Реактивные изменения астроцитов миндалевидного тела головного мозга в ответ на разный уровень половых гормонов при абсансной эпилепсии

Эпилепсия относится к тяжелым и часто встречающимся заболеваниям ЦНС и характеризуется развитием повторяющихся и обычно спонтанных судорог, возникающих в результате чрезмерной, аномальной и гиперсинхронной активности нейронов [1—8]. Согласно последним данным [9, 10], эпилепсией в мире страдают более 50 млн больных, в основном дети и пожилые. Распространенность заболевания варьирует в разных регионах: от 0,4—1% в развитых странах до 1,03 (в городах) и 1,54% (в сельской местности) в развивающихся [11].

В оценке патоморфологических изменений головного мозга больных эпилепсией значительное внимание уделяется гибели нейронов и развивающемуся вслед за этим (или параллельно) клеточному глиозу серого вещества. Глиоз, по мнению М.Г. Жвания и соавт. [12], является важнейшим морфологическим коррелятом эпилепсии, представленным в основном пролиферацией и гипертрофией астроцитов и реакцией микроглии (макрофагов), и характерен для эпилептогенных зон со сниженным количеством нейронов. Наличие глиоза показано большинством исследователей [13—16] на секционном, операционном и экспериментальном материале. Глиоз сопровождается экспрессией провоспалительных цитокинов, которые способны минимизировать повреждения нейронов [17, 18].

Известно [19], что взаимодействия между нейронами и нейроглией, в первую очередь астроцитарного ряда, играют ключевую роль в ходе развития головного мозга, в том числе взрослого организма. Эти влияния могут быть обусловлены активацией роста аксонов, которая была выявлена in vitro и in vivo, что связано со способностью нейроглии к выделению разных факторов роста, к части из которых чувствительны нейроны и нейробласты. Данное обстоятельство позволяет предполагать важную роль астроцитов как в нейрогенезе, так и в процессах регенерации во взрослом состоянии, особенно при повреждениях ЦНС [20, 21].

Одни авторы [22] считают глиоз вторичным процессом (аналогичным рубцеванию), который развивается в ответ на поражение и гибель нейронов. Другие [23—25] полагают, что он может замедлить проведение нервного импульса и даже привести к прекращению эпилептического приступа.

Некоторые исследователи [26] предполагают, что реактивные астроциты в эпилептической ткани могут вызывать и выступать против развития приступа через множество определенных механизмов.

Таким образом, участие астроцитов при нарушениях функций ЦНС, в частности в развитии и поддержании судорожной активности нейронов, привлекает внимание исследователей [27—34].

Обязательным компонентом промежуточных филаментов цитоскелета астроцитов является глиальный фибриллярный кислый белок (Glial Fibrillar Acidic Protein — GFAP), который рассматривается как гистоспецифический маркер астроцитарных повреждений и используется в качестве чувствительного индикатора нейротоксичности [35]. В свою очередь, глиальные астроциты являются неотъемлемой частью сложной динамической системы — гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Они обладают способностью контролировать проницаемость ГЭБ [36]. Кроме того, астроциты выполняют функцию клеток-сателлитов по отношению к нейронам. Следовательно, нарушение целостности мембран астроцитарных клеток, регистрируемое по наличию повышенных концентраций нейроспецифического GFAP в сыворотке крови, свидетельствует, с одной стороны, о нарушении целостности ГЭБ, а с другой — является предиктором гибели нейронов [37].

Вместе с тем в последние годы проводятся исследования [38—40] по изучению содержания GFAP в астроцитах при разных уровнях половых гормонов. Половые гормоны регулируют ряд функций головного мозга, включая обучение, память, нейропротекцию и проявление сексуального и материнского поведения. Эти функции включают в себя изменения в структуре и организации нейронов и глиальных клеток, требующих участия цитоскелетных белков, экспрессия и активность которых регулируются эстрадиолом и прогестероном. Было обнаружено [41, 42], что на протяжении всей беременности и начала лактации происходят изменения экспрессии GFAP в ткани головного мозга крыс и сделано заключение об участии GFAP в нейропластичности нервной ткани.

Миндалевидное тело (МТ) головного мозга обладает низким порогом чувствительности к судорожной активности, при которой имеет место специфическая форма электроэнцефалограммы: на медленные волны накладываются вспышки высокоамплитудной активности [43, 44].

Имея связи с основной и добавочной обонятельными луковицами, с одной стороны, и гипоталамическими областями, с другой, МТ принимает непосредственное участие в процессах хеморецепции и обработки обонятельной информации, в регуляции секреции гонадотропинов, полового созревания организма и полового поведения. В составе кортикомедиальной группы структур МТ выделяют кортикальное ядро, которое делится на переднее кортикальное ядро (СОа), периамигдалярную кору и заднее кортикальное ядро. Считается, что СОа МТ головного мозга является элементом нейроэндокринной системы [45]. Таким образом, исследование влияния уровня половых стероидов на экспрессию GFAP в астроцитах при абсансной эпилепсии представляет научный и практический интерес.

