В настоящее время лечение грибкового поражения роговицы является проблемой с нарастающей актуальностью, и, по-видимому, спада заболеваемости ожидать не стоит. Предположительно, ежегодная заболеваемость грибковым кератитом составляет 1 480 916 случаев (1 036 641—1 925 191). Подсчет глобальных случаев удаления глаз в результате агрессивного офтальмомикоза выявил, что к данному методу прибегают в 8—11% случаев, что представляет собой ежегодную потерю 84 143—115 697 глаз [1]. Примерно 10—25% случаев кератомикозов осложняются перфорацией или требуют хирургического лечения, в то время как, по крайней мере, 60% пациентов даже после лечения остаются монокулярно слепыми, что соответствует примерно 800 тыс. человек в год [2—5].
На мировом фармацевтическом рынке наиболее популярными глазными каплями для лечения грибковых кератитов является 5% суспензия натамицина. Всемирная организация здравоохранения включила глазные капли натамицина в перечень основных лекарственных средств для лечения грибковых кератитов, и все же выбор противогрибковых глазных капель во всем мире по-прежнему остается скудным [1, 6]. Natacyn 5% одобрен Американской ассоциацией офтальмологов и Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (U.S. Food & Drug Administration, FDA) для лечения окуломикозов и рекомендован как средство первой линии в терапии грибковых кератитов [7, 8]. Этот препарат нелицензирован и недоступен для применения в Российской Федерации. Спектр противогрибкового действия глазных капель Natacyn 5%, судя по инструкции, включает грибы рода Candida, Aspergillus, Cephalosporium, Fusarium и Penicillium [9].
На зарубежном рынке имеются также офтальмологические растворы — производные флуконазола 0,3%. Применение флуконазола в офтальмологии ограничено оппортунистическими микозами, в том числе вызванными Candida spp., реже — Cryptococcus neoformans и Coccidioides immitis, Microsporum spp. и Trichophyton spp., Blastomyces dermatidis, Histoplasma capsulatum, значимость которых подтверждается лишь единичными сообщениями в литературе [10].
В нашей стране лечение кератомикозов возможно только методами off-label, что включает инстилляции 2% раствора флуконазола для внутривенного введения, разведенных лиофилизатов 1% вориконазола, 0,05—0,15% амфотерицина B, инстилляции растворенных растертых таблеток нистатина, а также системную терапию пероральным и парентеральным введением антифунгальных препаратов [6, 10, 11]. Поиск эффективных и безопасных методов лечения грибкового кератита стал основанием для данного экспериментального исследования.
Наиболее актуальными для нашего региона патогенами грибкового кератита являются Fusarium spp. По результатам локального исследования чувствительности грибковых агентов, вызвавших кератомикозы у наших пациентов, обнаружилась 100% чувствительность к тербинафину [12].
Материал и методы
Эксперименты in vivo одобрены локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «Казанский ГМУ» Минздрава России (протокол №1 от 04.02.20).
Экспериментальное исследование проводили на 15 кроликах (30 глаз) породы советская шиншилла с применением культуры грибов Fusarium spp. 1,0·106 КОЕ/мл. На базе лаборатории микологии КНИИЭМ приготовлен инокулюм с использованием чистых пятисуточных культур грибов Fusarium solani, выросших на плотной питательной среде Сабуро. Каждому кролику на двух глазах был смоделирован грибковый кератит собственным методом [13, 14].
Экспериментальные животные рандомно были разделены на 3 группы по 5 кроликов (по 10 глаз в каждой группе) — две опытные и одна группа контроля; 1-я группа получала лечение 0,1% раствором вориконазола по 1 капле 4 раза в сутки, 2-я группа — 0,1% суспезией тербинафина по 1 капле 4 раза в сутки, 3-я группа (группа контроля) лечения не получала.
Свойства и эффективность суспензии тербинафина изучены совместно с коллективом лаборатории микологии ФБУН Казанского НИИ эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора (КНИИЭМ), АО «Татхимфармпрепараты». Дополнительно исследованы минимальная ингибирующая концентрация, проницаемость, токсичность и безопасность, динамика морфологических изменений роговичной ткани при использовании новой суспензии тербинафина. Экспериментальные исследования свойств нового раствора проведены совместно с кафедрой микробиологии и кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии ФГБОУ ВО «Казанский ГМУ»; Институтом органической и физической химии им. А.Е. Арбузова (обособленное структурное подразделение ФГБУН «Федеральный исследовательский центр Казанский научный центр РАН» — лаборатория химико-биологических исследований); Коллективным спектро-аналитическим Центром изучения строения, состава и свойств веществ и материалов; Центром экспериментальной хирургии ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана».
Минимальная ингибирующая концентрация тербинафина в исследовании на Fusariun spp. составляет 6,25 мкг/мл (0,000625%). При разработке лекарственной формы установлена концентрация тербинафина, способствующая равномерному его распределению, которая составила 1000 мкг/мл (0,1%), что и было взято в основу экспериментального исследования.
До начала эксперимента все животные были обследованы при помощи биомикроскопии, проведена оптическая когерентная томография переднего отрезка глаза, определена нормобиота конъюнктивы и роговицы здорового глаза. Данные объективных исследований отклонений от нормы не выявили.
На 12—14-й день от начала моделирования фиксировали признаки грибкового кератита, что подтверждалось ростом культур грибов Fusarium из мазков пораженных глаз и электронной микроскопией соскобов с роговицы. Экспериментальное лечение начинали при физикальном и лабораторном подтверждении заражения (рис. 1—3).
Рис. 1. Кератит с изъязвлением роговицы у кролика в результате экспериментального заражения по описанной методике.
Рис. 2. Культуральные признаки роста Fusarium spp.
Рис. 3. Результат электронной прямой микроскопии. Структурно-морфологические элементы грибов — гифы Fusarium spp. Ув. 400.
Клиническую динамику течения заболевания оценивали с помощью биомикроскопии, фоторегистрации переднего отдела глаза, культурального посева и микроскопии соскобов. Оценка воспалительных изменений переднего отдела глаза проводилась при помощи балльной шкалы [15].
Офтальмологический осмотр, культуральный посев, микроскопию соскобов с роговицы, оценку состояния глаза по Шкале оценки воспалительных изменений переднего отдела глаза (см. таблицу) проводили ежедневно — на 1, 2, 3, 4-е сутки лечения.
Шкала оценки воспалительных изменений переднего отдела глаза [15]
| Симптом | Оценка, баллов |
| Раздражение глаза: отек век, инъекция, отделяемое | 0 — нет, отделяемое отсутствует 1 — легкой степени, отделяемое отсутствует 2 — средней степени, скудное отделяемое 3 — ярко выражено, есть отделяемое |
| Увеальные явления | 0 — нет 1 — опалесценция (клетки во влаге передней камеры) 2 — фибрин в передней камере и/или отек радужки 3 — гипопион в передней камере, выраженная отечность радужки |
| Диаметр язвенного дефекта | 0 — нет 1 — 1 мм 2 — 2 мм 3 — 3 мм 4 — 4 мм 5 — 5 мм |
| Максимальный суммарный балл = 11 | |
Результаты
Микрофлора здорового глаза представлена различными комбинациями Aspergillus flavus 102 КОЕ/мл; Penicillium expansum 102 КОЕ/мл; S. aureus 101 КОЕ/мл; Enterobacteriaceae 101 КОЕ/мл. Грибы рода Fusarium spp. не были обнаружены ни в одном из посевов мазков здоровых глаз.
