Введение
В повседневной клинической практике основными критериями оценки состояния стекловидного тела (СТ) являются такие характеристики, как прозрачность и гомогенность. При изменениях, которые, как правило, обозначают термином «астероидный гиалоз», посредством биомикроскопии выявляют множественные точечные включения в СТ в виде желтовато-белых блестящих рефлектирующих частиц. При прохождении направленного локального пучка света через СТ в местах локализации этих отложений отмечают усиление цветовой и световой яркости оптического изображения. Включения в большом числе случаев регистрируют по всему объему СТ как эхопозитивные элементы высокой плотности и округлой формы. Происхождение и условия формирования указанных изменений СТ до настоящего времени полностью так и не объяснены.
Впервые подобные клинико-морфологические изменения СТ продемонстрированы A. Benson в 1894 г. Для характеристики этих изменений предложены различные термины («астероидный гиалит», «астероидная гиалопатия») [1—3]. Согласно современным представлениям, такие обозначения являются не совсем точными, поскольку не отражают сути изменений, происходящих в СТ [4—5]. Современный термин «астероидный гиалоз» (АГ) характеризует дегенеративные изменения СТ системного невоспалительного генеза в виде гиалоидных структур, заключенных в аморфный матрикс СТ, химическую основу которых составляют кальций и фосфор. В современной литературе эти отложения обозначают как астероидные тела (АТ, англ. asteroid bodies) [6—9]. Обращает на себя внимание тот факт, что исследователи, изучавшие вопросы распространенности, расовой и возрастной предрасположенности, а также морфологических особенностей АГ, отмечали, что его формирование происходит в условно здоровом СТ [6, 10—12].
В результате морфологических исследований выявлено, что АТ состоят из содержащего кальций липида и могут быть охарактеризованы как округлые образования, обладающие двойным лучепреломлением, нерастворимые в растворителях жира, но растворимые в смеси разбавленной соляной кислоты и липидных растворителей [6]. Отмечено положительное окрашивание АТ такими соединениями, как альциановый синий, коллоидное железо и муцикармин. По мнению авторов исследования, АТ могут формироваться в результате особого типа дегенерации коллагенового остова СТ. При этом тесная связь волокон СТ с АТ является характерной особенностью АГ, и по гистологическим признакам можно выделить две формы процесса. Локальные изменения СТ без признаков острого или хронического воспаления могут быть отнесены к отложениям I типа. При отложениях II типа АТ окружены коллагеновыми фибриллами с множественными клеточными элементами, в том числе воспалительного ряда.
С помощью рентгеновского микроанализа показано, что кальций присутствует в АТ в виде комплекса фосфата (апатита). Электронная микроскопия позволила выявить так называемые сателлитные АТ, состоящие из нескольких округлых частиц одинакового размера. Сателлиты АТ изначально кристаллизуются из «семян», образующихся в перенасыщенном СТ, что приводит к формированию более крупных образований. Формирование слоя липидов является результатом их осаждения на тонкие мембранные поверхности и частично объясняет содержание в АТ различных уровней липидов. При электронно-дифракционном анализе отложений определено присутствие гидроксиапатита кальция и, возможно, других форм кристаллов фосфата кальция. Высказано предположение о том, что формирование АТ является результатом некоторого смещения баланса биофизических и биохимических процессов в СТ, что приводит к локальному переходу части его состава из жидкой фазы в «более твердую» [4].
При сравнении образцов искусственного гидроапатита, полученных in vitro и содержащих комплекс химических элементов и образований (Na, K, Ca, Mg, HCO2, Cl, HPO4, SO4) с частицами АТ, подтверждена апатитоподобная структура последних [9]. Авторы исследования предположили, что АГ может возникать не только вследствие изменения ионного напряжения в СТ, но и в результате изменений структуры матрикса СТ вследствие локального проявления литиаза в процессе старения человеческого организма. В других исследованиях показана тесная связь формирования АТ с изменениями ионного состава СТ [7, 9]. По мнению авторов, эта связь может являться постоянной характеристикой всех проявлений АГ.