Цель настоящего исследования — изучение изменений морфологических и морфометрических параметров иммунопозитивных астроцитов МТ головного мозга при абсансной форме эпилепсии в зависимости от гормонального фона.

Работа выполнена на половозрелых самках крыс линии WAG/Rij c генетически обусловленными абсансами, разделенных на три группы по 6 животных в каждой: контрольная группа (без оперативного вмешательства), группа овариоэктомированных крыс (без последующей терапии), группа овариоэктомированных животных с последующей заместительной гормональной терапией. Двустороннее удаление яичников (овариоэктомия) производили по общепринятой методике [46]. Через 1 мес овариоэктомированным самкам соответствующей группы проводили заместительную терапию: вводили 17β-эстрадиол (10 мкг/100 г, растворяли в стерильном персиковом масле) 1 раз в сутки в течение 2 сут, на 3-и сутки — 17β-эстрадиол в комбинации с прогестероном (5 мг/100 г). Кусочки М.Т. головного мозга фиксировались в 10% забуференном формалине, далее после обезвоживания заливались в парафиновые блоки по общепринятой методике. Следующим этапом являлось приготовление срезов толщиной 4 мкм на микротоме Leica RM 2145 («Leica Biosystems», Германия). Срезы окрашивали с помощью иммуногистостейнера BOND («Leica Microsystems», Германия). Иммуногистохимическим методом выявляли содержание маркера глиальных клеток — высокоспецифичного GFAP на парафиновых срезах согласно протоколу производителя, используя мышиные моноклональные антитела (Santa Cruz Biotechnology) и универсальную систему вторичной детекции для визуализации (Novocastra). Исследовали СОа МТ головного мозга всех опытных животных: контрольной группы, группы после овариоэктомии и группы после заместительной гормональной терапии. После проведения иммуногистохимической реакции ядра клеток докрашивали гематоксилином и заключали в бальзам. Оценку морфологических изменений астроцитов проводили с помощью микроскопа Микмед-5 («ЛОМО», Россия) и камеры Levenhuk C510 («Levenhuk«, США) при увеличении 630. С помощью специализированного программного обеспечения PhotoM и ToupView осуществляли измерение площади и подсчет клеток глии в поле зрения 204,8×153,6 мкм².

Для математико-статистической обработки данных использовали пакет прикладных программ Statistica v.10.0 («StatSoft Inc.», США). Для оценки различий в независимых группах применяли непараметрический U-критерий Манна—Уитни. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

При иммуногистохимическом исследовании СОа МТ головного мозга крыс была установлена положительная реакция на GFAP во всех исследуемых образцах, однако экспрессия GFAP в них отличалась: были отмечены проявления как регрессивных, так и прогрессивно-пролиферативных изменений. Метка на GFAP маркировала тела и отростки множества астроцитов.

Все астроциты в СОа МТ головного мозга самок контрольной группы имели относительно правильную звездчатую форму (рис. 1).

При изучении иммуногистохимически окрашенного препарата СОа в образцах ткани крыс после овариоэктомии (без терапии) наблюдали яркую равномерную реакцию антител на GFAP и определенный полиморфизм астроцитов. Тела астроцитов были увеличены в размерах за счет цитоплазмы, экспрессирующей GFAP, ядра их также были крупнее и располагались преимущественно слегка эксцентрично. На препаратах визуализировалось резкое увеличение количества GFAP-позитивных клеток и их площади в сравнении с контрольной группой (рис. 2).

Следующим этапом исследования была оценка размеров и численной плотности GFAP-позитивных астроцитов, определяющая их реактивность. Плотность распределения GFAP-позитивных астроцитов в СОа статистически значимо возрастала с 18,20±2,87 до 34,55±3,03 (р<0,05) по сравнению с образцами контрольной группы. У животных группы после овариоэктомии была обнаружена высокая экспрессия GFAP как в телах, так и в отростках астроцитов, происходила гипертрофия тел, сопровождающаяся увеличением площади астроцитов с 164±3,29 до 188,85± 4,97 мкм² (р<0,05).

В группе овариоэктомированных крыс после заместительной гормональной терапии 17β-эстрадиолом и прогестероном наблюдались уменьшение диффузного разрастания и фрагментация отростков, очертания астроцитов четко визуализировались, имели звездчатую форму и от 5 до 7 основных отростков, ветвящихся и идущих радиально. Все они имели средние размеры вследствие снижения экспрессии GFAP (см. рис. 3, б). Площадь клеток стала меньше по сравнению с группой после овариоэктомии (без терапии) (188,85±4,97 и 173,54±5,48 мкм² соответственно, р<0,05), уменьшилось и количество астроцитов (32,58±3,63).

Таким образом, по факту особенностей реактивных изменений астроцитов после овариоэктомии выявили, что их морфологические параметры также меняются: наблюдались усиление экспрессии GFAP, гипертрофия пролиферации их тел, вариабельность форм и размеров клеток и деформаций отростков. Однако звездчатая форма была сохранена. Заместительная гормональная терапия нивелирует вышеуказанные нарушения в астроцитах.

