Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) защищает мозговую ткань, к которой в организме имеется иммунная толерантность. При разрушении ГЭБ ткань головного мозга распознается иммунной системой как чужеродная с последующим запуском аутоиммунных механизмов, значение которых в развитии ишемического повреждения мозга изучается [1-4].

Стимуляция иммунной системы аутоантигенами сопровождается продукцией аномальных термозависимых иммуноглобулинов (Ig) криоглобулинов, которые могут рассматриваться как маркер уровня аутоиммунной сенсибилизации [5, 6].

Результаты наших предыдущих исследований выявили феномен криоглобулинемии (КГМ) у больных с ишемическим инсультом и ее прогностическую значимость при данной патологии [7, 8].

Биологические свойства Ig, образующих иммунные комплексы (ИК), в том числе с криосвойствами (крио-ИК), не ограничиваются реакцией антиген-антитело-комплемент и во многом определяются составом ИК [5, 6, 9, 10].

В зависимости от иммунохимического состава различают 3 типа КГМ [11]. Особенностью КГМ 1-го типа является присутствие в крови одного субкласса Ig или комплексов из моноклональных криоглобулинов, обычно IgM. Для 2-го и 3-го типов КГМ (смешанной) характерно повышение уровня крио-ИК, сформированных из поликлонального IgG (антиген) и моно- или поликлонального IgM (антитело) соответственно. Существуют и другие типы КГМ, например, олигоклональная, которая является промежуточной и не укладывается в общепринятую классификацию [11]. КГМ 2-го и 3-го типов наблюдается при ряде аутоиммунных, хронических инфекционных и других заболеваний [5, 6, 11, 12].

В последние годы показано, что в случае смешанной КГМ в состав криокомплекса помимо Ig различных классов могут входить и другие белки, такие как компоненты системы комплемента, фибронектин, ревматоидный фактор в различных соотношениях [5, 6, 9, 10, 12-14]. Вопрос о качественном составе крио-ИК при каротидном инсульте не освещен в литературе, а вместе с тем состав криокомплексов может оказывать влияние на их биологическое действие: изменять функциональную активность иммунокомпетентных клеток, их взаимосвязь, скорость пролиферации, клиренс криокомплексов, отложение последних в тех или иных тканях, в сосудистой стенке.

Целью данной работы явилось определение качественного и количественного состава крио-ИК при атеротромботическом и кардиоэмболическом патогенетических вариантах ишемического каротидного инсульта.

Обследованы 70 больных (35 мужчин, 35 женщин) в возрасте от 45 до 84 лет, поступивших в первые 24 ч после впервые развившегося каротидного ишемического инсульта в отделение неврологии ГКБ №20 (табл. 1).

В исследование не включались пациенты с повторным инсультом и с аутоиммунными, воспалительными, инфекционными и другими заболеваниями, при которых возможна КГМ другой этиологии.

Диагноз ишемического инсульта устанавливался на основании данных анамнеза, клинической картины, данных КТ головного мозга, транскраниальной ультразвуковой допплерографии и дуплексного сканирования магистральных артерий головы, эхокардиографии. Неврологический статус пациентов оценивался по клиническим шкалам NIHSS (National Institutes of Health Stroke Scale) и Оргогозо. Вариант инсульта диагностировался на основании критериев TOAST (Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment) [15]. Все больные получали комплексную, максимально унифицированную базисную терапию, направленную на коррекцию нарушений центральной и церебральной гемодинамики, гемореологических показателей, борьбу с отеком мозга.

Наряду со стандартным для данной патологии комплексом лабораторно-инструментальных обследований определяли уровень криоглобулинов в сыворотке периферической крови на 1-, 2-, 3-, 7-, 14-е и 21-е сутки от развития инсульта.

Забор крови производили из кубитальной вены самотеком в предварительно нагретую до 37°С стерильную пробирку. Образование сгустка происходило в термостате при температуре 37°С. После центрифугирования выделенную сыворотку помещали в холодильную камеру и выдерживали при температуре 4°С в течение 7 дней. После повторного центрифугирования и отделения от надосадочной жидкости преципитат отмывали веронал-мединаловым буфером, а затем растворяли им преципитат и доводили объем раствора до исходного объема сыворотки.

Количественную оценку крио-ИК проводили спектрофотометрическим методом, впервые предложенным A. Kalavidoris и R. Johnson [16], по разности оптических плотностей: ΔOD=OD₄–OD₃₇, где OD₄ и OD₃₇ - оптическая плотность криоглобулинов в буфере при 4 и 37°C (использование разности оптических плотностей позволяет исключить влияние на концентрацию возможно присутствующих ИК, не обладающих криоактивностью). Измерения проводили при длине волны 280 нм на спектрофотометре Саггу-50 (США), используя коэффициент экстинции 1,4.

Для определения качественного состава крио-ИК был использован метод вертикального электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS) в редуцирующих и нередуцирующих условиях с последующей окраской геля Кумасси ярко-голубым R-250 при помощи прибора для вертикального электрофореза Mini-Protean 3 (BioRad, США).

В динамике оценивался состав криоглобулинов. Определялись концентрации Ig классов М, A, G, фибронектина, доля IgM с активностью ревматоидного фактора, а также изотипы IgG (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4) методом твердофазного иммуноферментного анализа, используя тест-системы и реагенты «Biosours» ( США), «Вектор-бест» (Россия) и «Bender MedSystems» (США). Результаты реакции учитывали при длине волны 492 нм на ИФА-ридере «Пикон» (Россия). Концентрацию конкретного вещества в образце определяли на калибровочной кривой соотношения оптической плотности раствора в лунке и известной концентрации данного вещества, умножая на соответствующее разведение данного образца.

Первым этапом работы явилось определение уровня криоглобулинов в сыворотке крови при острой ишемии головного мозга на 1-е сутки от дебюта заболевания при различных патогенетических вариантах инсульта.

Криоглобулины были обнаружены у 100% обследованных больных с 1 до 21 суток заболевания в повышенных концентрациях в сравнении с нормальными значениями (60-80 мкг/мл). Уровень криобелков крови прямо коррелировал с тяжестью клинического состояния больных (р<0,01), что может отражать влияние аутоиммунной агрессии на прогредиентное течение ишемического повреждения.

В 1-е сутки заболевания концентрация крио-ИК в среднем по группе составляла при атеротромботическом варианте 158,3±78,6 мкг/мл, а при кардиоэмболическом - 132,4±82,2 мкг/мл, что выше нормальных значений на 125 и 88% соответственно. При атеротромботическом варианте инсульта концентрация криоглобулинов в сыворотке была на 16,4% выше, чем при кардиоэмболическом инсульте, что может быть связано с этиопатогенезом атеротромботического типа инсульта - атеросклеротическим поражением артерий. Вероятно, хроническое субклиническое воспаление сосудистого эндотелия, сопровождающее прогрессирование и дестабилизацию атеросклеротической бляшки, является сенсибилизирующим фактором, способствующим продукции криоглобулинов. Такой взгляд подтверждается работами исследователей петербургской школы (А.Н. Климов, Н.Г. Никульчева [17, 18]), в которых было показано, что модифицированные (чаще окисленные) липопротеины низкой плотности провоцируют появление аутоантител и могут становиться источниками ИК.

Как отмечалось выше, криоглобулины - это гетерогенная группа белков. В данной работе проведена качественная и количественная оценка криоглобулинов, формирующих крио-ИК у больных с ишемическим инсультом.

Оказалось, что в состав криокомплексов, независимо от патогенетического подтипа инсульта, в 100% случаев входят IgG, IgM и фибронектин. В 11% случаев встречался IgA, в 6% - IgM, обладающий активностью ревматоидного фактора.

Содержание Ig классов G, М и А в крио-ИК на 1-е сутки заболевания при атеротромботическом и кардиоэмболическом вариантах ишемического инсульта показаны в табл. 2.

Обращает на себя внимание тот факт, что в случае присутствия IgA в составе криокомплекса содержание этого Ig достоверно превышает концентрацию IgM, но ниже чем IgG. Это коррелирует с концентрациями IgG, IgA, IgM в сыворотке здоровых доноров.

Преимущественное содержание IgG по сравнению с другими Ig в составе криокомплекса у больных с ишемией мозга говорит в пользу длительной предынсультной сенсибилизации организма и определяющей роли вторичного иммунного ответа на антиген в острый период инсульта. «Фоновая» доинсультная сенсибилизация организма нейроспецифическими белками, способными попадать в кровь задолго до возникновения острой ишемии, уже была описана в ряде работ, в том числе и оригинальных [1, 2, 19].

Кроме того, IgG-антитела, на долю которых приходится бóльшая часть антител (особенно при вторичном ответе иммунной системы), имеют ряд преимуществ перед IgM-антителами по сродству к антигену, а также по эффекторным и регуляторным функциям [20].

Вопрос об участии антител различных классов и подклассов в патогенезе ишемического инсульта не решен до настоящего времени, хотя его решение может внести вклад в оценку роли иммунной системы при ишемии.

