Распространенность серотипов Streptococcus pneumoniae при инфекциях ЛОР-органов и носоглоточном бактерионосительстве у детей

Инфекции ЛОР-органов являются самыми распространенными заболеваниями человека, они регистрируются во всех возрастных группах. У детей заболеваемость хроническим тонзиллитом составляет около 27%, носа и околоносовых пазух — 35—37% среди всех заболеваний верхнего отдела дыхательных путей. Более 62% детей в возрасте до одного года переносят острый средний отит один раз, а к трем годам частота составляет 80% [1, 2]. Среди возбудителей инфекций ЛОР-органов наиболее значимыми в настоящее время являются Streptococcus pneumoniae, Haemophilusinfluenzae, реже встречается Moraxella catarrhalis [3, 4]. Исходя из антигенных свойств полисахаридной капсулы, выделяют 46 серогрупп и 91 серотип пневмококка. Спектр преобладающих серотипов S. pneumoniae варьирует в зависимости от возраста, временно`го фактора и географического региона [5— 9].

Одним из важных направлений в предупреждении пневмококковой инфекции является вакцинация. В настоящее время разработаны и разрешены к применению следующие пневмококковые вакцины: 1) конъюгированные: 7-валентная (зарегистрирована в 90 странах, включая США, страны ЕС, РФ), 10-валентная (зарегистрирована в странах ЕС, готовится к регистрации в РФ), 11-валентная (которую начали использовать в США, Великобритании, Австрии), 13-валентная (зарегистрирована в странах ЕС, США, РФ); 2) полисахаридная 23-валентная (зарегистрирована в РФ) [9—11]. Конъюгированные вакцины отличаются числом серотипов пневмококка, входящих в их состав, белками-конъюгантами и количеством полисахаридов для каждого конъюганта. В состав 7-валентной пневмококковой конъюгированной вакцины (PCV, pneumococcal conjugate vaccine) включены 4, 6B, 9V, 14, 18С, 19F и 23 F серотипы, в 10-валентную вакцину входят дополнительно серотипы 1, 5 и 7F к существующей группе серотипов, включенных в PCV7, в PCV11 добавлен 3, в PCV13 добавлены также 3 и 6А, 19А серотипы пневмококков [9]. Полисахаридная 23-валентная пневмококковая вакцина содержит очищенные капсульные полисахариды S. pneumoniae 23 серотипов: 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F, 33F [12].

Цель работы — определить этиологическую роль различных серотипов S. pneumoniae при инфекциях ЛОР-органов и носоглоточном бактерионосительстве у детей.

С января 2002 г. по август 2011 г. исследован биоматериал на носительство пневмококка от 333 больных с диагнозом: острый и хронический гнойный средний отит, 178 — с диагнозом острый и хронический риносинусит и 77 детей без признаков тонзиллита, проживающих в Екатеринбурге и городах Свердловской области (Нижнем Тагиле, Каменск-Уральске, Асбесте). Возраст детей от 3 мес до 17 лет. Проведено микробиологическое исследование 407 проб отделяемого из среднего уха (полученного при тимпаноцентезе или самопроизвольной перфорации барабанной перепонки), 188 проб отделяемого из полости носа и 77 мазков со слизистой оболочки глотки.

Доставку и исследование клинических материалов проводили согласно МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории» и Приказу МЗ СССР №535 от 22.04.85 [13, 14]. Методика посева и набор питательных сред определялся видом исследуемого клинического материала. Идентификация выделенных и реидентификация присланных штаммов S. pneumoniae осуществлялась на основании характера колоний на кровяно-сывороточном агаре (КСА, заявка на патент от 08.07.11, регистрационный №2011128466) после инкубации в обычной атмосфере при температуре 37 °С в течение 18—24 ч, наличия α-гемолиза, чувствительности к оптохину, характеру роста в сахарном и сахарно-сывороточном бульонах, каталазной реакции, положительных результатов латекс-агглютинации с использованием набора Slidex pneumo-Kit («bioMerieux», Франция). Выделенные штаммы пневмококков хранили при –70 °С.

