В современной мировой практике для идентификации локусов, контролирующих сложные признаки, широко применяется полногеномное сканирование [1, 2]. Данный метод представляет собой тотальный анализ генома здоровых и больных лиц, позволяющий агностически выявить точечные мутации, называемые однонуклеотидными полиморфизмами (ОНП) и потенциально влияющие на экспрессию генов и функцию белков [1]. Преимущество метода заключается в возможности выявления ранее неизвестных генов, определяющих фенотип, связанный с заболеванием, что было невозможно при кандидатном подходе [1, 3]. Частота ошибок при применении новых технологий генотипирования составляет менее 0,5% [1].

Однако необходимо учитывать стратификацию популяции, так как однонуклеотидные полиморфизмы и связанные с ними признаки чаще встречаются среди лиц одинакового происхождения. Зарубежными учеными в независимых исследованиях при церебральном инсульте еще не было выявлено ни одного отдельного локуса, оказывающего статистически значимое влияние в двух и более изолированных популяциях [1], что еще раз подчеркивает сложность взаимодействия метаболических путей, вовлеченных в патогенез инсульта.

В 2010 г. были опубликованы результаты нескольких масштабных исследований по полногеномному сканированию у больных с церебральным инсультом. Выявлено, что у лиц из китайской популяции хань минорный аллель C ОНП rs11206510 на хромосоме 1p32 ассоциирован с повышенным уровнем липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и значимым риском развития церебрального инсульта. Причем у мужчин моложе 55 лет и женщин моложе 50 лет был выявлен более высокий риск, чем в общей выборке [4].

Под эгидой International Stroke Genetics Consortium изучилось влияние на риск развития острого ишемического инсульта ОНП rs1906591 и rs10033464 на хромосоме 4q25, ассоциация которых с фибрилляцией предсердий была обнаружена в предыдущих исследованиях [5, 6]. Результаты оказались неожиданными. Подтвердилась ассоциация rs1906591 с фибрилляцией предсердий, а также с ишемическим инсультом в целом и кардиоэмболическим патогенетическим вариантом в частности. Значимой ассоциации rs10033464 с ишемическим инсультом выявлено не было, а связь с фибрилляцией предсердий оказалась незначительной, что противоречит ранее полученным данным [7].

Ассоциация ОНП rs12425791 и rs11833579 на хромосоме 12p13 с церебральным инсультом у лиц европейского происхождения, о которой писалось несколькими годами ранее, не была подтверждена результатами метаанализа, проведенного International Stroke Genetics Consortium и Wellcome Trust Case-Control Consortium 2. Предполагается, что причиной этого является ложноположительный результат предыдущего метаанализа [8].

На кафедре фундаментальной и клинической неврологии Российского национального исследовательского медицинского университета (РНИМУ) им. Н.И. Пирогова совместно с отделом молекулярных основ генетики человека Института молекулярной генетики РАН впервые в Российской Федерации проводится полногеномное сканирование для определения индивидуального генетического риска развития церебрального инсульта у славян из московской популяции. Исследование проводится ретроспективно по типу «случай-контроль».

Цель настоящего исследования - выявить и изучить ОНП, ассоциированные с инсультом, у лиц славянской национальности из московской популяции. Конечным продуктом работы в целом должна стать диагностическая тест-система для определения индивидуальной предрасположенности к инсульту у лиц славянской национальности, позволяющая проводить скрининг на наличие распространенных маркеров в рамках одного эксперимента [1]. Создание такой тест-системы облегчит и ускорит задачу выявления лиц с высоким риском развития церебрального инсульта и поможет оптимизировать объем лечебно-профилактических мероприятий в каждом конкретном случае.

В основу работы положены результаты исследования 950 больных, 473 (49,8%) мужчин и 477 (50,2%) женщин, славян из московской популяции, в остром периоде церебрального инсульта, поступивших в неврологическую клинику кафедры фундаментальной и клинической неврологии РНИМУ. Средний возраст включенных в исследование больных составил 67,9±11,6 года. Контрольную группу составили 715 лиц славянской национальности из московской, тверской и смоленской областей.

Диагноз церебрального инсульта устанавливали на основании клинической картины и результатов лабораторно-инструментальных исследований. Патогенетический вариант инсульта определялся в соответствии с критериями TOAST [9].

