Мелфалан при лечении пролиферативной витреоретинопатии (экспериментальное исследование)

Пролиферативная витреоретинопатия (ПВР) — сложное гетерогенное заболевание, характеризующееся формированием мембранных образований на внутренней поверхности сетчатки. Особенностью этих мембран является наличие у них контрактильных свойств, приводящих к тракционной отслойке сетчатки с потерей зрительных функций. ПВР, будучи многофакторным патологическим процессом, чаще всего возникает как осложнение при таких клинических состояниях, как регматогенная и травматическая отслойка сетчатки. Развитие ПВР после хирургического лечения отслойки сетчатки вызывает рецидивы заболевания — неприлегание сетчатки [1].

Направленность медикаментозного воздействия связана со стадийностью ПВР. Многочисленные препараты, протестированные на моделях животных и на клеточных культурах, демонстрируют свою эффективность [2], однако многие из них имеют тяжелые побочные эффекты, и лишь некоторые используются в клинической практике. Сложность заключается и в достижении терапевтической концентрации при их системном введении. Введение препаратов интравитреально не используется в клинической практике, так как существует концепция о токсическом влиянии в отношении сетчатки, а информации об интраокулярной фармакокинетике недостаточно [3, 4]. Сведения о цитопатогенезе ПВР ориентируют офтальмологов на использование патогенетической терапии на различных стадиях заболевания: стадии воспаления-альтерации, пролиферативной стадии и стадии рубцевания.

Были протестированы многочисленные препараты патогенетически ориентированного медикаментозного лечения ПВР: противовоспалительные агенты, антипролиферативные препараты, антиоксиданты. На стадии пролиферации заболевания широко изучаются применение и эффективность использования антипролиферативных препаратов, ингибирующих клеточный цикл и клеточную пролиферацию: 5-фторурацил, даунорубицин, таксол, колхицин, ретиноевая кислота, рибозимы, этопозид и др. [5—12].

Наиболее изученным препаратом для лечения ПВР является 5-фторурацил. Препарат действует на синтез ДНК, предотвращая образование тимидина. H. Borhani и соавт. [13] оценивали на модели ПВР у кроликов замедленное высвобождение препарата, заключенного в биоустройство, введенное интравитреально в концентрациях 0,5 и 1 мг. Исследования показали эффективность лечебного действия 5-фторурацила на развитие ПВР, а при большей концентрации препарата авторы отмечали предотвращение развития тракционной отслойки сетчатки в 100% случаев.

Применению 5-фторурацила 200 мг/мл и низкомолекулярного гепарина 5 ЕД/мл, добавленных в ирригационный раствор во время витреоретинальной операции, были посвящены три рандомизированных контролируемых клинических исследования [14—18].

Проведенные экспериментальные и клинические исследования по применению антипролиферативных препаратов в качестве местной и системной терапии при развитии ПВР показали наличие токсических свойств препаратов и недостаточную ингибицию пролиферативных процессов, что вызвало необходимость поиска новых лекарственных средств. Другой проблемой в лечении ПВР является способ доставки антипролиферативного препарата к патологическому очагу в заднем отрезке глаза. Наиболее адекватным способом, учитывая наличие гематоретинального барьера, является интравитреальный способ введения, позволяющий создавать терапевтическую концентрацию лекарственного вещества в заднем отрезке глаза, минимизируя системные побочные эффекты, наблюдаемые при парентеральном и пероральном введении.

В связи с этим большой интерес представляет препарат мелфалан, используемый в онкологической практике. Мелфалан является производным азотистого иприта, относится к бифункциональным алкилирующим соединениям циклонеспецифического действия. Препарат обладает противоопухолевым, алкилирующим, цитостатическим и иммунодепрессивным действием и вызывает повреждение макромолекулы ДНК, нарушает ее полимеризацию и редупликацию, способствует образованию дефектных форм ДНК и РНК и останавливает синтез белка. Препарат активен в отношении покоящихся и активно делящихся опухолевых клеток. Наиболее чувствительными фазами митотического цикла являются конец фазы G2 и переход G2-M.

Мелфалан применяли в офтальмоонкологии при лечении ретинобластомы в качестве препарата для внутриартериальной химиотерапии дополнительно к внутривенной химиотерапии, однако, несмотря на положительный эффект — резорбцию опухоли, появлялись рецидивы в виде отсевов в стекловидном теле. Введение препарата интравитреально позволило добиться полной резорбции отсевов [19—22]. В настоящее время в американских и многих европейских клиниках интравитреальное введение мелфалана входит в протокол лечения детей с двусторонней ретинобластомой [23]. Авторы отмечают, что системная химиотерапия совместно с интравитреальным введением мелфалана в дозе 20—30 мкг в 0,1 мл позволяет сохранить ребенку не только глаз, но и зрение. Но при интравитреальном введении мелфалан оказывает токсическое действние на сетчатку в дозах 20—30 мкг/мл, в результате чего развиваются атрофические процессы в сетчатке [24].

