Нарушение зрения человека вне зависимости от причин его возникновения — крайне актуальная проблема современной медицины, приводящая к глубоким физическим и эмоциональным проблемам, которые усугубляются потерей независимости и снижением качества жизни, возможностей получения образования и дальнейших карьерных перспектив. По данным Всемирной организации здравоохранения, во всем мире около 1,3 млрд человек живут с той или иной формой нарушения зрения [1]. Эти причины являются сильными мотиваторами для поиска новых способов восстановления зрительной функции.

Современной медициной достигнуты значительные успехи в понимании патологических механизмов нарушения зрения, диагностике и лечении глазных заболеваний. Однако из-за физиологических барьеров и анатомических особенностей структур глаза человека диагностика и лечение характеризуются низкой эффективностью и отсутствием специфичности. Современные терапевтические методы часто не позволяют полностью восстановить потерю зрения или обнаружить серьезные нарушения глазных заболеваний на ранней стадии [2].

Наномедицина за последние годы стала одной из перспективных и динамично развивающихся областей науки [3]. Применение наноматериалов в медицине и фармакологии является приоритетным направлением, позволяющим решать самые актуальные проблемы. Большой интерес к наноматериалам обусловлен наличием у них уникальных физико-химических свойств, что позволяет создавать на их основе структуры с новыми механическими, оптическими и электрическими свойствами. Нанотехнологии все чаще применяются и в офтальмологии для медикаментозной терапии глазных заболеваний с использованием наноструктурных лекарств, тканевой инженерии и регенеративной медицины. Именно на этом и сосредоточено особое внимание в данном обзоре. Кроме того, рассматриваются вопросы безопасности применения наноструктур в офтальмологии и возможные дальнейшие перспективы развития наномедицины, касающиеся заболеваний органов зрения.

Наночастицы для доставки лекарств в офтальмологии

Доставка лекарств в органы зрения является одной из самых сложных задач при разработке различных систем адресной доставки лекарств. Для многих офтальмологических препаратов действенная система доставки, обеспечивающая максимальную терапевтическую эффективность, остается неудовлетворенной медицинской потребностью [4]. Несмотря на то что существует несколько традиционных инвазивных и неинвазивных методов лечения глаз, включая использование имплантатов, глазных капель и инъекций, все еще возникают осложнения, которые могут быть связаны либо с их низкой биодоступностью, либо с серьезными побочными эффектами [5]. Основная причина ограничения доставки лекарств — это множественные физические границы глазного яблока, которые состоят из эпителия роговицы и конъюнктивы, гемато-водянистого и гематоретинального барьера. Эти структуры ограничивают прохождение молекул и жидкостей к сетчатке [4]. Наночастицы из-за их размера и разнообразия используемых материалов являются идеальными кандидатами для использования в качестве систем доставки лекарств. Они способны преодолевать биологические барьеры, могут напрямую доставлять лекарства в целевой участок и обеспечивать замедленное высвобождение препарата [6]. Наиболее часто используемыми наночастицами являются синтетические полимеры (полимерные мицеллы, дендримеры, гидрогель), липиды (липосомы), белки (наночастицы альбумина) и даже неорганические соединения (наночастицы оксида церия, золота) [4, 7].

Наночастицы хитозана особенно хорошо подходят для доставки препаратов в структуры глазного яблока из-за их мукоадгезионных свойств [8]. Хитозан — это катионный полимер, который взаимодействует с отрицательно заряженным муцином, улучшая прекорнеальную задержку и создавая плотные контакты и тем самым увеличивая проницаемость лекарства через роговицу [9]. Так, L. Contreras-Ruiz и соавторы показали, что флуоресцентные наночастицы гиалуроновой кислоты и хитозана (fl-HA-CS NP), полученные путем ионотропного гелеобразования, могут служить эффективной системой доставки лекарственных средств для местного лечения заболеваний глазной поверхности [10]. Глазные капли, содержащие комплекс из хитозана, триполифосфата натрия и наночастиц гиалуроновой кислоты, а также антибиотик цефтазидим, проявляют мукоадгезивные свойства, взаимодействуя с муцином, улучшая всасывание и эффективность антибиотиков [11]. J.R. Costa и соавторы показали возможность лечения эндофтальмита, вызванного метициллинрезистетными Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis, даптомицином, доставленным мукоадгезивными наночастицами альгината, покрытого хитозаном (CS-ALG), размером 380—420 нм [12]. Проницаемость даптомицина через 4 ч составила 16% (наночастицы хитозана) и 9% (наночастицы CS-ALG) для монослоя клеток роговицы и 18% (наночастицы хитозана) и 12% (наночастицы CS-ALG) — для монослоя клеток сетчатки; продемонстрирована эпителиальная задержка препарата по сравнению с чистым препаратом.