Для объективизации тяжести состояния и оценки выраженности неврологического дефицита использовали шкалу инсульта Национального института здоровья США (NIHSS) [10]. Состояние больных оценивали при поступлении, на 3, 7, 14 и 21-е сутки инсульта. Степень функционального восстановления пациентов определяли с использованием модифицированной шкалы Рэнкина [11] на 1-й и 21-й дни развития заболевания и индекса повседневной активности Бартел [12] на 21-й день инсульта.

Всем пациентам при поступлении в стационар, а также на 5-е сутки заболевания выполняли компьютерную томографию (КТ) головного мозга. Ультразвуковое исследование брахиоцефальных артерий и сердца проводили на 1-2-е сутки от развития инсульта. Применяли дуплексное сканирование позвоночных, общих, внутренних и наружных сонных артерий, а также допплерографию интра- и экстракраниальных отделов церебральных артерий. Всем больным выполняли эхокардиографическое исследование.

У всех пациентов с церебральным инсультом фиксировалось наличие основных факторов риска сосудистой патологии головного мозга: артериальной гипертензии, мерцательной аритмии, ишемической болезни сердца, перенесенных инфарктов миокарда, стенозов брахиоцефальных артерий, сахарного диабета, курения, ожирения.

Молекулярно-генетические исследования проводились на базе Института молекулярной генетики РАН. Были использованы препараты ДНК, полученные из 3 мл венозной крови. ДНК больных с ишемическим инсультом и лиц из контрольной выборки русской этнической группы выделяли при помощи AxyPrepTM Blood Genomic DNA Midiprep kit («Axygen Biosciences», США). Полиморфные аллели исследуемых генов были исследованы c использованием технологии ДНК-микрочипов. Для этого были использованы микрочипы HUMANCYTOSNP12 v.2 ("Illumina", США), позволяющие одновременно тестировать 301 000 однонуклеотидных полиморфных сайтов. Первичные данные были обработаны в пакете программ Genome Studio для определения генотипов по каждому полиморфному сайту.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием программы HELIX STUDIO (www.goldenhelix.com/) для проведения полногеномного ассоциативного анализа (GWAS) и программы GraphPad InStat (www.graphpad.com/), с помощью которой проверяли соответствие наблюдаемого распределения частот генотипов формуле Харди-Вайнберга и величину относительного риска (ОР). Достоверность различий частот аллелей и генотипов полиморфных локусов в сравниваемых группах определяли с помощью критерия χ². Сравнение частот генотипов проводили с использованием таблиц сопряжения 2×3, а частот аллелей и объединенных генотипов с использованием таблиц сопряжения 2×2. Достоверным считали уровень значимости p<0,05.

Из 950 пациентов с церебральным инсультом ишемический инсульт был диагностирован в 780 (82,1%), геморрагический - в 170 (17,9%) случаях. Впервые развившийся церебральный инсульт был у 729 (76,7%) пациентов, повторный инсульт - у 221 (23,3%). У пациентов с геморрагическим инсультом в 146 (85,9%) случаях имели место внутримозговые гематомы, в 24 (14,1%) - спонтанное субарахноидальное кровоизлияние. При анализе распределения патогенетических вариантов у пациентов с ишемическим инсультом атеротромботический вариант верифицирован у 338 (43,3%) больных, кардиоэмболический - у 298 (38,2%), лакунарный - у 73 (9,4%) и неустановленного патогенетического подтипа - у 71 (9,1%). При анализе распределения пациентов по тяжести состояния выявлено преобладание больных с тяжелым состоянием (показатель по шкале NIHSS >14 баллов) на 1-3-и сутки от развития заболевания (что соответствует максимальной выраженности отека головного мозга в острейшем периоде инсульта). Летальный исход наблюдался у 180 (23,1%) пациентов с ишемическим инсультом и у 43 (45,3%) - с геморрагическим.

Распространенность основных факторов риска церебрального инсульта у пациентов с различными его типами представлена в таблице.