У 62 штаммов S. pneumoniae осуществлялось определение серологических типов методом мультиплексной ПЦР (табл. 1).

Праймеры (Syntol, Россия), специфичные для различных генов S. pneumoniae, синтезированы на основании нуклеотидных последовательностей, приведенных в статье D. Brito и соавт. [11], где также подробно описана методика молекулярного типирования пневмококков, поэтому нами кратко приведена суть технологии. ПЦР-смесь в объеме 25 мкл включала дезоксинуклеотидтрифосфаты («Fermentas», Германия) в конечной концентрации 0,1 ммоль, прямой и обратный праймеры 0,3 pM, сульфат магния (ЦНИИЭ, Россия) 3,5 ммоль, химически-инактивированную TaqF ДНК-полимеразу (ЦНИИЭ, Россия) — 2 ЕД, деионизированную воду в объеме, необходимом для достижения 22,5 мкл. Исследуемый материал в виде бактериальной суспензии в транспортной среде вносился в объеме 2,5 мкл. ПЦР проводилась в амплификаторе Терцик («ДНК-технология», Россия) при следующих условиях: 15 мин при 95 °С, 30 циклов, 10 с при 95 °С, 15 с при 60 °С, 15 с при 72 °С, 5 мин при 72 °С. Детекция результатов ПЦР осуществлялась с помощью электрофореза. 10 мкл ПЦР-продукта вносили в 2% агарозный гель, окрашенный бромистым этидием. В каждую серию ставили маркер молекулярной массы размером 100 пар нуклеотидов (п.н.; «СибЭнзим», Россия). Документирование результатов электрофореза и интерпретация результатов проводилась с использованием системы Gel DocXR («Bio-Rad», США) в программе Quantity One («Bio-Rad», США).

Для статистического анализа полученных результатов использована программа Statistica 6 («StatSoft»).

В 7,4% проб выявлены микроорганизмы-контаминанты — Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium sp., Streptococcus viridans, что скорее всего связано с нарушением правил сбора материала, и при оценке результатов они не учитывались. На рис. 1

Из отделяемого полости носа среди этиологически значимых микроорганизмов на первом месте H. influenzae — 32,7%, затем S. pneumoniae — 30,7% и Staphylococcus аureus — 20,3% (рис. 2).

Из 62 штаммов S. pneumoniae, протестированных методом мультиплексной ПЦР, серотип определен у 55 штаммов (см. табл. 1). 7 штаммов (11,2%) дали отрицательный результат в ПЦР с праймерами cpsA-f и cpsA-r. Количество нетипируемых штаммов, определяемых молекулярными методами, по данным литературы, варьирует от 0,7 до 15% [6, 9, 11, 15].

Серотиповое разнообразие у детей с риносинуситом представлено в табл. 1 и на рис. 3,

Серотипы 1, 14, 3, 5 относят к наиболее вирулентным, кроме того, 1 и 5 еще называют эпидемическими серотипами, так как они нередко вызывают вспышки пневмококковых инфекций в развивающихся странах [15]. Предположительно причина повышенной вирулентности пневмококков серотипа 3 связана с более активной продукцией ими капсульного вещества с антикомплементарными свойствами, а следовательно, они надежнее других защищены от фагоцитоза [17]. Другие авторы связывают 4 и 14 серотипы, а также серогруппы 6, 7, 9, 18, 19, 23 с инфекциями у детей [7, 11].

Доля патогенных серотипов пневмококка у детей с инфекцией ЛОР-органов составила 61,7% (р<0,05), а при носоглоточном бактерионосительстве — 60% (р<0,05) (см. табл. 1).