A.N. ElMeshad и соавторы изучили потенциал Spanlastics (везикулярной системы носителя на основе сурфактанта) с частицами размером около 287 нм, нагруженными антимикотическим препаратом итраконазол для лечения грибковых кератитов, как офтальмологической системы доставки с улучшенной проницаемостью через роговицу [13]. Spanlastics показали 1,34-кратное увеличение количества итраконазола, проникающего через иссеченную роговицу крупного рогатого скота через 24 ч, по сравнению с обычными ниосомами. При антимикотическом исследовании выявлено значимое (p<0,05) увеличение зоны ингибирования культуры Candida albicans при применении Spanlastics по сравнению с порошком итраконазола при том же уровне концентрации (10 мг).

В другом исследовании [14] оценивалась эффективность катионных наночастиц лециплекса, приготовленных с использованием солевого фосфатидилхолина (SPC) и катионного поверхностно-активного вещества (CTAB/DDAB), по доставке карведилола на поверхность глаза для лечения глаукомы. Наночастицы имели сферическую форму, эффективность захвата составляла более 95%. Формула, состоящая из SPC и DDAB в молярном соотношении 1:1, показала наименьший размер частиц (16,04±1,2 нм), самое высокое значение дзета-потенциала (53,9±0,91 мВ) и самый высокий коэффициент проницаемости роговицы (0,1157 см/ч). Карведилол лециплекс снижал внутриглазное давление до нормального уровня у кроликов с глазной гипертензией через 30 мин, а продолжительность его действия составляла 24 ч, тогда как раствор карведилола снижал показатель до нормального значения через 60 мин, а продолжительность действия составляла 6 ч.

Наночастицы сополимера молочной и гликолевой кислот (PLGA) со средним размером около 132,8 нм, нагруженные интерлейкином-12 (IL-12-PNP), показали лучшую ингибирующую эффективность в отношении экспрессии фактора роста эндотелия сосудов A (VEGF-A) и матриксной металлопротеиназы 9 (MMP-9) в эндотелиальных клетках сетчатки крыс с диабетической ретинопатией по сравнению с IL-12 и пустыми наночастицами [15].

Наноносители на основе липидов (нанолипосомы) являются одним из наиболее биосовместимых и универсальных средств доставки лекарственных веществ в глазное яблоко [16]. Липосомы представляют собой самособирающиеся структуры, состоящие из липидных бислоев, которые охватывают водное ядро [4]. Фармакокинетические исследования in vivo разработанных с использованием различных типов фосфолипидов липосомальных препаратов ципрофлоксацина на кроликах-альбиносах показали, что липосомы демонстрируют повышенную концентрацию в водянистой влаге и в три раза более высокую биодоступность по сравнению с коммерческими глазными каплями ципрофлоксацина [17]. R. Zhang и соавторы показали, что интравитреальные инъекции такролимуса, инкапсулированного в липосомы, крысам с экспериментальным аутоиммунным увеоретинитом сохраняют терапевтическую дозу в глазных жидкостях в течение 14 дней, уменьшают внутриглазное воспаление и подавляют развитие аутоиммунного увеоретинита [18]. В исследовании H.F. Salem и соавт. [19] липосомы использовались в качестве носителя для наночастиц золота, покрытых противогрибковым препаратом флуцитозин. Наночастицы золота использовались в качестве контрастного агента, обеспечивающего отслеживание действия препарата в заднем сегменте глазного яблока для лечения грибкового внутриглазного эндофтальмита. С помощью компьютерной томографии было обнаружено, что частицы размером 135,1±12,0 нм со значением дзета-потенциала 42,5±2,12 мВ характеризовались большой глубиной внутриглазного проникновения (10,22±0,11 мм), а также высокой противогрибковой эффективностью in vivo.