В связи с тем, что IgG оказался определяющей иммуноглобулиновой составляющей крио-ИК при ишемии головного мозга, проведена оценка изотипов IgG, формирующих криокомплексы. С этой целью измерялось содержание изотипов IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 в составе криокомплекса у исследуемых больных и оценивалась доля каждого из них (табл. 3).

Для обеих исследуемых групп пациентов наиболее представленными в криокомплексах являются изотипы IgGl и IgG2, на их долю приходится не менее 90% общего количества IgG, при этом около 50% на долю IgGl. Наблюдаемые результаты могут быть связаны с тем, что эти подклассы IgG после образования крио-ИК активно взаимодействуют через Fc- и С-рецепторы основных фагоцитирующих клеток. Полученные различные значения концентраций изотипов IgG свидетельствуют о разнице в биологических и функциональных свойствах подклассов IgG в развитии ишемического повреждения головного мозга.

Taк, известно, что мононуклеарные фагоциты активно взаимодействуют через FcγRIII с IgGl и IgG3 и, в значительно меньшей степени, - с IgG2-изотипами, входящими в ИК. Это взаимодействие приводит к связыванию криокомплекса с FcγRIII, поглощению ИК и его фагоцитозу [6]. Вместе с тем присоединение тех же ИК к С3в- и С3вi-рецепторам моноцитов приводит лишь к поверхностному связыванию, но не поглощению комплекса.

Интересно было определить, меняется ли состав криокомплекса в процессе проведения стандартного лечения. С этой целью проводилась оценка его состава на протяжении всего периода наблюдения. Относительное изменение (к соответствующим показателям для 1 суток наблюдения) содержания IgG, IgM и IgA в составе криокомплексов при атеротромботическом и кардиоэмболическом вариантах инсульта представлены на рисунке.

Как следует из рисунка, в обеих группах больных имеют место существенные изменения по иммуноглобулиновому составу криокомплексов в процессе лечения. За первые 3 суток от начала заболевания наблюдалась схожая динамика изменений IgG и IgM в составе крио-ИК при атеротромботическом и кардиоэмболическом вариантах инсульта. Однако к 7-му дню от начала заболевания при атеротромботическом варианте инсульта происходило достоверное снижение, а при кардиоэмболическом - повышение концентрации всех типов Ig.

Состав крио-ИК и динамика его изменения зависят от времени развития острого инсульта и варианта ишемии. В связи с тем, что процесс формирования пенумбры и области ишемии наиболее активно проходит в первые часы и дни острого периода, особо важно было проследить изменения исследуемых параметров в первые 7 суток наблюдения.

Хотя на 2-е сутки от начала заболевания наблюдалось некоторое снижение концентрации Ig всех классов в составе ИК у исследуемых больных, уже начиная с 3 суток динамика изменения иммуноглобулинового состава носит зеркально противоположный характер.

Если на 3-и и 21-е сутки при атеротромботическом варианте инсульта наблюдается увеличение, а к 7-му дню - резкое снижение концентрации иммуноглобулиновой составляющей в составе крио-ИК, то при кардиоэмболическом варианте это - как раз дни с минимальным содержанием Ig в крио-ИК. Тогда, как к 7-му дню наблюдения у больных с атеротромботическим вариантом ишемического инсульта концентрация Ig в составе крио-ИК минимальна, у больных с кардиоэмболическим вариантом - максимальная за весь период исследования.

Для понимания динамики изменения иммуноглобулиновой составляющей крио-ИК параллельно определялись концентрация фибронектина в их составе и общий уровень криокомплексов (см. рисунок). Динамика изменения фибронектина в составе крио-ИК на протяжении острого периода ишемии аналогична изменению иммуноглобулиновой составляющей комплекса для обоих типов ишемии (исключение составляет только значения для 21-х суток наблюдения у больных с кардиоэмболическим вариантом). При этом общий уровень криобелков имеет противоположную фибронектину направленность изменения по времени.

Полученные данные подтверждают взаимовлияние физико-химических свойств криоглобулинов и образуемых ими ИК на их биологическую и функциональную значимость при ишемии. Повреждающее действие ИК, в том числе с криосвойствами, заключается не только в их роли индукторов воспаления, но и в их способности блокировать другие иммунологические эффекторные механизмы [21].

Результатом взаимодействия этих комплексов с Fc- и С-рецепторами на тромбоцитах, нейтрофилах, базофилах и других клетках крови является секреция клетками ферментов, лимфокинов, выработка цитокинов, медиаторов кининовой системы, а также активация системы простагландинов и системы свертывания крови. Однако не все ИК, циркулирующие в крови, имеют патогенные свойства. К патогенным ИК преимущественно относятся комплексы средних размеров, в основном IgG-coдержащие, с повышенной концентрацией в крови [21].