Несомненно, серотиповой спектр S. pneumoniae имеет отличия в зависимости от разных причин: территории, времени проведения исследования, возраста пациентов, клинического материала, из которого выделен пневмококк и, вероятно, от нозологических форм, а также методик, используемых для серотипирования. Даже в пределах одной семьи серотипы S. pneumoniae могут отличаться у ее членов. Это, возможно, связано с возрастом пациентов. Так, у сестер двух и четырех лет из отделяемого полости носа при риносинусите выявлены различные неделимые совокупности серотипов: 8, 9V, 9A, 11F, 11A, 11B, 11C, 11D, 12F, 15A, 33F и 5, 10A.

У 8 детей с риносинуситом, кроме посева отделяемого из полости носа, делался посев со слизистой оболочки глотки, где также выделен пневмококк. В результате у 6 детей серотипы S. pneumoniae, выделенные из глотки и носа, были различны, лишь у одного ребенка они совпали. Интересен тот факт, что еще у одного ребенка с риносинуситом из ротоглотки выделено два штамма пневмококка и один штамм из носа, которые отличались морфологией колоний, зонами подавления роста вокруг диска с оптохином и чувствительностью к различным классам антибиотиков. Один штамм пневмококка со слизистой оболочки глотки совпал по серотипу со штаммом из полости носа — 6A/6B, а второй штамм из глотки относился к третьему серотипу.

При гнойном среднем отите выявлены следующие серотипы: 6A/6B; 19F и неделимые совокупности: 2, 15F, 17F, 22F, 23B и 8, 9V, 9A, 11F, 11A, 11B, 11C, 11D, 12F, 15A, 33F (по 20% соответственно). По данным Р.С. Козлова и соавт. [9], у детей с острым средним отитом с наибольшей частотой выделялся серотип 19 (31%), реже обнаруживались серотипы 3 (10,2%), 14 (7,7%), 15, 23, 4, 6 (по 5,1% соответственно), 8, 9, 20, 22 (по 2,5% соответственно). В целом по России, так же как и в США, при данной патологии превалируют 19, 6, 23, 14, 3 и 18 серотипы [6, 9, 18].

По данным Р.С. Козлова и соавт. [9], при инвазивных инфекциях (менингит, сепсис) к наиболее часто встречаемым серотипам относят 19 (50%) и 23 (14,3%). При инфекциях ЛОР-органов у детей по результатам настоящего исследования доля этих серотипов составила 19%.

В связи с тем, что пневмококковые вакцины являются частью программы плановой иммунизации детей, поддерживаемой многими странами, необходимо проводить иммунизацию с учетом результатов серотипирования S. pneumoniae на конкретных территориях [7, 19, 20]. Так, при сопоставлении серотипов, входящих в состав конъюгированных пневмококковых вакцин, с серотипами S. pneumoniae, выделенными от детей с риносинуситом, выявлено совпадение серотипового спектра на 55,3% с 7-валентной, 63,2% с 10-валентной, 81,6% с 11-валентной и 84,2% с 13-валентной вакциной (табл. 2).

1. Частота носоглоточного бактерионосительства S. pneumoniae у детей — 19,5%, при этом выявлено всего семь серотипов, где преобладал третий (26,5%), реже встречались серотипы 23F (13,4%), неделимая совокупность — 8, 9V, 9A, 11F, 11A, 11B, 11C, 11D, 12F, 15A, 33F (13,4%); 20 (6,7%); 19А (6,7%); 14 (6,7%); 6А,6В (6,7%).

2. У детей с риносинуситом частота выделения пневмококка — 30,7%, среди них выявлено двенадцать серотипов, где превалировали 6A/6B и 3 (40,5%).

3. Сероварианты S. pneumoniae, выделенные при риносинусите, совпадают с серотипами, входящими в состав конъюгированных пневмококковых вакцин: с 7-валентной — на 55,3%, 10-валентной — на 63,2%, 11-валентной — на 81,6%, 13-валентной — на 84,2%.