Таким образом, несмотря на наличие подходящих лекарств для лечения офтальмологических заболеваний, все еще не решена проблема надлежащего подхода к их адресной доставке с наименьшими побочными эффектами. Нанотехнологии предлагают большие возможности для преодоления ограничений обычных систем доставки в глаза, включая высокую терапевтическую эффективность и низкую частоту побочных эффектов. Однако все еще не до конца изучены возможные негативные/токсические эффекты от применения наночастиц, что накладывает ограничение на их массовое внедрение.

Тканевая инженерия, нанопокрытия и наноскафолды для регенерации тканей глаза

Регенеративная медицина — сравнительно новое, но активно развивающееся направление, которое предполагает инновационные подходы и решения для восстановления поврежденных или утраченных тканей и органов. С развитием нанотехнологий инженерные подходы регенеративной медицины стали активно внедряться и в офтальмологию для лечения потери зрения, вызванной дегенеративными заболеваниями, травмами или инфекциями [20].

Современные нанотехнологические подходы в тканевой инженерии позволили создать нанокаркасы для выращивания трехмерных клеточных структур, включая массивы клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ), ганглиозных клеток сетчатки [21] для лечения повреждений сетчатки [22, 23]. Для формирования нанокаркаса, как правило, используется метод электроспиннинга с применением натуральных [24, 25], синтетических [26—28] или гибридных [29] биоразлагаемых полимеров. Подобные структуры наиболее близко воспроизводят естественную среду для роста клеток и их межклеточного взаимодействия, а также обеспечивают направленный рост клеток вдоль волокон и формирование нативной микроархитектуры [30]. Как правило, природные полимеры больше подходят для стимулирования прикрепления клеток и биологической активности, чем синтетические полимеры из-за их химического состава, однако имеют меньшую механическую прочность и более короткий период полураспада в сравнении с синтетическими матрицами [20]. В то же время легче спроектировать, функционализовать синтетические нанокаркасы и контролировать их механические и транспортные свойства [31].

Трансплантация клеток РПЭ перспективна для лечения возрастной макулярной дегенерации и болезни Штаргардта, однако остается высокая вероятность, что поврежденная или дегенерированная мембрана Бруха реципиента в качестве естественного субстрата не сможет поддерживать оптимальную выживаемость трансплантированных клеток с правильной клеточной организацией [32]. Каркасы РПЭ на основе таких натуральных веществ, как коллагеновые нановолокна [33, 34], желатин [35], хитозан, гиалуроновая кислота [36], фибрин [37], ламинин [38], имеют преимущество, поскольку максимально приближены к нативной ткани, что делает их многообещающими кандидатами для клинического использования. Эти каркасы соответствуют естественным физиологическим свойствам мембраны Бруха в нескольких ключевых областях: концентрация белков, морфология структуры, механические свойства и биосовместимость.

Например, методом Langmuir—Schaefer (LS) были получены тонкие пленки из коллагена человека, которые имели слоистую структуру с ориентированными волокнами, напоминающую архитектуру внутреннего коллагенового слоя и базальной мембраны Бруха. Показано, что созревание и функциональность эмбриональных стволовых клеток человека на таких структурах приводит к повышенным барьерным свойствам РПЭ по сравнению с обычно используемым методом культивирования [34]. Комбинация технологий Breath figure (BF) и LS позволила создать биомиметические биоразлагаемые биоматериалы для культивирования эмбриональных стволовых клеток РПЭ человека. Полученные материалы были пористыми и полупроницаемыми, но имели гладкую и гидрофильную поверхность благодаря отложению слоев коллагена I и IV. В сравнении с контрольными образцами было показано, что наноструктурное состояние биоматериала крайне благоприятно для показателей адгезии, распространения, морфологии, экспрессии и функции белка стволовых клеток РПЭ. Подобные технологии могут стать основой для производства базальных мембранных протезов для заместительной терапии РПЭ при лечении дегенеративных заболеваний глаза, таких как возрастная макулярная дегенерация [39].