Для проведения полногеномного ассоциативного анализа на представленном этапе исследования были отобраны больные с кардиоэмболическим инсультом. В выборку для проведения полногеномного сканирования были включены 290 больных с этой формой инсульта и 450 человек из случайных популяционных выборок. Данные по сканированию генома больных с инсультом и лиц из популяционных выборок были получены с использованием микрочипа HUMANCYTOSNP12 v.2, что позволило проанализировать все образцы ДНК на панели из 301 000 однонуклеотидных полиморфных ДНК-маркеров.

Полученную базу данных по частоте ОНП у больных с инсультом и здоровых лиц просканировали на частоту минорного аллеля по всем ОНП (с исключением из дальнейшего анализа маркеров с частотой в объединенной выборке менее 5%), число типированных у каждого индивидуума ДНК-маркеров (с исключением из дальнейшего анализа лиц, у которых было типировано менее 90% ДНК-маркеров) и на соответствие распределения частот аллелей и генотипов уравнению Харди-Вайнберга (с исключением из дальнейшего анализа ДНК-маркеров с отклонением ожидаемого и наблюдаемого распределения частот генотипов с вероятностью более 0,1 по критерию χ² в случайной популяционной выборке). В итоге из дальнейшего анализа было исключено 1400 ДНК-маркеров. Так как средний уровень типирования превысил 99%, то из дальнейшего анализа были исключены всего 2 человека. Скорее всего, в этих случаях имели место ошибки генотипирования, что могло быть связано с качеством препаратов ДНК - было типировано менее 60% всех анализируемых ДНК-маркеров.

Все полученные данные по спектру аллельных вариантов были обработаны по методу главных компонент (РСА) с целью выявления уровня генетической гетерогенности выборок и исключения из дальнейшего анализа лиц, сильно отличающихся по величине первой и второй главных компонент от основной группы изучаемых лиц. На рисунке (см. на цв. вклейке) приведены данные РСА-анализа и видно, что среди обследованных есть лица, которые значимо отличаются от основной части выборки по величине первой и второй главных компонент (величина различий между крайними точками достигала 0,45 по первой главной компоненте и 0,3 - по второй главной компоненте).

Далее эта база данных была использована для проведения ассоциативного анализа, в рамках которого проводилось сравнение частот аллелей по каждому из ОНП ДНК-маркеров с использованием критерия χ² с учетом поправок на множественность сравнений. Величина χ² была рассчитана для каждого ОНП и сопоставлена с ожидаемой величиной при предположении о совпадении частоты анализируемого аллеля в сравниваемых выборках. При использованном числе маркеров (300 000 ОНП) достоверными являются отличия в частоте аллелей в выборке больных с инсультом и случайной популяционной выборке, для которых р не превышает 10^–8. Для визуализации полученных результатов был использован метод Манхеттен плот, при котором величина десятичного логарифма вероятности откладывается на графике в соответствии с положением ДНК-маркера. В итоге был выявлен один ассоциированный с риском развития кардиоэмболического инсульта ДНК-маркер - rs1842993 в перицентромерной области хромосомы 7, который достоверно ассоциирован с риском развития кардиоэмболического инсульта (р<10^–8).

Распределение аллелей и генотипов по маркеру rs1842993 было проанализировано во всей выборке больных с инсультом. Показано, что частота редкого аллеля выше у больных с инсультом по сравнению с лицами из контрольной группы (33,1 и 24,7% соответственно, χ²=18,237; Df=1). У носителей более редкого аллеля риск развития инсульта также достоверно повышен - ОР =1,512 при 95% доверительном интервале (ДИ) 1,252-1,825.

Для уточнения полученных результатов необходимо продолжить проведение полногеномного сканирования на расширенных независимых выборках больных и проанализировать дополнительные ДНК-маркеры, расположенные в области ОНП rs1842993. Также важно на междисциплинарном уровне изучить влияние выявленного ОНП rs1842993 на метаболические пути, задействованные в патогенезе кардиоэмболического инсульта.

Наше исследование, направленное на поиск детерминант инсульта, продолжается. Данные, которые будут получены, планируется использовать в разработке диагностической тест-системы для определения индивидуальной генетической предрасположенности к инсульту у лиц славянской популяции, что должно открыть новые возможности для быстрой и своевременной диагностики и индивидуализированной профилактики церебрального инсульта, а также определить основные составляющие патогенетического лечения.