На старте лечения в зависимости от группы был выполнен анализ динамики раздражения глаз. В 1-й группе в 60% случаев отмечалось раздражение средней степени и в 40% — ярко выраженное. Во 2-й группе раздражение средней степени на старте лечения зафиксировано в 40% случаев, ярко выраженное — в 60%. В 3-й группе раздражение средней степени отмечалось у 60%, ярко выраженное — у 40%. Легкая степень раздражения по результатам моделирования не отмечалась ни в одной группе. На 1-е сутки лечения в 1-й группе легкая степень раздражения отмечалась у 10%, средняя степень — у 80%, ярко выраженное раздражение — у 10%. Во 2-й группе перед началом лечения легкая степень раздражения не определялась, средняя зафиксирована у 80%, ярко выраженная — у 20%. В 3-й группе без лечения раздражение легкой степени не отмечалось, средняя степень была у 80%, ярко выраженная — у 20%. На 2-е сутки лечения в 1-й группе легкая степень раздражения отмечалась у 50%, средняя степень — у 50%, ярко выраженное раздражение не зафиксировано. Во 2-й группе легкая степень выявлена у 40%, средняя — у 60%, ярко выраженная не зафиксирована. В 3-й группе раздражение легкой степени выявлено у 30%, средней степени — у 70%, ярко выраженное не зафиксировано. На 3-и сутки лечения в 1-й группе легкая степень раздражения отмечалась у 100% животных. Во 2-й группе легкая степень выявлена также у 100%. В 3-й группе раздражение легкой степени выявлено у 80%, средней степени — у 20%. На 4-е сутки лечения в 1-й группе воспалительных явлений не отмечалось у 80%, легкая степень выявлена у 20%. Во 2-й группе воспалительных явлений не отмечалось у 100% животных. В 3-й группе раздражение легкой степени выявлено у 40%, средняя степень — у 60% (рис. 4). Различия показателей статистически значимы (p<0,05).
Рис. 4. Динамика воспалительных изменений в группах лечения вориконазолом (а), тербинафином (б), контроля (в).
В соответствии с полученными данными на этапе раздражения глаза (до лечения), в сравнениях показателей на этапе раздражения глаз на 1, 2, 3-и сутки нам не удалось выявить значимых различий (p=0,585; p=0,663; p=0,659; p=0,117). В ходе анализа показателя на этапе раздражения глаза (4-е сутки) нами были выявлены статистически значимые различия (p<0,001), используемый метод — χ2 Пирсона. В ходе анализа в группе отсутствия лечения, а также в 1-й и 2-й группах были выявлены статистически значимые изменения (p<0,001), используемый метод — критерий Фридмана.
В процессе сравнения показателя на этапе увеальных явлений (0-е сутки) не удалось выявить статистически значимых различий (p=0,301). В ходе сравнения показателя на этапе увеальных явлений (1, 2, 3, 4-е сутки) были установлены существенные различия (p=0,012; p<0,001; p<0,001; p<0,001). В процессе анализа в 3-й группе отмечались статистически значимые изменения (p=0,017), используемый метод — Q-критерий Кохрена. Анализ показал, что в 1-й и 2-й группах были выявлены статистически значимые изменения (p<0,001), используемый метод — критерий Фридмана (рис. 5).
Рис. 5. Динамика наличия фибрина в передней камере в зависимости от группы.
