академик РАМН А.С. Тиганов) Научного центра психического здоровья РАМН.

В контрольную группу входили 8 здоровых.

Иммунологические исследования проводили в лаборатории клинической нейроиммунологии (руководитель - проф. Г.И. Коляскина) и лаборатории клинической биохимии (руководитель - О.С. Брусов) указанного центра.

Радиоактивный метод определения ЦА НК. Базисной моделью для постановки цитотоксического теста служил метод, предложенный М.П. Рыковой и соавт. [6], в нашей модификации [1], основанный на измерении количества 3Н-РНК, оставшейся в меченных 3Н-уридином клетках-мишенях К-562, недеградированных после их инкубации с НК-клетками.

Мишени К-562 (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского, РАМН) поддерживали in vitro в среде RPMI-1640 (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН) c добавлением 10% фетальной сыворотки (Defined Fetal Bovine Serum фирмы «Hyclone», USA) и 10% глютамина. Непосредственно перед постановкой цитотоксического теста к 3 мл взвеси клеток-мишеней в центрифужной пробирке добавляли 0,3 мл раствора 3Н-уридина (3 мкКи/мл; удельная радиоактивность 24 Ки/мМ, Институт молекулярной генетики РАН). Клетки помещали в термостат при 37 °С на 1 ч. По прошествии этого времени клетки 3 раза отмывали от не включившейся в них радиоактивной метки большими объемами среды 199 с помощью центрифугирования при 1100-1200 об/мин и 4 °С в течение 10 мин (по времени эта процедура занимает еще 1 ч); затем разводили до концентрации 105/мл. Для деградации не включившегося в клетки-мишени К-562 3Н-уридина к ним добавляли панкреатическую рибонуклеазу А (РНКаза, РЕАХИМ НПО «Биолар»), которая разрезала 3'-конец неспаренных цитидиловых и уридиловых нуклеотидов, катализируя их деградацию.

Мононуклеарные клетки (МНК) - это моноциты и общий пул лимфоцитов в крови человека, 10-15% от которого составляют лимфоциты НК. МНК выделяли общепринятым способом [9] из периферической крови больных в градиенте плотности фиколл-верографина (уд. пл. 1,077), разводили их средой 199 (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН) до концентрации 4·106/мл.

Постановку цитотоксического теста осуществляли в специальных 96-луночных круглодонных полистироловых планшетах (объем лунки - 0,25 мл, завод «Медполимер», Санкт-Петербург); в лунки с опытными пробами вносили 0,05 мл среды 199, 0,05 мл полной среды 199, обогащенной 10% эмбриональной телячьей сывороткой и 10% раствором глютамина, затем добавляли в соотношении 20:1 0,05 мл взвеси МНК больных и 0,1 мл обработанных 3Н-уридином и РНКазой клеток-мишеней К-562.

В лунки с контрольными пробами вместо МГК больных добавляли 0,05 мл среды 199. Каждую опытную и контрольную пробы ставили в двух или трех параллельных лунках. Планшеты инкубировали в термостате в течение 16-18 ч при температуре 37 °С и 5% СО2. После инкубации клетки переносили с помощью многоканального харвестера («Сombi cell Harvester Skatron», England) - прибора для сбора клеток методом фильтрации на фильтрах и вакуумного насоса (фирма «Millipore») из планшетов на специальные стекловолокнистые фильтры для харвестера («Skatron, Filter Mat for 12 well Cell Harwesters», England) и отмывали натрий-фосфатным буфером от невключившейся метки. Фильтры высушивали на воздухе в течение 18 ч, после чего помещали в сцинтилляционные флаконы («Beckman», USA). В вытяжном шкафу c помощью диспенсера («Brinkmann», Germany) наливали в каждый флакон по 3 мл сцинтилляционной жидкости ЖС-8 (Институт «Монокристалл», Украина) и оставляли еще на 18 ч для выхода β-частиц. После этого сцинтилляционные флаконы помещали в жидкостной сцинтилляционный счетчик β-частиц (MicroBeta trilux, «PerkinElmer Inc.») и подсчитывали количество радиоактивных импульсов в каждом флаконе.