В экспериментальном исследовании у собак, питающихся галактозой, выявлены двусторонние изменения СТ, характерные для АГ, в срок 36—48 мес после начала эксперимента. Наряду с этим отмечены изменения сетчатки с элементами неоваскуляризации, характерные для диабетической ретинопатии [13].
Следует отметить, что распространенность АГ не позволяет оперировать в исследованиях большими объемами образцов СТ. Перспективы фундаментальных исследований, направленных на изучение изменений СТ при АГ, могут быть связаны с анализом особенностей формирования и химического состава комплексов АТ, маркированием ими опорно-каркасных и мембранных структур СТ, невидимых в других условиях [14—18]. Оптимальным методом изучения, позволяющим сочетать топографические наблюдения с минимальными искажениями, является сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) в режиме низкого вакуума. При этом необходимо решение двух основных задач: это забор образцов СТ в условиях, максимально приближенных к исследованиям in vivo, и разработка алгоритма СЭМ, обеспечивающего возможность анализа нативной структуры СТ.
Цель исследования — оценить структуры СТ при АГ на основе сканирующей электронной микроскопии в режиме низкого вакуума.
Материал и методы
Современные технологии витреоретинальной хирургии обеспечивают возможность интраоперационного забора образцов в условиях минимального гидратирования СТ. Материалом данного исследования явились образцы СТ, полученные в результате витрэктомии из передней и средней частей стекловидной камеры у 7 пациентов в возрасте от 62 до 72 лет с витреомакулярным тракционным синдромом. Во всех случаях клинические проявления АГ (наличие множественных точечных эхопозитивных включений в СТ) выявлены в процессе дооперационного обследования и отнесены к проявлениям АГ I типа. Образцы СТ объемом 0,6—0,9 мл помещали в стерильный шприц и сохраняли в условиях гипотермии в течение не более 24—48 ч после оперативного вмешательства.
С целью полноценной оценки внутренней структуры СТ и особенностей АТ использован оригинальный алгоритм, который заключается в исследовании частично разведенного физиологическим раствором образца СТ. Таким образом, в процессе СЭМ образцы не подвергали каким-либо воздействиям, связанным с фиксацией, тотальным обезвоживанием, окрашиванием или центрифугированием.
Для морфологической оценки структурных элементов СТ использовали принцип так называемого бужирования, который заключается в частичном разделении фракций гелеобразной ткани с помощью струи 0,9% раствора NaCl. Этот прием позволил на следующем этапе подготовки образцов механически вытягивать из капли СТ белковые пленчатые и нитевидные структуры, в нормальном состоянии связанные с другими белковыми образованиями и в связи с этим недоступные для самостоятельного изучения. Втягивание проводили иглой с визуальным контролем под биомикроскопом. Выделенные из общей массы СТ отдельные форменные элементы длиной от 1 до 9 мм укладывали рядом с каплей на поверхность углеродной ленты для дальнейшего изучения с использованием СЭМ (рис. 1а, 1б). Критериями пригодности выведенных из капли СТ структур для дальнейшего изучения служили воспроизводимость макроморфологии и механическая устойчивость при вытягивании. Описанным методом для дальнейших исследований удалось подготовить образцы СТ в пяти случаях из семи.
Рис. 1. Изображения препарата образца стекловидного тела с выведенным за его пределы гиалоидным тяжем.
а — биомикроскопическое изображение препарата в процессе пробоподготовки; б — обзорное изображение, полученное на сканирующем электронном микроскопе (режим низкого вакуума — EP=70 Па при ускоряющем напряжении 20 кВ). Выделенный участок соответствует полю зрения на изображении а. Масштабный отрезок — 200 мкм.
СЭМ образцов СТ проводили, используя электронный микроскоп Zeiss EVO LS 10 (Carl Zeiss AG, Германия). Исследование осуществляли в режиме низкого вакуума (EP=70 Па) при ускоряющем напряжении 20 кВ и токе на образце 14—110 пА. Для оценки морфологических изменений использовали два детектора — вторичных и обратно-рассеянных электронов (VPSE и BSD соответственно). Рабочее разрешение микроскопа — в диапазоне 4,25—0,06 мкм/точка. Дополнительно оценен химический состав посредством энергодисперсионного спектрометра (ЭДС — детектор Max 50 Oxford, Великобритания), установленного на микроскоп.
Результаты и обсуждение
Во всех случаях выделенные из образцов СТ удлиненные элементы обладали структурной организацией, в которой условно можно выделить четыре порядка (рис. 2).
Рис. 2. Схема взаимоотношений доступных для визуализации структурных элементов стекловидного тела различных порядков (I—IV, объяснения в тексте).
Первый порядок — непосредственно удлиненные структуры, или гиалоидные тяжи, характерной особенностью которых является «трубчатое» строение. В связи с тракционными деформациями при вытягивании исходные морфометрические характеристики этих структур (извитость, диаметр, диаметр просвета, наличие изолированных полостей) не могли быть оценены корректно. Однако, исходя из анализа элементов структуры высших порядков, можно утверждать, что исходный внутренний диаметр этих полых структурных элементов СТ в отдельных случаях мог достигать 0,2—0,3 мм, а исходная форма в позиции in situ, наиболее вероятно, сходна с резко удлиненными карманами, а не с трубками. Тем не менее частично замкнутый характер этих образований с протяженным изолированным пространством внутри них не вызывает сомнений, так как при наблюдении в условиях низкого вакуума в камере микроскопа они были способны частично сохранять влагу в своем остаточном внутреннем просвете. Качественный химический микроанализ ограничивающих тяжи мембран косвенно указывает на обилие серосодержащих (S>0,3%вес) структурных белков в их строении. Толщина мембран (стенок трубчатого тяжа) может быть примерно оценена как 50—100 нм, что меньше половины длины волны света видимого диапазона, и это, вероятно, препятствует возможности наблюдать эти мембраны методами оптической микроскопии.
Второй порядок — веретенообразные полости в продольной структуре тяжей, т.е. зоны сохранившегося в процессе пробоподготовки остаточного просвета исходно полого гиалоидного тяжа. Их вероятное происхождение является одним из немногих артефактов наблюдения. Тем не менее описание именно этих структур дает возможность реконструкции исходной морфологии самих тяжей. Возникшие полости можно условно разделить на два подтипа. Первый подтип образовался в связи с тем, что спадающаяся при вытягивании структура поддержана изнутри твердыми форменными элементами, преимущественно АТ (см. представленное далее описание структур высших порядков), а второй подтип сформировался за счет гидростатической поддержки внутреннего просвета каплей электролита, сконцентрировавшегося в момент высыхания образца. В последнем случае помимо АТ эти полости вмещают раскристаллизованные минеральные компоненты электролита, а в отдельных полостях наблюдаются остатки концентрированной жидкости, видимые в обратно-рассеянных электронах.
На момент наблюдения гиалоидные тяжи и веретенообразные полости максимально распластаны по поверхности углеродной ленты. Часто их внешние границы в проекции изображения визуализировали по потере характерного для адгезивной ленты паттерна (рис. 3).
Рис. 3. Изображение, полученное с помощью сканирующей электронной микроскопии, участка изолированного гиалоидного тяжа стекловидного тела.
Точками маркированы внешние границы спавшейся в условиях низкого вакуума трубчатой структуры, внутри которой продольно располагаются включения астероидных тел. Масштабный отрезок — 100 мкм.
Третий порядок — твердые форменные элементы внутри полых тяжей с определенной закономерностью их взаимного расположения с преобладанием АТ и их агрегатов наряду с петрифицированными эритроцитами, оскольчатыми массами фосфата кальция и раскристаллизованными минеральными компонентами электролитов, упомянутых выше. На наш взгляд, наиболее важным наблюдением является то, что во всех проанализированных образцах разные формы наличия фосфата кальция СТ обнаруживаются только внутри полостей гиалоидных тяжей. При этом имеет место определенная зависимость: чем больше размер веретенообразной полости, тем многообразнее форменные элементы, формирующие структуру третьего порядка.