Также было предложено использовать в качестве субстрата для выращивания РПЭ нанокаркасы на основе бактериальной целлюлозы. Высушенные нагреванием подложки бактериальной целлюлозы были модифицированы путем ацетилирования и адсорбции полисахаридов с использованием хитозана и карбоксиметилцеллюлозы. Данная модификация поверхности бактериальной целлюлозы значительно усилила адгезию и пролиферацию клеток РПЭ [24].

Гибридные наноструктурные каркасы могут сочетать свойства как натуральных, так и синтетических нановолокон, создавая каркас со всеми преимуществами натурального с точки зрения белкового состава и естественного внешнего вида, а также приспособляемости и широкой вариабельности синтетических каркасов. P. Xiang и соавт. [29] создали гибридный каркас со средним диаметром волокна 165±85 нм, представляющий собой комбинацию фиброина шелка бабочки Antheraea pernyi, поликапролактона и желатина. Клетки РПЭ человека, инкубируемые на таких каркасах, показали более высокую скорость роста, чем при использовании только пластика для тканевой культуры или волокна поликапролактона. Выращенные на этих гибридных волокнах клетки показали типичный паттерн экспрессии генов-сигнатур РПЭ (CRALBP, PEDF, VEGF, MITF и PMEL17), повышенную экспрессию секретируемых факторов и пониженную экспрессию медиаторов воспаления. Кроме того, в течение 12 нед культивирования клетки РПЭ на гибридных каркасах имели полигональную морфологию и способность фагоцитировать внешние сегменты фоторецепторов свиней, а также развили апикальные микроворсинки. При имплантации субсклерально мембраны хорошо приживались, не вызывая воспаления сосудистой оболочки и сетчатки [29].

P.H. Warnke и соавт. [32] разработали ультратонкие трехмерные мембраны из коллагена типа I и сополимера молочной и гликолевой кислоты (PLGA) методом безыгольного электроспиннинга. Нанофибриллярные трехмерные структуры имитируют фибриллярную архитектуру нативного внутреннего коллагенового слоя человеческой мембраны Бруха. Клетки РПЭ человека, выращенные на таких мембранах, демонстрировали правильно ориентированный монослой с многоугольной формой ячеек и многочисленными пластинчатыми микроворсинками на апикальных поверхностях. Клетки РПЭ образовывали плотные контакты и экспрессировали белок RPE65. На плоской двухмерной пленке PLGA и покровном стекле, которые использовались в качестве контролей, микроворсинки на поверхности клеток РПЭ были гораздо менее развиты и упорядочены. Таким образом, было показано, что такие мембраны могут стать многообещающим средством для имплантации функционального монослоя клеток РПЭ в субретинальное пространство у пациентов с возрастной макулярной дегенерацией или болезнью Штаргардта, поскольку позволяют создавать монослой РПЭ с сохранением естественных биофункциональных характеристик.

Немаловажным фактором успешного роста и дифференцировки клеток является структура нанокаркасов — ориентация волокна в структуре, его пористость и диаметр. Например, K.E. Kador и соавт. [30] разработали трансплантат для восстановления структуры слоя ганглиозных клеток, которые в естественных условиях не способны к регенерации после травмы. Были изготовлены методом электроспиннинга нанокаркасы, имитирующие радиально ориентированные нервные волокна, и выяснилось, что около 72% аксонов росли вдоль нановолокон. Однако ориентированные нанокаркасы не всегда подходят для пролиферации и дифференцировки клеток. Так, S. Nadri и соавт. [40] обнаружили, что мезенхимальные стволовые клетки конъюнктивы (CJMSCs), культивируемые на ориентированных нановолокнах поли-L-молочной кислоты (PLLA), экспрессировали большее количество фоторецепторов сетчатки, но имели более плотный тканевый матрикс и гладкую поверхность, что препятствовало дифференцировке CJMSCs в нейрональных клетках сетчатки. В то же время экспрессия генов в CJMSCs, специфичных для палочковых фоторецепторов на нанокаркасах, имеющих хаотичное расположение волокон, была значительно выше, чем на ориентированных [40].