В формулу для расчета цитотоксической активности лимфоцитов НК вносили значения радиоактивности, полученные во флаконах с опытными и контрольными образцами, и результат выражали в виде индекса цитотоксичности (ИЦ) в процентах, который рассчитывали по формуле:

Метод определения ЦА НК с помощью многофункционального счетчика и анализатора клеток. Оценку ЦА НК новым способом по количеству и объему недеградированных после инкубации с НК клеток-мишеней К-562 проводили на многофункциональном счетчике-анализаторе клеток типа Multisizer MS-4 («Beckman Coulter», USA). Прибор позволяет анализировать количество и размер частиц, их суммарный объем, производить анализ распределения частиц по размерам. Принцип его работы заключается в прохождении суспендированных в электролите клеток через апертуру малого диаметра, расположенную между двумя электродами (принцип Культера). Когда клетки проходят через апертуру - «чувствительную зону», каждая из них вытесняет определенное количество электролита, вызывая возрастание сопротивления. В результате происходит небольшое изменение величины электрического тока в усилителе, который преобразует колебания силы тока в импульсы напряжения, находящиеся в прямой зависимости от диаметра прошедшей через апертуру клетки. Кроме того, прибор устроен так, что может вычислять и суммарный объем прошедших через апертуру клеток. При этом на экране монитора можно визуально выделить любой размерный диапазон, соответствующий диаметру определенных клеток. В нашем варианте прибор настраивали на выявление клеток, диаметр которых находился в диапазоне от 15 до 40 мкм. Это соответствовало диаметру клеток-мишеней К-562, который превышает диаметр (не достигает 15 мкм) самых крупных клеток крови - моноцитов. С помощью этого прибора уровень ЦА НК подсчитывали по количеству не деградированных после контакта с лимфоцитами НК клеток-мишеней К-562, а также их суммарному объему.

Выделение МНК из крови больных и постановку цитотоксического теста проводили согласно описанной выше методике с той разницей, что клетки-мишени К-562 перед инкубацией с МНК не обрабатывали 3Н-уридином и РНКазой. После культивирования содержимое параллелей каждой пробы с помощью автоматической пипетки переносили из планшета для культивирования в пластиковые пробирки типа «Ependorf», тщательно перемешивали; из каждой пробирки отбирали 100 мкл клеточной взвеси и разводили в специальных акуветах в 10 мл жидкости для разведения (прилагаются к прибору). Акуветы помещали в анализатор, в котором подсчитывали клетки (результаты подсчета выводились на экран монитора). В акуветах с контрольными и опытными пробами подсчитывали число клеток и их суммарный объем. В опытных пробах количество клеток К-562 и их суммарный объем существенно ниже, чем в контрольных, что полностью подтверждает возможность оценки ЦА НК по количеству мишеней К-562, оставшихся недеградированными после контакта с лимфоцитами НК, и их суммарному объему.

Активность НК клеток рассчитывали по приведенной выше формуле и выражали также в виде ИЦ, только в числитель и знаменатель вместо числа импульсов, измеряемых в интактных клетках-мишенях, вносили их число или объем:

Для большей доказательности сравнимости результатов, получаемых двумя способами оценки ЦА НК цитотоксический тест ставили в параллельных пробах в трех вариантах: 1) использование исходной взвеси МНК, содержащей все мононуклеарные клетки, включая моноциты; 2) добавление непосредственно перед постановкой опытов в инкубационную смесь (взвесь МНК+клетки-мишени) серотонина, который, как известно из литературы, оказывает влияние на НК-активность [14]. В нашей работе он использовался в концентрациях 10-6 М (вариант 2а), 10-7 М (вариант 2б) и 10-9 М (вариант 2в), 3) использование взвеси МНК без моноцитов, которые удаляли методом адгезии [2], поскольку известно, что моноциты также могут влиять на активность НК-клеток [11, 13].