Пространственное взаимное расположение твердых форменных элементов внутри гиалоидного тяжа весьма нерегулярно. Для АТ характерно как одиночное расположение, так и формирование компактных разномерных агрегатов. Размеры индивидуальных АТ и их связь с расстоянием до центра ближайшей более крупной частицы показаны на рис. 4. Мелкие АТ, как правило, являются сближенными сателлитами более крупных индивидов, что, скорее всего, говорит о многократном зарождении этих объектов в благоприятных локальных условиях.
Рис. 4. Размеры индивидуальных астероидных тел и связь диаметра индивидуальной частицы с расстоянием до центра ближайшей более крупной частицы.
АТ — астероидное тело.
Четвертый порядок — элементы внутреннего строения АТ. Следует отметить, что все обнаруженные АТ обладали сходными чертами строения, независимо от размера и взаимного положения.
Расшифровка структуры астероидных тел на основе изображений, полученных с помощью сканирующей электронной микроскопии в разных режимах, представлена на рис. 5.
Рис. 5. Расшифровка структуры астероидных тел на основе изображений, полученных с помощью сканирующей электронной микроскопии в разных режимах (а, б, в). Масштабный отрезок — 10 мкм. Модель агрегата сферолитов, построенная на основе данных визуализации и химического микроанализа (г).
Объяснения в тексте.
а — изображение, полученное в режиме детекции вторичных электронов при пониженном ускоряющем напряжении (5кВ, SE, EP=70 Па); б — изображение, полученное при высоком ускоряющем напряжении (20кВ, SE, EP=70 Па); в — изображение, полученное при оценке плотности обратного рассеяния электронов при высоком ускоряющем напряжении (20кВ, BSE, EP=70 Па); г — 1 — дикальциевый фосфат дигидрат (ДКФД), 2 — органический матрикс, 3 — кристаллы галита (NaCl), 4 — окутывающая кристаллы сферолитов белковая мембрана.
Исследование на низких ускоряющих напряжениях детально раскрывает микротопографию облекающей АТ мембраны — внешней оболочки гиалоидного тяжа (рис. 5, а). Хорошо видно, что мембрана вне АТ имеет ровную поверхность, но при плотном контакте с АТ начинает «подчиняться» ее микроскульптуре, подчеркивая выступающие из сферических тел пластинчатые кристаллы. Это наблюдение позволяет косвенно говорить о радиально-лучистом строении кристаллического агрегата, являющегося основой АТ (рис. 5, г, выделено оранжевым цветом). Химический микроанализ полностью подтверждает такую трактовку. Преобладающий в составе АТ минеральный компонент — дикальциевый фосфат дигидрат (ДКФД) при раскристаллизации склонен образовывать аналогичные сферолиты радиально-лучистой структуры.
Изображения, полученные во вторичных электронах при повышенных ускоряющих напряжениях, позволяют оценить генеральную форму АТ без учета тонких объектов — перекрывающей белковой мембраны и тонких окончаний пластинчатых кристаллов ДКФД (см. рис. 5, б). При исключении ставших «прозрачными» при высоких ускоряющих напряжениях тонких окончаний пластинчатых кристаллов АТ имеет относительно гладкую шаровидную поверхность, образованную органическими соединениями (см. рис. 5, г, выделено голубым цветом).
Матрикс из органических соединений, заполняющий пространство между кристаллами ДКФД в теле радиально-лучистого агрегата, хорошо виден на изображении в обратно-рассеянных электронах (рис. 5, в). На этом типе сканограмм органические соединения во внутренней структуре АТ выглядят темными, а минеральные — светлыми. Помимо ДКФД, по данным химического микроанализа, на поверхности АТ иногда можно наблюдать кристаллы NaCl, образовавшиеся в процессе высыхания образца (см. рис. 5, г, выделено зеленым цветом).
Следует отметить, что помимо описанных форменных элементов внутреннего наполнения полых структур во всех образцах с помощью СЭМ и химического микроанализа обнаружены петрифицированные эритроциты (рис. 6).
Рис. 6. Изображение петрифицированных эритроцитов (а) и характеристический рентгеновский спектр, показывающий значительную долю фосфата кальция в составе эритроцита (б).
Точка анализа указана стрелкой на изображении а.