Актуальным оказалось использование этого препарата при лечении пролиферативных процессов глаза неонкологического генеза. Однако, учитывая токсические свойства мелфалана, необходимо было определить безопасную терапевтическую концентрацию препарата. Нами проведены экспериментально-морфологические исследования различных концентраций мелфалана (0,02; 0,01; 0,0075; 0,005 мг) [25]. Исследования показали появление деструктивных процессов в ретинальном пигментном эпителии (РПЭ) и атрофических процессов в наружных ядерном и плексиформных слоях сетчатки, имеющих дозозависимый характер при использовании мелфалана в дозах 0,02 и 0,01 мг. Мелфалан в дозе 0,005 мг, введенный однократно интравитреально, обладал минимальной ретинотоксичностью.

Цель исследования — изучение эффективности препарата мелфалан в качестве антипролиферативного средства при лечении пролиферативного процесса неонкологического генеза — экспериментальной ПВР.

Материалом для исследования модели послужили 12 кроликов (24 глаза) породы шиншилла массой 2,5—3,0 кг, у которых моделировали ПВР на обоих глазах путем интравитреального введения через плоскую часть цилиарного тела инсулиновой иглой 32G культуры клеток гетерогенных активированных фибробластов 200 тыс. клеток в 0,1 мл из коллекции клеточных культур ИБР РАН [26]. Модель экспериментальной ПВР была разработана совместно с Институтом биологии развития, где проводилась работа по приготовлению культуры фибробластов человека. Развитие ПВР в эксперименте происходило через 1 мес и имело место в 100% случаев, оно было идентифицировано морфологически с появлением эпиретинальных мембран (ЭРМ) на внутренней поверхности сетчатки. Эволюция ЭРМ включала основные стадии ее развития, от клеточно-волокнистой до фиброзной, и модель может быть использована для объективной оценки эффективности антипролиферативных препаратов.

Лечение экспериментальной ПВР проводили через 1 день после моделирования процесса. Животные были разделены на две группы. В 1-й группе животных (6 кроликов, 6 глаз) в правый глаз однократно интравитреально инсулиновой иглой 32G через плоскую часть цилиарного тела вводили мелфалан в концентрации 0,02 мг в 0,1 мл. Во 2-й группе животных (6 кроликов, 6 глаз) в правый глаз однократно интравитреально инсулиновой иглой 32G через плоскую часть цилиарного тела вводили мелфалан в концентрации 0,005 мг в 0,1 мл. Концентрация мелфалана 0,02 мг применяется онкологами для интравитреального введения при лечении ретинобластомы. Учитывая осложнения при интравитреальном введении препарата в данной концентрации, мы использовали концентрацию мелфалана 0,005 мг, которая изучена в эксперименте как наиболее безопасная [25]. Левый глаз у всех животных оставляли контрольным (без лечения). Животных наблюдали в течение 1 мес с использованием методов офтальмологического исследования — биомикроскопии и офтальмоскопии. После вывода животных из эксперимента глаза энуклеировали, фиксировали в 10% буферированном формалине и подвергали стандартной гистологической обработке. Микроскопическое исследование проводили с помощью микроскопической системы Leica (Leica Microsystems, Германия) со встроенной цифровой камерой при увеличении 200—600.

В группе контроля в левых глазах 12 кроликов наблюдалось появление ЭРМ в виде волокнистых структур на внутренней поверхности сетчатки (рис. 1).

Рис. 1. ЭРМ (ПВР) на внутренней поверхности сетчатки при экспериментальном моделировании без лечения.

Здесь и на рис. 2—7 окраска гематоксилином и эозином. Ув. 200.

При исследовании 1-й группы (6 кроликов, 12 глаз) в 6 глазах, получавших лечение, отмечалось отсутствие ЭРМ. Однако доминирующими были атрофические изменения сетчатки, которые имели различную выраженность в виде преимущественно двух типов изменений.

Очаги первого типа характеризовались поражением всех слоев сетчатки с глиальным ее замещением. Отмечалось полное разрушение сетчатки, утрата ее слоистости. Сетчатка превращалась в глиальную ткань, спаянную с атрофичной хориоидеей (рис. 2).

Рис. 2. Эксперимент, 1-я группа.

Атрофический очаг сетчатки первого типа: глиальное перерождение сетчатки. Ув. 400.