Исходя из вышесказанного, можно придти к следующему заключению. При ишемии головного мозга на разных стадиях развития процесса формируются крио-ИК, которые имеют различные физико-химические свойства и изменяются по времени в зависимости от варианта ишемии. На 1-е сутки ишемического повреждения в крови циркулирует значительное количество крио-ИК. На 3-и сутки для больных с атеротромботическим инсультом формируются криокомплексы со сниженным содержанием IgG, но значительным содержанием фибронектина. Эти комплексы большие по размеру и хорошо фагоцитируются, поэтому общий уровень криоглобулинов в циркуляции снижается. При кардиоэмболическом инсульте в этот же временной интервал формируются криокомплексы с низким уровнем IgG и фибронектина. Эти криокомплексы мелкие, плохо фагоцитируются и их уровень в крови высок. Аналогичная картина складывается у больных с атеротромботическим инсультом на 7-й день заболевания. Низкое содержание IgG и фибронектина в составе крио-ИК приводит к формированию малых по молекулярной массе и слабофагоцитируемых комплексов и к значительному увеличению концентрации циркулирующих криокомплексов в крови. В то же время на 7-е сутки у больных с кардиоэмболическим патогенетическим вариантом ишемии крио-ИК содержит наибольшее за весь период наблюдения количество IgG, также увеличенную концентрацию IgM и IgA при сниженном содержании фибронектина (см. рисунок). Образуемые при этом криокомплексы средних и крупных размеров частично фагоцитируются, общий уровень крио-ИК в циркуляции снижается.

К 21-м суткам в крови больных с атеротромботическим инсультом резко возрастает уровень фибронектина, увеличиваются уровни всех Ig в составе ИК, формируются криокомплексы большой молекулярной массы. Последние хорошо фагоцитируются, и, как следствие, происходит снижение общего уровня криоглобулинов (см. рисунок). При кардиоэмболическом инсульте на 21-е сутки от начала заболевания значительно снижается уровень у Ig в составе крио-ИК, хотя увеличивается содержание фибронектина. Это приводит к увеличению фагоцитарной активности криокомплексов и снижению общего уровня криоглобулинов в крови (см. рисунок). Имеются данные, согласно которым количество Ig, связывающих фибронектин, меняется в зависимости от их класса. Для IgG - от 0,8 до 9,5%, для IgM - от 0,25 до 4,9%, для IgA - от 0,15 до 0,71% от общего количества данного белка в крови [5]. Важно отметить, что при этом фибронектин не взаимодействует с нативным IgG, а только со структурно-модифицированным в результате связывания IgG (антитело) с антигеном ИК.

Зависимости концентраций фибронектина и IgG, IgA, IgM от времени наблюдения для обоих вариантов ишемического инсульта схожи, но смещены по временной шкале, быстрее и с меньшими пределами изменения исследуемых величин при кардиоэмболическом, чем при атеротромботическом варианте ишемии. Таким образом, общий характер изменений сходен при развитии ишемии головного мозга, но имеет особенности в зависимости от патогенетического варианта ее развития.

Это может быть объяснено следующим образом. Прежде всего при атеротромботическом инсульте на 1-е сутки заболевания регистрируются более высокие значения уровня криоглобулинов, что, вероятно, связано с вкладом в доинсультную аутосенсибилизацию организма аутоантител к модифицированным липопротеинам у больных с атеросклеротическим поражением каротидных артерий. Причиной более выраженного относительного снижения уровня криоглобулинемии при атеротромботическом варианте инсульта может являться элиминация из организма тех крио-ИК, которые образовывались при дестабилизации атеросклеротического процесса (путем фагоцитоза или активаций системы комплемента).

На 3-и и 7-е сутки наблюдается рост концентрации IgM и IgG в составе криокомплексов у больных как с атеротромботическим, так и кардиоэмболическим вариантом инсульта, причем относительное увеличение оказалось схожим в обеих группах. Наблюдающийся рост концентрации IgM и IgG в составе криокомплексов на 3-и и 7-е сутки заболевания, вероятно, связан со второй фазой иммунного ответа, при которой наблюдается дополнительная выработка аутоантител с криосвойствами к нейробелкам вследствие дополнительного повреждения ГЭБ, возникающего на фоне развертывания клеточно-микроциркуляторных каскадных реакций в ткани головного мозга. Известно, что существуют определенные сроки антителообразования: для инициации ответа требуется в среднем 3-7 дней.

Таким образом, качественный и количественный состав криоглобулинов и образующихся с ними ИК может играть существенную роль в процессах активации адаптивного иммунитета и опосредованно влиять на иммунный ответ при острой ишемии головного мозга.