Диагностика глазных заболеваний с применением нанотехнологий

Существуют различные виды диагностических исследований, используемых в клинической практике при лечении глазных заболеваний, такие как оптическая когерентная томография (ОКТ), флуоресцеиновая ангиография, позитронно-эмиссионная томография, магнитно-резонансная томография, ультразвуковая и конфокальная биомикроскопия [2]. Они играют значительную роль в своевременном установлении диагноза и выздоровлении больных, однако из-за погрешностей в визуализации, чувствительности и разрешения изображения каждый из этих подходов имеет определенные ограниченные преимущества для диагностики глазных заболеваний. В офтальмологии существует неудовлетворенная потребность в новых методах для визуализации глубоких тканей глаза — с высоким пространственным разрешением, позволяющих выявить патофизиологические маркеры заболеваний на молекулярном уровне до того, как будут обнаружены какие-либо морфологические или структурные аномалии. Успехи нанотехнологии повлекли за собой расширение видов наночастиц, применяемых в биосенсорах для увеличения контраста изображения биологических объектов. В последнее время разработаны новые наносистемы, демонстрирующие способность повышать качество изображений и обнаруживать нарушения сетчатки глаза [41, 42].

Наночастицы золота (AuNP) имеют большие перспективы в качестве контрастных агентов для молекулярной визуализации глаза, поскольку по своей природе инертны в биологических и физиологических жидкостях. V.P. Nguyen и соавторы вводили кроликам AuNP размером 20 нм, покрытые полиэтиленгликолем, внутривенно. Эти AuNP показали высокий контраст при фотоакустической микроскопии и ОКТ. При циркуляции AuNP в сосудах хориоидеи и сетчатки у живых кроликов фотоакустический сигнал кровеносных сосудов увеличивался на 82%. Вводимые AuNP дают возможность обнаружения кровеносных сосудов с помощью фотоакустической микроскопии. Кроме того, AuNP облегчили визуализацию неоваскуляризации сетчатки и мониторинг динамических изменений, которые происходят в результате окклюзии вен сетчатки у живых кроликов [42].

Коллоидные AuNP служат многообещающими контрастными агентами в фотоакустической визуализации, однако их полезность ограничена из-за нахождения пика поглощения в видимом окне, перекрывающемся с пиком гемоглобина. V.P. Nguyen и соавторы предлагают сверхчистые кластеры цепочечных золотых наночастиц (CGNP) с пиковой длиной волны красного смещения 650 нм, которые позволят преодолеть это ограничение [43]. Синтезированные CGNP демонстрируют превосходную биосовместимость и фотостабильность. Эти наночастицы конъюгированы с пептидами аргинин-глицин-аспарагиновой кислоты (RGD; кластеры CGNP-RGD) и проверены на 12 живых кроликах для выполнения мультимодальной фотоакустической микроскопии и ОКТ для визуализации хориоидальной неоваскуляризации. С помощью указанных наночастиц можно получить трехмерное изображение посредством растрового сканирования (256×256 пикселей) в течение 65 с. Внутривенная инъекция кластеров CGNP-RGD обеспечивала 17-кратное увеличение сигнала фотоакустической микроскопии и увеличение сигнала ОКТ на 176%. Гистологические исследования указывает на то, что кластеры CGNP биодеградируемы, что может способствовать их выведению из организма.

Наночастицы перспективны и в качестве агентов для отслеживания трансплантированных клеток с целью оценки эффективности заместительной терапии клетками сетчатки. Предшественники фоторецепторов, меченные AuNP, трансплантировали в стекловидное тело и субретинальное пространство крыс и отслеживали в течение более месяца с помощью ОКТ, компьютерной томографии и флуоресцентной визуализации глазного дна. Такой мультимодальный подход к визуализации позволил проводить долгосрочное отслеживание и оценку выживаемости клеток в сетчатке и стекловидном теле с высоким разрешением. При этом токсического воздействия на сетчатку AuNP не оказывали, что позволяет сделать вывод о возможности их использования для отслеживания клеток сетчатки в целях обеспечения более эффективной терапии клетками сетчатки у людей [44]. Положительные результаты использования AuNP продемонстрированы и в качестве платформы для ультразвуковой/фотоакустической визуализации с целью продольного отслеживания стволовых клеток в переднем отделе глаза при терапии глаукомы [45].