Ранее проведенные исследования по изучению состояния СТ при АГ в основном сосредоточены на вопросе анализа его структуры, а также биохимического и элементного состава АТ. Можно предположить, что тесная связь волокон СТ с отдельными включениями, а также их скоплениями различной величины является постоянной характеристикой основных морфологических проявлений АГ. Подобный эффект, по всей видимости, обусловливает степень распространения локальных скоплений АТ в общей массе гиалоидного каркаса СТ. Однако использование стандартных методов подготовки и структурного анализа высокогидратированных объектов, к которым относится и СТ, может сопровождаться возникновением значительных деформационных артефактов, затрудняющих полноценную расшифровку их строения.
Апробированный в данном исследовании оригинальный способ пробоподготовки образцов СТ для СЭМ ограничивает искажения на уровне тонкой структуры. В свою очередь, это позволило не только проанализировать состав и строение АТ, но и расшифровать их локализацию относительно биохимически изолированных участков СТ, ограниченных протяженными трубчатыми структурами — гиалоидными тяжами.
В результате впервые на основе условных четырех порядков предложена генерализованная иерархия различных структур АТ, доступных для наблюдения после подготовки образцов СТ предлагаемым методом: непосредственно трубчатый тяж (I), неоднородности в его продольной структуре (II), взаимное расположение форменных элементов внутри просвета тяжа (III) и регулярная внутренняя структура (IV) (см. рис. 2).
Одним из наиболее важных наблюдений стала исключительная роль протяженных изолированных трубчатых структур в формировании патологического выпадения фосфата кальция в СТ. Все новообразованные и модифицированные форменные элементы, в составе которых выявлен минеральный фосфат кальция, обнаружены только внутри трубчатых структур. Это позволяет утверждать, что в СТ есть зоны с обособленными биохимическими условиями и локальным характером протекающих в них процессов. Возможно, это наблюдение позволит в дальнейшем объяснить особенности метаболических процессов в СТ и направлений физической миграции веществ в его объеме.
В настоящей работе не рассматривается патогенез возникновения АТ, до сих пор остающийся предметом дискуссий. Однако выявленный факт регулярного присутствия петрифицированных эритроцитов среди прочих форменных элементов позволяет предположить наличие связи между образованием АТ и регионарными сосудистыми нарушениями. При этом процесс вне зависимости от его характера ограничивается внутренним просветом гиалоидных тяжей. Нельзя исключить, что наличие петрифицированных эритроцитов не отмечено в ранее проведенных исследованиях вследствие того, что эти элементы неотличимы от АТ при визуализации на основе ультразвуковых и оптических методов. Полноценная диагностика может быть проведена только на сканирующем электронном микроскопе, снабженном системой химического микроанализа. Без химической верификации на СЭМ-изображениях эритроциты могут быть распознаны как элементы крови, случайно включенные в пробу.
Толщина ограничивающих белковых мембран, установленная по данным электронной микроскопии, практически исключает возможность их визуализации оптическими методами in vivo. В этом случае видимые скопления АТ можно рассматривать как маркер тонких структур, ограниченных белковыми мембранами.
Заключение
Проведенные исследования позволили идентифицировать различные виды локальных скоплений минеральных элементов в стекловидном теле при астероидном гиалозе, большинство из которых может быть обозначено как астероидные тела — множественные сложные образования округлой формы, состоящие из агрегатов игольчатых кристаллов радиально-лучистого строения. Разработанный алгоритм, включающий интраоперационный забор стекловидного тела в условиях его минимального гидратирования и специальную методику пробоподготовки образцов для сканирующей электронной микроскопии и химического микроанализа, обеспечивает возможность оценки прижизненного морфологического состояния гиалоидных структурных элементов стекловидного тела. При этом астероидные тела можно рассматривать как маркеры сложновизуализируемых структур стекловидного тела.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: Харлап С.И., Сургуч В.К., Новиков И.А.
Сбор и обработка материала: Сургуч В.К., Новиков И.А., Федоров А.А.
Статистический анализ данных: Чижонкова Е.А.
Написание текста: Харлап С.И., Новиков И.А., Аветисов С.Э., Мирошник Н.В.
Редактирование: Аветисов С.Э., Новиков И.А., Мирошник Н.В.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.