Очаги второго типа характеризовались истончением сетчатки с исчезновением фоторецепторного слоя (слоя палочек и колбочек, наружного ядерного и плексиформного слоев), сохранялся лишь редуцированный внутренний ядерный слой (рис. 3).

Рис. 3. Эксперимент, 1-я группа.

Атрофический очаг сетчатки второго типа. Отсутствие фоторецепторного слоя сетчатки. Атрофия внутреннего зернистого слоя. Ув. 400.

Во всех глазах также диагностировались выраженные деструктивные процессы в РПЭ: диссоциация клеток, их миграция, оголение мембраны Бруха (рис. 4).

Рис. 4. Эксперимент, 1-я группа.

Деструкция РПЭ. Миграция клеток и очаги оголения мембраны Бруха. Ув. 400.

При исследовании 2-й группы (6 кроликов, 12 глаз) в 6 глазах, получивших лечение, микроскопически отмечалась полная редукция пролиферативного процесса, сетчатка прилежала и сохраняла свою нормальную структуру (рис. 5).

Рис. 5. Эксперимент, 2-я группа.

Сетчатка после введения 0,005 мг мелфалана имеет нормальное строение: структура сохранена, ПВР отсутствует. Ув. 200.

Грубые атрофические изменения в сетчатке (очаги первого и второго типа) отсутствовали. Однако в 5 глазах отмечались единичные дистрофические очаги, которые мы расценили как очаги третьего типа, которые характеризовались небольшим уменьшением объема наружного ядерного слоя, укорочением палочек и колбочек. При этом отмечалось полное сохранение внутренних слоев сетчатки (рис. 6).

Рис. 6. Эксперимент, 2-я группа.

Атрофический очаг сетчатки третьего типа. Уменьшение объема наружного ядерного слоя. Укорочение палочек и колбочек. Ув. 200.

Отмечались единичные деструктивные изменения в РПЭ с диссоциацией РПЭ и оголением мембраны Бруха (рис. 7).

Рис. 7. Эксперимент, 2-я группа.

Начальные изменения РПЭ: диссоциация клеток в пласте. Ув.400.

Резюмируя полученные в эксперименте результаты, можно сделать заключение, что мелфалан является эффективным антипролиферативным препаратом, способствующим ингибиции пролиферативного процесса при лечении ПВР. Вместе с тем препарат обладает токсическими свойствами. Выраженность токсических осложнений зависит от концентрации препарата. Высокая концентрация, применяемая в онкологической практике (0,02 мг), вызывает распространенные атрофические изменения в сетчатке. В основе токсического действия, как показал анализ морфологического исследования, лежала атрофия преимущественно наружных слоев сетчатки: слоя палочек и колбочек, наружного ядерного и наружного плексиформного слоев, т.е. поражался фоторецепторный слой сетчатки. Известно, что функция фоторецепторного слоя тесно связана с метаболизмом РПЭ, структура которого значительно изменяется при интравитреальном введении мелфалана. Отмечались диссоциация клеток в пласте, их миграция с оголением мембраны Бруха. Фармакокинетические исследования показали, что мелфалан накапливался в РПЭ в большей концентрации, чем в сетчатке [27, 28]. Такая «тропность» мелфалана к РПЭ объясняет возникновение осложнений, связанных с изменением РПЭ и последующих нарушений функций фоторецепторов, ведущих к развитию атрофического процесса сетчатки, т. е. РПЭ является мишенью токсического действия мелфалана, выраженность которого зависела от концентрации препарата. Применение в эксперименте концентрации мелфалана 0,005 мг вызывало положительный лечебный антипролиферативный эффект на модели ПВР: не наблюдалось возникновение новообразованных эпиретинальных мембран на внутренней поверхности сетчатки, отсутствовало развитие тракционной отслойки сетчатки. Изменения РПЭ носили ограниченный характер с небольшой диссоциацией клеток, а атрофические процессы в сетчатке имели начальный характер и могут быть обратимыми.

Проведенные экспериментальные исследования доказали эффективность антипролиферативного действия препарата мелфалан при однократном интравитреальном введении в концентрации 0,005 мг в 0,1 мл при лечении экспериментальной ПВР [29].

Использование эффективного антипролиферативного препарата во время витреоретинальной хирургии позволит снизить активность ПВР при дистрофической и травматической отслойке сетчатки, а также склерохориоретинального рубцевания при травме заднего отрезка глаза, что повысит эффективность хирургического лечения и снизит число повторных хирургических вмешательств.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: И. Х.-М.

Сбор и обработка материалы: Н.Л., И.Х.-М., Е.А.

Написание текста: И. Х.-М., Н.Л.

Редактирование: И. Х.-М., Е.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.