Иммуногистохимическое исследование показало, что астроциты СОа МТ головного мозга крыс специфическим образом реагируют на дефицит половых гормонов изменениями степени экспрессии GFAP, количественных и морфологических характеристик в виде гипертрофии и пролиферации тел и диффузного разрастания и разволокнения отростков астроцитов, а также повышением GFAP-позитивных клеток.

Вместе с тем полученные результаты подтверждают данные [47], выявленные при изучении нейроно-глиального соотношения, согласно которым в СОа МТ головного мозга у самок крыс после овариоэктомии обнаруживается большее количество глиальных клеток.

После овариоэктомии наблюдалась реакция астроцитов, которая выражалась гипертрофическими изменениями тел и пространственной реорганизацией их отростков, что согласуется с результатами [48], полученными при исследовании морфологического состояния астроцитов головного мозга при гипоксическом и травматическом воздействиях.

Астроциты являются важной мишенью для эстрогенов в ЦНС, поскольку экспрессируют рецепторы ERrα и Erβ, локализованные на плазматической мембране и внутриклеточно [49—50]. Эстрогены регулируют секрецию провоспалительных цитокинов астроцитами, которые также участвуют в регуляции эстрогенами синаптической пластичности и восстановлении после мозговых повреждений [51]. Эстроген через астроциты оказывает нейропротективное действие, влияя на функцию памяти и другие когнитивные функции [52].

Результаты недавних исследований [53] показали, что иммунореактивность на GFAP в медиальной амигдале является самой высокой во время проэструса и увеличивается при введении эстрадиола или эстрадиола в совокупности с прогестероном овариоэктомированным самкам. R. Johnson и соавт. [38] в своей работе указали на то, что количество и структурно-функциональная организация астроцитов медиальной амигдалы зависят от уровня половых гормонов.

H. Sun и соавт. [54] исследовали действие пилокарпина (проконвульсанта) на электроэнцефалографические показатели МТ головного мозга и гиппокампа с последующим определением содержания GFAP в астроцитах. Авторы выявили, что пилокарпин положительно влияет на течение эпилепсии, а иммунопозитивные астроциты играют важную роль в этом процессе. Реактивные астроциты способствуют повышенной эпилептической восприимчивости, вызванной подпороговой дозой пилокарпина [55]. Лечение эпилепсии возможно было бы провести путем ингибирования астроцитов [54]. Соответствующее подавление астроцитарной функции, как предполагают исследователи [55], может быть потенциальным превентивным подходом против эпилептогенеза.

В настоящем исследовании на препаратах группы крыс после заместительной гормональной терапии определялась умеренно выраженная позитивная реакция клеток на GFAP. Морфологические изменения глиальных клеток проявлялись в виде уменьшения размеров их тел, отростки становились гладкими без диффузных разрастаний и выбуханий, что, вероятно, связано с нейропротективными функциями эстрадиола [56, 57]. Он стимулирует транскрипцию и индуцирует экспрессию множества генов, продукты которых обеспечивают цитоархитектонику клетки [58]. Эстрадиол контролирует синтез нейропрогестерона — регулятора нейрогенеза. Синтез этого белка происходит преимущественно в астроцитах и требует взаимодействия мембранно-связанного рецептора эстрадиола (РЭα) с метаболотропным глутаматным рецептором 1α [59].

Таким образом, астроцитарная глия активно реагирует на гормональную дисфункцию степенью выраженности астроцитарного глиоза. Функциональные и морфологические изменения астроцитов могут иметь двойственную природу, основанную на основных патофизиологических характеристиках. С одной стороны, реактивный астроглиоз может возникать как защитно-компенсаторный механизм после повреждения нервной системы и приводить к снижению возбудимости [60]. С другой стороны, некоторые компоненты реактивного астроглиоза, такие как подавление экспрессии аквапорина, могут иметь прямое эпилептогенное действие [61]. Считается, что чем интенсивнее пролиферация астроцитов, тем мягче протекает заболевание, и, наоборот, при полном или почти полном отсутствии реакции со стороны астроцитарной глии болезнь приобретает особо тяжелое течение [62]. Характер уровня экспрессии GFAP после заместительной гормональной терапии свидетельствует о хороших адаптивных способностях нервной ткани при абсансной эпилепсии. Позитивный эффект эстрадиола, возможно, связан с тем, что дифференцировка астроцитов в процессе развития головного мозга происходит под влиянием гормонов, в частности эстрадиола. В настоящем исследовании, вероятно, астроцитарный глиоз представлял собой не патологическую, а приспособительную (защитную) реакцию. Наблюдаемые изменения морфологических и морфометрических параметров астроцитов подчеркивают важность этих клеток для понимания изменений и механизмов эпилептических расстройств.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail:indira.ildarova@mail.ru