Для обработки результатов исследования использовали программу Statistica, версия 6 («Statsoft Inc.», США). При сравнении различных групп использовали критерий U Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводили с использованием r-критерия Спирмена.

Результаты и обсуждение

В общей группе больных шизофренией с первым приступом эндогенного психоза (табл. 1) уровень ЦА НК, определяемый радиоактивным способом в культуре клеток с моноцитами (вариант 1), был достоверно снижен по сравнению с контролем (p<0,05); это свидетельствует, что снижение уровня ЦА НК у больных шизофренией происходит уже к моменту первой манифестации болезни.

Из табл. 1 видно, что при одновременном определении

ЦА НК у этих же больных в культуре клеток с моноцитами (вариант 1) на анализаторе с помощью подсчета количества интактных мишеней и их суммарного объема не было выявлено статистически значимых различий между средними значениями показателя, полученными двумя способами оценки. Добавление в культуры клеток с моноцитами серотонина в концентрациях 10-6 и 10-7 М (варианты 2а и 2б) не изменяло уровень ЦА НК, серотонин в концентрации 10-9 М (вариант 2в) достоверно его повышал (p<0,05), тогда как удаление моноцитов из взвеси МНК (вариант 3) приводило к достоверно выраженному снижению (p<0,05). Отмеченные изменения уровня ЦА НК выявлялись также при обоих способах его оценки и статистически достоверно не отличались друг от друга (см. табл. 1).

Подтверждением полученных результатов служило выявление в общей группе больных ряда статистически значимых (p<0,05) положительных корреляций в культуре с моноцитами (вариант 1): между уровнем ЦА НК, определяемым по радиоактивности в недеградированных мишенях К-562, с одной стороны, и количеством (r=0,6; p<0,05), а также суммарным объемом этих клеток (r=0,56; p<0,05), определяемым с помощью анализатора, - с другой. При этом между количеством оставшихся мишеней и их суммарным объемом также выявлялся высокий уровень положительной корреляционной связи (r=0,95; p<0,001). В культуре без моноцитов (вариант 3) были получены аналогичные результаты: положительная корреляция между уровнем ЦА НК, определяемым по 3Н-уридину в недеградированных клетках-мишенях, и их количеством (r=0,95; p<0,001), а также суммарным объемом (r=0,97; p<0,001), определяемым с помощью анализатора. Положительные корреляции между значениями ЦА НК, полученными при оценке с использованием 3Н-уридина и подсчете на анализаторе количества (r=0,81; p<0,001), а также суммарного объема оставшихся в культуре мишеней (r=0,81; p<0,001), выявлялись также при добавлении в культуры клеток с моноцитами серотонина во всех исследуемых концентрациях (вариант 2).

При индивидуальном анализе в общей группе больных были выявлены значительные колебания показателей значений ЦА НК (ИЦ определялся от 10,1 до 65,9%). Поэтому всех пациентов для получения более однородных групп дополнительно распределили дихотомически по значению медианы в две равные подгруппы: с высоким (на уровне контроля) и низким (достоверно сниженный относительно контроля, p<0,05) уровнем ЦА НК. При сравнении результатов, полученных двумя способами оценки ЦА НК в каждой из подгрупп (табл. 2), было выявлено сходство результатов, аналогичное таковому в общей группе больных.

Таким образом, способ определения ЦА НК по количеству и объему недеградированных после контакта с лимфоцитами НК клеток-мишеней К-562 на многофункциональном счетчике-анализаторе клеток типа Multisizer MS-4 позволяет получить результаты, аналогичные определяемым с использованием метода оценки ЦА НК по радиоактивности [2]. При этом простота оценки ЦА НК предлагаемым способом и меньшая его стоимость (используется меньшее количество приборов и реагентов), безопасность для исследователя (исключается использование радиоактивных компонентов и сцинтилляционной жидкости) и существенное снижение затрат времени (10-15 мин вместо 2-3 дней) свидетельствуют о возможности его использования в повседневной научной и клинической практике.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail