Генная терапия заболеваний внутреннего уха: шаг в будущее

Генная терапия нарушений слуха — это область исследований, направленных на устранение или коррекцию генетических нарушений, приводящих к нарушению работы слухового анализатора. В свете современных достижений в геномике и молекулярной биологии генная терапия становится важным направлением в аудиологии и оториноларингологии. Наследственные формы тугоухости вносят существенный вклад в структуру сенсоневральных нарушений слуха пациентов любого возраста. Наиболее значимыми являются гены, ответственные за врожденную тугоухость, поскольку нарушаются речевое развитие детей и их дальнейшая социализация. Для многих нарушений слуха идентифицированы гены и специфические мутации, знания о которых обеспечивают основу для терапии, использующей генетические технологии [1—4]. Первые шаги успешного применения генной терапии для заболеваний внутреннего уха уже сделаны. Теме разработки генной терапии заболеваний внутреннего уха на начало 2024 г., согласно Национальному центру биотехнологической информации (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), посвящено более 1000 статей, тем не менее результаты конкретных исследований в этой области с помощью модельных животных описаны в небольшом количестве работ [5—7]. На сегодняшний день несколько препаратов уже проходят клинические испытания. Основными программами являются протокол лечения DB-OTO фармацевтической компании Regeneron (https://www.regeneron.com), программы OTOF-GT (SENS-501) и протокол GJB2-GT компании Sensorion (https://www.sensorion.com/en/our-approach/restore-treat-prevent), а также протокол программы препарата OTOV101N+ OTOV101C компании Suzhou Otovia Therapeutics Co., Ltd. (https://www.otovia.com.cn/eng/about.asp) [8—11].

Цель статьи — показать современное состояние исследований, направленных на разработку и внедрение генной терапии заболеваний внутреннего уха, этого сложнейшего направления, находящегося на стыке науки и практики.

Генная терапия — это группа методов лечения заболеваний, в основе которых лежит введение в организм чужеродных нуклеиновых кислот ДНК и РНК в виде особых генно-инженерных конструкций. История генной терапии насчитывает уже несколько десятилетий. Еще в 70-х годах прошлого века появились первые статьи с предложением заменять дефектную ДНК у лиц с генетическими дефектами [12]. Развитию генной терапии способствовало открытие явления трансформации у бактерий. Оказалось, что некоторые вирусы способны проникать в клетки бактерий и встраивать свои гены в ДНК клеток хозяина, которые затем начинали воспроизводить новые вирусы, заражающие все больше соседних клеток. Используя эту способность, ученые выбрали вирусы в качестве несущих элементов для здоровых работающих генов, чтобы доставить в нужный участок организма. Важной частью исследований было справиться с иммуногенностью вирусов. Генетическая коррекция соматических клеток стала реальностью после 80-х годов XX века, когда была разработана система ретровирусного вектора, способная эффективно встраивать инородные гены в хромосомы млекопитающих. Исторически генная терапия нацеливалась на лечение наследственных генетических заболеваний, однако поле ее применения расширилось [13]. Сегодня генную терапию рассматривают как потенциально универсальный подход к лечению наследственных, онкологических, инфекционных заболеваний. В настоящий момент разработаны подходы к исправлению генетических дефектов, но продолжается изучение условий, необходимых для эффективной терапии: способов доставки, доз, сроков воздействия, безопасности и иммуногенности. Выделяют специфическую и неспецифическую генную терапию. При специфической генной терапии «правильная» последовательность ДНК интегрирована в структуру вируса. При неспецифической генной терапии используются вещества с нейротрофическим и антиапоптотическим действием [14, 15].

Внутреннее ухо содержит в своем составе множество различных типов клеток, которые влияют на его структуру и функцию. Развитие уха требует исключительной координации во времени и пространстве между всеми клетками [16, 17]. Дифференциальная регуляция генов внутреннего уха чрезвычайно сложна. Во время развития органа слуха сотни, если не тысячи генов должны дифференцированно экспрессироваться в разных типах клеток и в разные периоды времени. Даже у взрослого человека во внутреннем ухе экспрессируется множество различных генов, важных для процесса преобразования звука и процессов нейронного кодирования [18]. Вероятно, именно по этой причине обнаружено так много мутаций, поражающих внутреннее ухо: более 6000 патогенных и вероятно патогенных вариантов в 150 генах тугоухости/глухоты идентифицированы на сегодняшний день [19]. Кроме того, тугоухость является частью фенотипа более 700 генетических синдромов [1, 2]. Согласно последним оценкам, 40% случаев в группе заболеваний спектра аудиторных нейропатий имеют генетическую основу [20]. Установлено, что мутации более чем в 300 дополнительных генах могут привести к потере слуха в структуре мультифакториальных заболеваний. Такое разнообразие генов и мутаций делает применение генной терапии для заболеваний внутреннего уха очень сложной задачей, поскольку потребуется производить разные генные продукты для разных типов клеток. Кроме того, в большинстве случаев введение препаратов будет ограничено определенным промежутком времени при развитии внутреннего уха [6, 7].