Ограничения и недостатки применения наночастиц в офтальмологии

Наночастицы и наноматерилы помимо достоинств имеют много недостатков и ограничений. Малый размер и большая площадь поверхности наночастиц могут привести к агрегации клеток, что затрудняет физическую обработку. Наночастицы диаметром от 10 нм могут оставаться в клетках и индуцировать хроническую воспалительную реакцию и фиброз тканей. Остается неясной токсичность наночастиц для нервных клеток сетчатки [46]. Исследования, которые провели E. Söderstjerna и соавторы, показали, что нейротоксическое действие наночастиц особенно губительно для фоторецепторов. Следовательно, все наночастицы, которые используются для доставки в глаз, особенно в сетчатку, должны быть тщательно оценены в соответствующих моделях глаза и сетчатки [47].

В настоящее время не удалось полностью избежать активации клеток ретикулоэндотелиальной системы при введении наночастиц [48]. Во время циркуляции по кровотоку наночастицы могут «обрастать» белками плазмы крови, их поглощают иммунные клетки — макрофаги, при этом внутриклеточная деградация наночастиц может вызвать цитотоксические эффекты. Следовательно, важной функцией покрытия наночастиц является повышение их биосовместимости. Для продления срока пребывания наночастиц в организме они покрываются нейтральными и гидрофильными материалами (полиэтиленгликоль, декстран, гепарин, поливинилэтанол, гепарин, высшие карбоновые кислоты), увеличивая циркуляционное время существования с минут до часов и даже дней [49]. Так, показано, что покрытие декстраном препятствует опсонизации магнитных наночастиц клетками ретикулоэндотелиальной системы при введении их в кровоток. Поверхностная модификация полиэтиленгликоля снижает поглощение наночастиц макрофагами и благодаря наличию полярных и неполярных группировок способствует эффективному проникновению через мембрану клетки [50]. Заключение наночастиц в фосфолипидный бислой (липосомы) обеспечивает эффективное взаимодействие наноматериала с клеточной мембраной [51]. Альтернативным вариантом достижения биосовместимости является уменьшение размера частицы, однако, несмотря на все усилия, не удается полностью избежать воздействия иммунной системы, а нежелательное перемещение в другие участки организма может создавать токсическое воздействие.

Несмотря на то что использование магнитного нацеливания посредством наночастиц открывает широкие перспективы, существует ряд проблем, препятствующих их широкому клиническому использованию, среди которых дисциркуляторные и некротические изменения в печени, почках и сердце, а также развитие дисциркуляторных изменений в легких и селезенке [52]. Также к осложнениям использования магнитных наночастиц относится риск эмболии сосудов микроциркуляторного русла из-за скопления магнитных частиц в пределах сосудистого региона в области нацеливания. Не решены вопросы о механизме выведения наночастиц из организма или их возможной биодеградации. Другая проблема связана с тем, что высокая эффективность магнитного нацеливания, показанная в культурах клеток и на лабораторных животных, не всегда может быть достигнута при использовании терапевтических комплексов на основе наночастиц у человека, так как требуется наложение очень сильных магнитных полей, что не всегда возможно, а в некоторых случаях даже опасно для здоровья.

Несмотря на все ограничения и недостатки наночастиц, которые реагируют на незначительные изменения в локальной клеточной среде, они имеют потенциал для разрешения многих проблем. Перед продолжающимися исследованиями будут поставлены задачи, которые включают разработку протоколов тестирования токсичности, повышение биосовместимости, таргетирование, транспортировку и высвобождение, контроль взаимодействия с биологическими барьерами, обнаружение и мониторинг уровня воздействия.

Заключение

Таким образом, нанотехнологии имеют большой потенциал применения в терапии и диагностике глазных заболеваний, однако необходима более полная и глубокая токсикологическая оценка наночастиц, чтобы понять основной механизм их действия на ткани глаза человека. Дальнейшие исследования должны улучшить понимание основ наночастиц, создание моделей (in vivo) заболеваний, аутентичных для человека, и способствовать разработке оптимальных путей доставки, в том числе неинвазивных. Для адресной доставки лекарственного вещества или гена биомаркеры являются наиболее распространенными типами мишеней. В результате должны быть полностью изучены биомаркеры, связанные с глазными заболеваниями, а также клеточный и молекулярный механизмы их функций. Наконец, могут быть введены универсальные системы, которые будут сочетать диагностические и терапевтические функции (тераностика), чтобы обеспечить визуальное отслеживание во время лечения глазных заболеваний.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.