Анализ динамики язвенного дефекта в зависимости от группы показал наличие дефекта диаметром 3 мм в 1-й и 2-й группах на старте лечения у 30%, в 3-й группе — у 20% животных. Язвенные дефекты диаметром 2 мм зафиксированы на старте лечения в 1-й и 2-й группах у 70%, в 3-й группе — у 20%. Отсутствие дефекта при моделировании грибкового кератита данным способом не предусмотрено. На 1-е сутки эксперимента язвенный дефект диаметром 2 мм в 1-й группе зафиксирован в 50%, во 2-й группе — в 20%, в 3-й группе — в 50% случаев. Дефект диаметром 1 мм зафиксирован у 50% животных в 1-й группе, у 80% во 2-й группе и ни в одном случае в 3-й группе. Полной эпителизации на данный период не зафиксировано. На 2-е сутки лечения язвенный дефект диаметром 3 мм в 1-й и 2-й группах не зафиксирован, в 3-й группе он сохранялся у 50%. Дефект диаметром 2 мм в 1-й группе встречался в 10% случаев, во 2-й группе — не встречался, в 3-й группе — в 50%, дефект диаметром 1 мм — по 40% в 1-й и 2-й группах и не наблюдался в 3-й группе. Полная эпителизация достигнута в 50% случаев лечения в 1-й группе и в 60% случаев во 2-й группе. В 3-й группе полной эпителизации не достигнуто. На 3-и сутки от начала лечения полная эпителизация язвенного дефекта достигнута в 100% случаев в 1-й и 2-й группах (рис. 6). Третья группа — группа контроля сохраняла распределение язвенных дефектов диаметром 3 и 2 мм в равных долях до окончания эксперимента, при этом в четырех глазах контрольной группы (40%) развилась перфорация роговицы (рис. 7), что, на наш взгляд, является сопоставимым прогнозом исхода грибкового кератита при несвоевременно начатом, неадекватном лечении или его отсутствии в клинических случаях. Различия показателей статистически значимы (p<0,05).
Рис. 6. Динамика регенерации язвенного дефекта в зависимости от группы.
Рис. 7. Перфорация язвы роговицы у кролика в группе контроля.
Микологический посев мазка с роговицы производился до начала лечения, на 1, 3, 4-е сутки после начала лечения. После заражения в 100% зараженных глаз определился рост Fusarium spp. (104—105 КОЕ/мл). На 1-е сутки лечения во всех группах высев Fusarium spp. обнаружен в 100% случаев. На 3-и сутки в 1-й группе рост грибов выявлен в 80% глаз, однако с заметным снижением концентрации — 101 КОЕ/мл. Во 2-й группе рост Fusarium spp. обнаружен в 60% случаев в концентрации 101 КОЕ/мл. В 3-й группе достигнут рост в 80% случаев в 104 КОЕ/мл и в 20% — 105 КОЕ/мл. На 4-е сутки лечения в 1-й и 2-й группах рост флоры не обнаружен (рис. 8). К тому же во 2-й группе воспалительных явлений не отмечалось у 100% животных. В 3-й группе в 100% случаев обнаружен рост Fusarium spp. в 104 КОЕ. Различия показателей статистически значимы (p<0,05).
Рис. 8. Динамика высева Fusarium spp. в зависимости от группы.
Заключение
В экспериментальном лечении грибкового кератита в группе тербинафина воспалительные изменения купированы на 3-и сутки, увеальные явления у большей группы наблюдения — на 2-е сутки, динамика разрешения опалесценции, фибрина и гипопиона в передней камере сопоставимы с группой лечения вориконазолом. Скорость эпителизации выше в сравнении, начиная с первых суток, санация грибкового инфильтрата достигнута быстрее, чем в группе сравнения, и зафиксирована на 2-е сутки от начала лечения.
Таким образом, полученные статистически значимые результаты эффективной и быстрой санации инфекционного очага подтверждены культуральным и цитоскопическим методами исследования. Клиническое выздоровление достигнуто в том числе за счет ускоренной регенерации с минимальным риском формирования грубого помутнения при грибковом кератите, вызванного Fusarium spp. (рис. 9).
Рис. 9. Исход грибкового кератита в группе лечения тербинафином (а) и в группе лечения вориконазолом (б).
Важное конкурентное преимущество 0,1% суспензии тербинафина заключается в том, что разработана его форма для местного применения в офтальмологии. Преимущество местного применения 0,1% суспензии тербинафина обосновано приведенной совокупностью признаков и результатов, однако полученные данные могут быть предложены для внедрения в практику после соответствующих клинических исследований.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: Н.Д., А.С.
Сбор и обработка материала: Н.Д., А.С., С.Л., А.А., А.А.
Написание текста: Н.Д., А.С.
Редактирование: Н.Д., А.С..С.Л., А.А., А.А.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.