Для тестирования потенциальных возможностей генной терапии заболеваний внутреннего уха используют генетические модели мышей, которые имитируют наследственные нарушения слуха у человека [3, 9]. Мыши на момент рождения являются глухими и начинают активно реагировать на звуки только к 21-му дню жизни, что дает время на испытание генной терапии у новорожденных мышей. Правильная экстраполяция данных, полученных на животных, очень важна [21].

В настоящее время предложены четыре стратегии проведения генной терапии: замена гена, изменение процесса сплайсинга, подавление генов и редактирование генов [22, 23]:

1) замещение неправильной копии гена правильной копией относится к генозаместительной, или классической, генной терапии, которая подходит только для мутаций с потерей функции, когда невозможен синтез продукта гена [17];

2) изменение процесса сплайсинга гена (важнейший процесс при созревании матричной РНК) и восстановление рамки считывания с помощью антисмысловых олигонуклеотидов (ASOs) [24, 25];

3) подавление эксперессии гена (процесс синтеза функционального продукта гена) или нокдаун гена с помощью введения малых интерферирующих РНК [26, 27];

4) изменение последовательности гена с помощью геномного редактирования, которое использует так называемые программируемые нуклеазы. Данный метод подходит для всех типов мутаций [28, 29].

Важно, что разные стратегии подходят для разных моногенных заболеваний в зависимости от их патогенного механизма. Рецессивные заболевания в подавляющем большинстве вызваны вариантами потери функции (loss of function — LOF) на двух аллелях, в то время как доминантные расстройства более сложны и имеют три основных молекулярных механизма: 1) гаплонедостаточность, при которой только один вариант гена не работает, но рабочей аллели недостаточно для нормальной функции гена; 2) доминантно-негативные эффекты, при которых мутантная аллель не только нефункциональна, но и мешает работе продукта нормальной аллели; 3) усиление функции (gain of function — GOF), когда патогенная аллель увеличивает дозу или активность продукта гена [23, 30].

Замена гена означает доставку нормальной копии гена для снабжения нормально функционирующим белком, который подходит для генетических заболеваний, связанных с мутациями с потерей функции, таких как рецессивные расстройства и доминантные заболевания с гаплонедостаточностью.

В процессе сплайсинга до той матрицы (матричная РНК, или мРНК), на которой будет синтезироваться белок, последовательности нуклеотидов, не кодирующие белок (интрон), «вырезаются», а участки, кодирующие последовательность аминокислот в белке (экзоны), сшиваются.

Изменение процесса сплайсинга (от англ. to splice — сшивать, соединять; процесс созревания мРНК) с помощью различных инструментов направлено на пропуск или включение выбранных экзонов (кодирующих участков гена). Подавление экспрессии мутантных генов на уровне мРНК также проводится с помощью антисмысловых олигонуклеотидов (ASOs) или РНК-интерференции (RNAi). Эти инструменты могут быть применены к мутациям с доминантно-негативным эффектом и к мутациям с усилением функции [31].

Редактирование генов позволяет осуществлять прямые манипуляции на уровне ДНК, главным образом посредством системы эндонуклеаз CRISPR-Cas9, включая два пути репарации (негомологичное соединение концов и репарацию, направленную на гомологию), базовые редакторы и прайм-редакторы. Потенциальными кандидатами для данного метода генной терапии являются все патогенные варианты [23, 32].

Большинство авторов утверждают, что ключевые условия для достижения успеха и повышения эффективности разработки генной терапии следующие [2, 7, 23, 32]:

1) заболевание связано с нарушением структуры гена, и установлена молекулярно-генетическая причина;

2) затронут один орган или один тип клеток;

3) для обеспечения долгосрочного результата клетки-мишени не должны делиться;

4) клетки-мишени должны быть доступны, что обеспечивается выбором надежного способа доставки непосредственно во внутреннее ухо;

5) доставка в соответствующий тип клеток и в определенное время — терапевтическое окно;

6) выбран наиболее подходящий способ генной терапии для конкретного случая;

7) должна быть обеспечена низкая иммуногенность.

Для генной терапии заболеваний внутреннего уха на сегодняшний день обозначен ряд проблем, которые ограничивают ее развитие [33, 34]. Основным препятствием является то, что многие гены активны в определенное время, также они могут быть по-разному активны в разные периоды развития организма. Поэтому очень важно определить временной интервал, когда воздействие будет наиболее эффективным. Для большинства генов, ответственных за врожденное нарушение слуха, таким временным периодом является период эмбрионального развития. В этот период организм быстро меняется, а также существенно ограничены возможности для локальной доставки [2, 6].

Мутации, приводящие к потере слуха, в основном затрагивают структурные элементы клеток: белки мембранных каналов, структурные элементы стереоцилий, белковые связи пучка стереоцилий, белки ленточного синапса и т.п. Из множества типов клеток внутреннего уха, которые работают согласованно, генная терапия нацелена на определенный тип клеток с конкретным генетическим нарушением. Если терапия затрагивает нецелевые клетки или в неподходящее для воздействия время, то она может быть неэффективной или даже вредной [18]. Таким образом, чтобы генная терапия была эффективной, она должна быть не только проведена в определенное время, но и направлена на соответствующие клетки. Инструменты для решения этой задачи заложены внутри самого генома, поскольку все гены содержат регуляторные элементы, которые контролируют, когда и где экспрессируется ген [13, 16]. Почти все промоторы генов подлежат регуляции, контролирующей уровень экспрессии генов. Многие вирусы содержат регуляторные элементы, которые контролируют экспрессию генов млекопитающих в клетках-хозяевах. Использование этих естественных регуляторных механизмов позволяет адаптировать генную терапию к любой клетке практически в любое время и довольно точно регулировать уровень экспрессии продуктов гена. Специфичные для клеток промоторы генов позволяют направить терапию на желаемый тип клеток. Более того, условные промоторы могут включать и выключать экспрессию генов в нужное время. Теоретически эти технологии предлагают механизм, с помощью которого можно доставить препарат генной терапии в любую клетку в любой момент времени [35, 36].

Доставка препаратов генной терапии представляет другую серьезную проблему. Выбор способа доставки и целевого места связан с необходимостью обеспечить достаточный уровень или продолжительность экспрессии генов, чтобы повлиять на течение заболевания [37]. При испытании генной терапии должны быть отработаны подходы, которые обеспечат безопасную доставку препарата во внутреннее ухо. На моделях животных изучается эффективность при трех путях введения препарата в улитку: через мембрану круглого окна, задний полукружный канал, кохлеостому. При проведении генной терапии необходимо подтвердить отсутствие риска эктопической экспрессии, подобрать эффективную дозу, изучить длительность и стойкость эффекта, сроки лечения при разных способах доставки [23].

Первые сообщения об успешном испытании генной терапии на мышах появились в 2012 и 2015 гг. [38, 39]. C. Askew и соавт. вводили в улитку мыши модели Бетховен препарат гена TMC2. Ген TMC1 является распространенной причиной генетической глухоты у человека (4—8%) и кодирует белок, который является основой канала механо-электрической трансдукции. Ученые использовали технологию CRISPR-Cas9 protein-RNA, которая позволила блокировать доминантную мутацию гена и восстановить работу нормальной копии, и показали снижение тяжести наследственной тугоухости у мышей модели Бетховен [39].

Воодушевляющие результаты генной терапии опубликованы в журнале Nature в 2017 г., в статье, посвященной успехам генной терапии у мыши с мутацией в гене Whm, которая является моделью синдрома Ашера. Мутации этого гена приводят к формированию волосковых клеток с очень короткими пучками стереоцилий. Группа исследователей показала, что генная терапия восстанавливает экспрессию белка вирлина (продукт гена), в результате чего пучки стереоцилий увеличиваются до нормальной длины и регистрируется восстановление потенциала действия слухового нерва [40, 41].

Генная терапия, опосредованная аденоассоциированным вирусом (adeno-associated virus — AAV), стала многообещающим подходом к лечению моногенных наследственных заболеваний, что привело к одобрению Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (Food and Drug Administration — FDA) нескольких AAV-продуктов генной терапии. Эффективность заместительной терапии гена OTOF, опосредованной AAV, подтверждена во многих экспериментах на мышах с дефицитом отоферлина, кодируемого геном OTOF [42, 43]. Исследование J. Qi и соавт. стало первым, которое продемонстрировало безопасность и эффективность препарата AAV-OTOF у пациентов [8]. Размер гена OTOF у человека превышает упаковочную емкость AAV-вектора, поэтому для доставки гена использована стратегия двойного вектора, то есть ген OTOF разделили на два фрагмента и вставили их в два AAV-вектора. Кроме того, введение AAV-вектора с геном OTOF проводится под контролем специфичного промотора гена MYO15, который обеспечивает экспрессию гена только в заданном типе клеток.

Исследование J. Qi и соавт. представляет собой первый отчет о 2-й фазе клинических испытаний применения AAV-вектора.

О начале клинических испытаний в Китае сообщено в 2022 г. В исследование включены 6 детей с двусторонней рецессивной глухотой 9-го типа (DFNB9), обусловленной мутациями в гене OTOF. В результате проведенной терапии у 5 из 6 детей по данным регистрации коротколатентных слуховых вызванных потенциалов (КСВП) и тональной пороговой аудиометрии зарегистрировано значимое снижение порогов слышимости. Кроме того, отмечено улучшение восприятия речи у участников с восстановленным слухом [8, 9].

В 2022 г. фармацевтическая компания Regeneron приступила к 1-й и 2-й фазам клинических испытаний под названием CHORD, рассчитанных на период 2023—2031 гг. Официальное название исследования «Фаза 1/2, открытое многоцентровое исследование с одной возрастающей дозой, когортой с односторонней внутрикохлеарной инъекцией, за которой следует расширенная когорта с двусторонней инъекцией, для оценки безопасности, переносимости и эффективности препарата DB-OTO у детей и младенцев с биаллельными мутациями гена OTOF». В настоящее время сообщаются успешные результаты у двух детей. На момент начала испытаний самому маленькому участнику было 11 мес, второму — 4 года (https://investor.regeneron.com/node/29666/pdf). На исходном уровне у обоих участников не было поведенческих и электрофизиологических ответов на максимальных уровнях звука (≥100 дБ). После введения интракохлеарно однократной дозы DB-OTO в одно ухо оба ребенка при первой оценке эффективности в течение 4 нед показали слуховые реакции. Через 24 нед у первого ребенка в возрасте 16 мес произошло улучшение слуха до нормального уровня на ключевых речевых частотах, в среднем на 80 дБ по сравнению с исходным уровнем. При регистрации КСВП зарегистрирован порог 45 дБ. Для второго участника через 6 нед получены сопоставимые с первым ребенком результаты в тот же момент времени. Его первоначальные ответы на громкие звуки в среднем улучшились на 19 дБ на ключевых речевых частотах по сравнению с исходным уровнем и в среднем достигли 80 дБ при тональной пороговой аудиометрии. Положительные ответы при регистрации КСВП достигли 75 дБ. Планируется участие 22 пациентов в возрасте от 0 до 18 лет. Проводимые исследования расширяют и оптимизирует текущую генную терапию, связанную с геном OTOF, и предоставляют ценную информацию для дальнейшего применения генной терапии при глухоте [10].

Таким образом, основным условием на пути прогресса в области генной терапии заболеваний внутреннего уха являются оптимизация эффективности и специфичности инструментов генной терапии и попытки применить новые инструменты для повышения эффективности и снижения влияния на нецелевые участки ДНК. Совершенствование вирусных векторов также позволит повысить эффективность передачи генов в клетки и тропизм к конкретным субпопуляциям клеток. Необходимо изучение возможности использования разных инструментов редактирования генов, поскольку широко используемая система CRISPR-Cas9 не может проникнуть, например, в митохондрии. Очень важно ускорить выявление генетических причин для получения большей информации о естественных эффектах конкретных мутаций, что важно для определения соответствующего терапевтического окна для доставки генов во внутреннее ухо и формирования индивидуального плана лечения [2, 3].

Прежде чем научиться использовать новые возможности лечения, необходимо повышать осведомленность практических врачей и пациентов о распространенности и возможностях диагностики наследственных форм тугоухости, приблизить к практике выявление генетических вариантов. Проведение генетического тестирования должно быть рекомендовано и доступно всем детям с двусторонней сенсоневральной тугоухостью и глухотой, а направлять к врачу — сурдологу-оториноларингологу необходимо всех детей с факторами риска по тугоухости и всех детей с задержкой речевого развития.

Достижения в области молекулярной генетики, создание новых технологий работы с генами определяют начало новой эпохи. Генная терапия демонстрирует многообещающие результаты и имеет значительный потенциал для лечения нарушений слуха. Будущие методы лечения для восстановления функции внутреннего уха и регенерации волокон слухового нерва должны учитывать патогенетические механизмы и сложность факторов, вызывающих заболевания. Чтобы научиться использовать новые возможности, необходимо повышать осведомленность практических врачей и пациентов о наследственных формах тугоухости. Пока совершенствуются протоколы клинических испытаний, необходимо разработать более надежные клинические диагностические инструменты для раннего выявления наследственных нарушений слуха, особенно заболеваний спектра аудиторных нейропатий.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.